Методическая статья

Хирургические процедуры для резекции мыши Ребро: Модель для крупномасштабных длинных костей Ремонт

DOI:

10.3791/52375

⸱

21 января 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая цель этой процедуры - успешно удалить часть кости из ребра мыши. Процедура была разработана в качестве модели для изучения крупномасштабного восстановления длинных костей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол вводит исследователей к новой модели для широкомасштабного восстановления костей с использованием ребро мыши. Процедура подробно следующий: Получение животного к операции, открывая грудной стенки тела, подвергая желаемого ребро от окружающих межреберные мышцы, вырезая нужную часть ребра, не вызывая пневмоторакс, и закрытие разрезы. По сравнению с костями аппендикулярного скелета, ребра очень доступным. Кроме того, ни один внутренний или внешний фиксатор не является необходимым, так как соседние ребра обеспечивают естественную фиксацию. Хирургия использует имеющиеся в запасы, является простым учиться и хорошо переносится животным. Эта процедура может быть осуществлена ​​с или без удаления окружающих надкостницу, и, следовательно, вклад надкостницы к ремонту могут быть оценены. Результаты показывают, что если надкостница сохраняется, надежный ремонт происходит в 1 - 2 месяца. Мы ожидаем, что использование этого протокола будетстимулировать исследования в грудной ремонта и что результаты будут способствовать развитию новых путей стимулирования восстановления костей и в других местах по всему телу.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debilitating скелетных травм, хронических остеоартрит, и серьезные проблемы, связанные с реконструктивной хирургии влияние на экономические производительности, семейного благополучия и качества жизни. Хотя небольшие перерывы и поражения может исцелить довольно хорошо, люди не могут восстановить большие дефекты и, следовательно, должны полагаться на восстановительные процедуры для восстановления структуры и функции. Реконструкция может включать аллогенных или heterogeneic трансплантатов, morcellized кости, имплантированные лесов, или отвлечение остеогенез. К сожалению, не только там Устойчивые факторы заболеваемости, связанной с этими препаратами, но оригинальный прочность отремонтированного кости редко достигается. Таким образом, новые клинические подходы.

Один способ развивать инновационные способы лечения сегментарных дефектов является изучение ситуации, в которых крупномасштабное ремонт происходит естественно. Амфибии лихо могут регенерировать скелетных элементов, в то время как млекопитающие считаются ограниченными в гоэто способность. Тем не менее, начиная с начала 20-го века, несколько сообщений о регенерации в организме человека ребра были опубликованы предполагая, что люди не могут быть ограничены 1-4 так. В настоящее время это явление является самым известным пластических хирургов, которые используют ребра материал для челюсти, лица и уха реконструкции, но это не более широко оценили 5. Для того, чтобы изучить этот ремонт более подробно, мы разработали хирургического модель с помощью мыши. Используя этот протокол, исследователи могут определить врожденные факторы, влияющие и использовать эту информацию, чтобы облегчить скелетных исцеление в других местах.

Есть много преимуществ в использовании ребра в качестве модели для изучения скелета ремонт. Во-первых, окружающие ребра обеспечивают естественное фиксатор (по сравнению с резекцией бедренной кости 6,7). Это уменьшает заболеваемость риск внутренних и внешних фиксаторов и упрощает хирургическую процедуру. Во-вторых, тонкие мышечные слои грудной клетки вабудете обеспечивать легкий доступ и отличную видимость, которые делают анализ сопоставимы с удобством свода черепа резекции 8. В-третьих, в отличие от calvariae, которые образуются вследствие Intramembranous окостенения, форма ребер по эндохондральной окостенения и расти в длину с помощью расширения при росте пластин, расположенных на обоих концах центрального диафиза. Таким образом, ремонт ребер могут быть более сравнима с ремонта длинных костей скелета аппендикулярной. Кроме того, мы обнаружили, что по сравнению с бедренной кости, надкостницы ребра толще и может быть более легко манипулировать. Таким образом, исследователи, которые хотят для анализа ремонт кости с целью изучения надкостницы или тестирования клеточной терапии, фармакологические препараты и / или тканей лесов могут найти это хирургический шаблон полезным. В целом, это ребро резекция модель обеспечивает контекст, в котором для изучения природных масштабную ремонт кости у млекопитающих, поскольку таких модель общего пользования в настоящее время не существует.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в соответствии с протоколом животных утвержденным уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) при Университете Южной Калифорнии.

1. Подготовка к операции

  1. Выложите необходимые хирургические инструменты и расходные материалы (стерилизованы, предметы 1 - 18 в списке материалов) и организовать рассекает микроскоп и волоконной оптики транс-осветителя при капюшоном или на столе нисходящего.
  2. Поставьте половозрелых мышь (20 - 30 г, 1 - 3 месяца) в индукции камеры с 4% изофлуран для индукции анестезии.
  3. Подтвердите анестезии с лапой и / или испытания хвост щепотку.
  4. Применять мазь для глаз мыши, чтобы избежать сухость глаза во время операции.
  5. Наведите указатель мыши на столике микроскопа. Наведите в носовом конусе шланга обслуживания и позиционировать в сторону. Обеспечить потепления пакета, примыкающего к животному, чтобы помочь сохранить температуру тела.
    НЕE:. Должность мыши зависит от личных предпочтений и / или беспристрастности хирурга, либо слева или справа от нормально.
  6. Отрегулируйте изофлурана до 2 - 3% для обслуживания, и посмотреть частоту дыхания.
  7. Вводят бупренорфин (0,05 мг / кг) подкожно (боковое фланг ноги) для послеоперационной боли с иглой 25 G. Нога может дергаться, который нормальная реакция.

Разрез 2. Открытие

  1. Обнаружить нужную ребро при пальпации, и очистить площадь волос с бритвой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ребра 8-10 рекомендуются, так как ребра 1-7 ближе к легким и 11-13 значительно короче. Подсчет ребра следует начинать с наиболее ростральной ребра как номер 1.
  2. Подготовьте область с чередующимися повидон-йод и изопропанол (70%), моечные (3x часто рекомендуется используют протоколы животных).
  3. Вырезать 2 см разрез через кожу, непосредственно выше и параллельно желаемой ребра с средних ножницами микрохирургии. Incisе через жиром мышц и жировых отложений.
  4. Поместите все три слоя (кожи, мышц, жира) в втягивающего подвергать хирургическую область, при сведении к минимуму размер разреза.

3. Акцизирование ребра

  1. Разрезать межреберных мышц, покрывающих нужный раздел ребра с 5,0 мм скальпелем. Позиция Этот разрез вокруг 5 мм проксимальнее chondrocostal сустава, так как это, где ребра не так сильно искривлено. Аккуратно отделите мышцу от кости с помощью тоненького кончика пинцета.
  2. Чтобы создать резекции с сохранением надкостницы у животного, прорезать надкостницы, по длине ребра с 5,0 мм скальпелем. Аккуратно отделите надкостницу от основной кости по бокам с помощью тоненького кончика пинцета. Соблюдайте осторожность, так как надкостница очень тонкая и имеет гелеобразную консистенцию.
  3. Затем сделать поперечное сечение кости на одном конце с мелкими микро-ножниц. При необходимости, измерить резекция ссетка в микроскоп или типа правитель колеи. Затем осторожно поднимите кости из надкостницы и сократить другой конец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность. Это самый деликатный шаг, так как подтягивание без вырезания ребро ниже порвет Мембрана и в результате пневмоторакса. Если Мембрана разрывается, это будет легко видно, как внутренняя часть грудной полости станут видимыми.
  4. Если кровотечение происходит в результате разрезания кости, оказывать давление на обрезанный конец с ватным тампоном в течение 4 - 5 сек, чтобы остановить кровотечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях, что кровотечение продолжается, это может быть необходимо остановить и эвтаназии животных, а значительную потерю крови, снижают восстановление (без замены жидкости, максимальный объем крови, который может быть безопасно быть потеряны составляет 10% от общего объема крови или 7,7 -. 8 мкл / г Для 25 г мыши, это эквивалентно примерно 180 - 200 мкл 9).
  5. Сразу же место снятую ребро в4% PFA для последующего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если резекция как кости и надкостницы должна быть проведена, опустить надкостницы разреза и разделения (шаг 3,2). С надкостница очень плотно прикреплена к Мембрана действовать осторожно, дразнить ребро от Мембрана щипцами, чтобы избежать разрыва.

4. Закрытие разреза

  1. Шовный межреберные мышцы поверх надкостницы оставшейся втулки с 9-0 швов (2 нити, как правило, достаточно). Поместите швов прямо над обрезанными концами ребра, чтобы выступать в качестве индикаторов для хирургии месте.
  2. Снимите ретрактор. Шовный лежащего мышцы и жир с 9-0 швов (3 - 4 нити, как правило, достаточно). У мышей с особо толстыми слоями мышц и / или жира, шов каждый слой отдельно (например, 1 слой швов для мышечного слоя и 1 слой швов для жирового слоя).
  3. Закрытькожа с 7-0 швов (4 - 5 швы, как правило, достаточно).
  4. Безопасный разрез с шовного клея, зажимая края вместе с большими щипцами.
  5. Медленно отучить мышь за пределы ИФ сначала приспособиться к 1% в течение нескольких минут, а затем выключите.
  6. Наведите под инфракрасной лампой и оставить до сознание не восстанавливается, 5 - 10 мин. После сознание восстанавливается и в течение периода заживления, мышь должна двигаться и передвигаться нормально и не проявляют никаких признаков бедствия.

5. Восстановление и Анализ

  1. Послеоперационного обезболивания в том числе администрации бупренорфина в устной форме желатиновой на 0,5 мг / кг каждые 12 ч в течение 48 ч. Пероральное введение не требует сдерживания животное, которое может вызвать боль в грудной области.
  2. Поддержание мышь в клетке со свободным доступом к пище и воде в течение периода заживления. После разрез сухой, самки могут быть совместно размещены в то время мужчиныА должен оставаться в изоляции, чтобы предотвратить боевые действия.
  3. После периода заживления, следуйте утвержденным Порядком эвтаназии. Удалить грудную клетку для фиксации и анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные, как правило, быстро оправиться от этой процедуры, разрез заживает хорошо, и животные обладают нормальное поведение. Процедура использует коммерчески доступные материалы и после тренировки, может быть завершена в соответствии с 1 ч. Перед использованием этой процедуры, чтобы генерировать экспериментальные данные, важно, чтобы проанализировать резекции в день 0 момент времени, чтобы определить, есть ли какие-либо крупные костные фрагменты могут оставаться в зоне резекции. Один из способов оценки надлежащей проце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При первом изучении этого протокола, определения, где найти начальный разрез может быть сложной задачей. Тем не менее, практика по эвтаназии мышей помогает хирург узнать, где разместить начальную разрез и выставить нужный ребро быть Резецированная. Работа на трупах также улучшает навыки тонкой моторные, необходимые для удаления реберную часть с или без надкостницы. Кроме того, кто-то новый с этой процедурой может найти манипуляции мелкие инструменты и тонкие швы, чтобы быть затруднено. В то время как связывание с избыто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников лаборатории Мариани за критическое прочтение рукописи. Нашими источниками финансирования были: стипендия Baxter Medical Scholar Research Fellowship (для M.K.S.), стипендии для студентов USC и стипендии проректора, декана Джоан М. Шеффер, и стипендии Rose Hills (для M.K.S.). Мы также признательны за стипендию CIRM BRIDGES через Городской колледж Пасадены. а также Фонд исследований и инноваций имени Джеймса Х. Зумберге, Инициатива регенеративной медицины Университета Южной Калифорнии и NIH NIAMS под номером R21AR064462 (для F.V.M.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микродиссекционные ножницы среднего размера (Vannas-Tü Пружинные ножницы bingen 5 мм)Fine Science Tools15003-08
Тонкие ножницы для микродиссекции (пружинные ножницы Vannas - режущая кромка 2 мм)Fine Science Tools15000-04изогнутый наконечник полезен
микроскальпель 5,0 ммFine Science Tools10315-12другие тонкие скальпели могут быть заменены
щипцами Dumont 55Fine Science Tools11295-51
Ретрактор Fine Science Tools17004-05регулировка удобна
микроиглодержателямиFine Science Tools12060-01
9.0 нейлоновые шовные материалы (Ethilon), точка конуса лучше всегоEthicon2819G или аналогичнаяточка конуса лучше всего но обратный рез также хорош
7.0 пролен шовные материалы (Prolene)Ethicon8700H или аналогичный6-0 тоже можно использовать, острие иглы может варьироваться
Большие щипцы (щипцы Адсона)Fine Science Tools11006-12других брендов мелкодисперсная
смазка глазной мази (Akwa Tears)Akorn17478-062-35
Шовный клей (GLUture Topical Tissue Adhesive)Abbot32046-01имеет отличное время работы
ShaverWahl9918-6171 или аналогичная
лампа Clamp lampZoo MedLF-5
Инфракрасная лампа, 75 ВтZooMed RS-75
RC2 система анестезии для грызуновVetEquip 922100
IsoFlo (Изофлуран)Abbot05260-05
Бупренорфин (Бупренекс)Reckitt Benckiser12496-0757-1
BetadinePurdue Frederick67618015017
ароматизированный желатин, малиновоежеле Jell-OB000E1FYL0твердый, до консистенции 'джигглеров'

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Philip, S. J., Kumar, R. J., Menon, K. V. Morphological study of rib regeneration following costectomy in adolescent idiopathic scoliosis. Eur Spine J. 14 (8), 772-776 (2005).
  2. Munro, I. R., Guyuron, B. Split-rib cranioplasty. Ann Plast Surg. 7 (5), 341-346 (1981).
  3. Taggard, D. A., Menezes, A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children. Pediatric neurosurgery. 34 (3), 149-155 (2001).
  4. Head, J. R. Prevention of Regeneration fo the Ribs: A problem in thoracic surgery. Archives of Surgery. 14 (6), 1215-1221 (1927).
  5. Kawanabe, Y., Nagata, S. A new method of costal cartilage harvest for total auricular reconstruction: part I. Avoidance and prevention of intraoperative and postoperative complications and problems. Plastic and reconstructive surgery. 117 (6), 2011-2018 (2006).
  6. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 21 (4), 685-690 (2003).
  7. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4. S103-S109 (2009).
  8. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and reconstructive surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  9. Ask the Vet. JAX NOTES. 499, Available from: http://jaxmice.jax.org/jaxnotes/archive/499c.html (2005).
  10. Flecknell, P. A., Roughan, J. V., Stewart, R. Use of oral buprenorphine ('buprenorphine jello') for postoperative analgesia in rats--a clinical trial. Laboratory animals. 33 (2), 169-174 (1999).
  11. Rigueur, D., Lyons, K. M. Whole-mount skeletal staining. Methods in molecular biology. 1130, 113-121 (2014).
  12. Evans, D. J. Contribution of somitic cells to the avian ribs. Developmental biology. 256 (1), 114-126 (2003).
  13. Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130 (17), 4123-4133 (2003).
  14. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 23 (6), 1300-1307 (2005).
  15. Zilberman, Y., Gafni, Y., Pelled, G., Gazit, Z., Gazit, D. Bioluminescent imaging in bone. Methods in molecular biology. 455, 261-272 (2008).
  16. Pelled, G., Gazit, D. Imaging using osteocalcin-luciferase. Journal of musculoskeletal. 4 (4), 362-363 (2004).
  17. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies--strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  18. Srour, M. K., et al. Natural large-scale regeneration of rib cartilage in a mouse. J. Bone Miner. , (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи