Методическая статья

Лицевого нерва аксотомии у мышей: модель для изучения двигательных нейронов ответ на повреждение

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52382

⸱

23 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anatomy and Cell Biology, Indiana University School of Medicine, 2Research and Development Services, Richard L. Roudebush VA Medical Center, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Illinois, Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем хирургический протокол, подробно описывающий, как выполнить разрезание или раздавливание аксотомии лицевого нерва у мыши. Аксотомия лицевого нерва может быть использована для изучения физиологической реакции на повреждение нерва и тестирования терапевтических методов.

Аннотация

Цель этого хирургического протокола является выявление лицевого нерва, который иннервирует лицевой мускулатуры, при выходе ее из stylomastoid отверстия и вырезан или раздавить его, чтобы вызвать повреждение периферического нерва. Преимущества этой операции являются его простота, высокая воспроизводимость, а также отсутствие влияния на жизненно важных функций или подвижности из последующего паралич лицевого нерва, что приводит к относительно мягкой хирургического результата по сравнению с другими моделей повреждения нерва. Одним из основных преимуществ использования черепной модель повреждения нерва является то, что мотонейроны находятся в относительно однородной популяции в лицевой двигательной ядра в моста, что упрощает изучение клеточных тел мотонейронов. Из-за симметричной природы лицевого нерва иннервации и отсутствие перекрестных помех между лицевыми ядер двигательных операция может быть выполнена в одностороннем порядке unaxotomized сторона, выступающей в качестве парного внутреннего контроля. Разнообразие анализов могут быть выполнены в послеоперационном периоде, чтобы ословš физиологическая реакция, детали которого выходит за рамки данной статьи. Например, восстановление мышечной функции может служить маркером для поведенческого реиннервации, или мотонейроны можно количественно измерить выживаемость клеток. Кроме того, мотонейроны могут быть точно получены с помощью лазерного микродиссекции для молекулярного анализа. Поскольку лицевой нерв аксотомии является минимально инвазивной и хорошо переносимым, оно может быть использовано на разнообразных генетически модифицированных мышей. Кроме того, эта операция модель может быть использована для анализа эффективности периферических лечения повреждений нервов. Травмы лицевого нерва предоставляет средства для исследования не только двигательные нейроны, но и ответы центральной и периферической глии микросреды, иммунной системы, и целевой мускулатуры. Лица модели повреждения нерва широко принятой моделью периферических нервов травмы, которая служит в качестве мощного инструмента для изучения повреждение нерва и регенерации.

Введение

Существует множество периферийных модели повреждения нерва, но тот, который выделяется для изучения двигательных нейронов является лицевая модель нерв аксотомии. Лицевого нерва, также известный как черепно-мозговых нервов VII, берет свое начало в Понс и иннервирует мышцы мимики 1,2. В этом хирургического протокола, лицевой нерв подвергается при выходе ее из stylomastoid отверстия и либо сократить или дробленый. Тяжесть травмы нерва могут быть классифицированы в соответствии с Сандерленд 3 классификаций, которые отличает эту травму, основанную на сохранности аксонов, Эндоневрий, Периневрий и эпиневрии, которые соединительной слои ткани, последовательно обернуть вокруг аксонов пучков. В размозжение (Axonotmesis), аксоны разорваны, но Периневрий и Эпиневрий сохраняются. Полное восстановление функций от лицевого нерва давка встречается примерно в 11 дней, потому что нетронутыми оболочки нервов служит каналом, в рамках которой аксоны вырастить 4,5. НаС другой стороны, в разрезе травмы (neurotmesis), аксоны и все три слоя соединительной ткани разорваны, и весь дистальный нерв должен вырастить, чтобы восстановить мускулатуру иннервацию. Хирургическое повторного подключения эпиневрии часто выполняется у больных людей с пересечения нерва травм, однако результаты восстановления редко оптимальным. Требуется дальнейшее изучение, чтобы понять, почему нерв не удается вырастить его целей, и что методы лечения могут быть использованы для улучшения и ускорения процесс регенерации.

Есть много преимуществ для изучения повреждение нерва с помощью лицевой модель нерв аксотомии. Во-первых, лица процедура нерва аксотомии быстро, легко и надежно воспроизводимое; и результирующая паралича лицевых мышц не влияет на жизненно важные функции и хорошо переносится животным. Потому что это черепной модель повреждение нерва, изучая мотонейроного клеточных тел упрощается, потому что мотонейроны находятся в относительно однородной популяции в гок двигателю лица ядро ​​в мосте. Население действительно отличается на основе субъядерной рисунка в лице ядра двигателя, так как есть семь subnuclei каждый конкретный чтобы иннервирующих определенную группу мышц, так субъядерных различия в ответ на аксотомии может повлиять на результаты 2,6,7.

Основное преимущество лицевого модели повреждения нерва является то, что unaxotomized сторона может служить в паре внутреннего контроля, потому что нерв иннервации очень симметричны и нет перекрестных помех между лицевыми моторных ядер 8. Еще одним преимуществом использования этого хирургического метода является отсутствие прямого травмы ЦНС или нарушению гематоэнцефалического барьера 9. Такие осложнения, как кровотечения и инфекции являются редкими с этой процедурой.

Разнообразие анализов могут быть выполнены, чтобы оценить физиологическую реакцию на повреждение нерва. Восстановление моргание глазом рефлекса и усов активности может быть использован в качестве поведенческогомера функционального восстановления 10,11. Видеозапись вибриссы деятельности в настоящее время наиболее эффективным методом для обнаружения восстановление лицевого нерва иннервации 12,13. После эвтаназии, гистологический анализ ствола мозга может быть выполнена на мотонейронов клеточных тел в ядре лицевого двигателя. Лица ядро двигателя подразделяется на семь subnuclei, каждый специфическими для определенных мышц лица, что позволяет для дифференциальной Исследование реакций на травму 2,6. Мотонейроны лица могут быть подсчитаны количественно выживаемость клеток, или иммуногистохимии могут быть использованы для идентификации биомаркеров и конкретные клеточные популяции 14. Ядро лицевого двигателя может быть точно микродиссекции с помощью лазерного захвата для молекулярного анализа клеточного ответа на повреждение нерва 15,16. Воздействие лицевого нерва аксотомии могут быть проанализированы в моторной коре 17,18. Кроме того, нерв может быть расчленена изучать валлеровский дегенерации 19 илиАксон регенерации 20, и мышцы могут быть удалены, чтобы изучить нервно-мышечных синапсах 21. Лицевого нерва аксотомии также может быть использован для изучения прилагаемой центральные и периферические клетки 22 глиальные, целевой мускулатуру 21, и иммунная система реагирования 23. Хотя многое уже сделано в изучении лицевого нерва аксотомии модель 24, дальнейшее изучение повреждения периферического нерва требуется, потому что повреждение нерва является существенной проблемой для пациентов и текущие методы лечения не для получения оптимальных результатов. Эта модель является мощным инструментом для изучения физиологической реакции на повреждение нерва и анализа эффективности регенерации нерва терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры выполняются утверждаются университета Индианы школы медицины Уходу за животными и использованию комитета и следуйте Национальный институт инструкций по охране.

1. Хирургическая техника

  1. Поддерживать асептики во время этой процедуры с помощью стерильных перчаток, инструментов и стерильных операционного поля в соответствии с NIH руководящих принципов 25. Стерилизовать инструменты перед началом операции по стерилизации в автоклаве их (см таблицу специфических реагентов / Оборудование для полного списка). Используйте стеклянная бусина стерилизатора для стерилизации инструментов во время операции.

2. Анестезия и подготовка

  1. Обезболить мышь в анестезии поле со смесью 0,9 л / мин кислорода и 2,5% изофлуран использованием ветеринарной системы ИФ испаритель. Убедитесь, что мышь не реагируют на изменения положения тела, прежде чем снимать его из коробки.
  2. Применить глазной мази на муглаза SE, чтобы защитить их от высыхания.
  3. Переключение потока газа из коробки с носовым конусом. Наведите прямо на его левой стороне на нагретой площадки, покрытой с хирургической площадки и абсорбирующим скамейке бумаги с его носа и рта внутри конуса. Непрерывный мониторинг ритм дыхания мышки и скорость и отрегулировать изофлурановой уровней по мере надобности (от 2,5 - 3% ИФ), чтобы поддерживать адекватный уровень анестезии, а также использовать ног щепотку рефлекс, чтобы подтвердить общее успокоение.

3. Хирургическая тактика

  1. Выравнивание и сосредоточиться стереоскоп с операционного поля. Регулировка носовой конус и прикрепить ее вниз так, чтобы она располагалась по краю поля зрения.
  2. С мыши лежа на левом боку, лента край правого уха к носу конуса, обнажая область за ухом, где разрез будет сделан. Убедитесь, что задней ушной вены проходит горизонтально через ухо. Следует отметить, что правильное размещение тон животное и лентой уха имеют решающее значение для того, чтобы быстро найти лицевого нерва.
  3. Смочите шерсть на и за ухом с 70% этанола и брить хирургического сайт, используя бритву или лезвие скальпеля. Предварительное смачивание мех делает бритье легче в этом анатомического расположения.
  4. Протереть кожу раствором йода, такие как Бетадин хирургических скраб (7,5% повидон-йод), а затем с помощью 70% этанола. Повторите этот чистка еще два раза, чтобы тщательно дезинфицировать области.
  5. Чтобы определить, где сделать надрез, проследить задней ушной вены из уха каудально к области боковых зубов в ухо выступа. Использование пружинных ножниц, сделать 4 мм разрез 2 - мм кзади 3 к выпуклости.
  6. Проанализируйте через подкожно-жировой клетчатки и фасции с использованием тупым. Избегайте прямого Резка ножницами, потому что кровеносные сосуды или в мышечную ткань может быть легко повреждены.
  7. Если кровотечение происходит, оказать давление на участке хирургического вмешательства с помощью стерильного ватного тампонав течение по меньшей мере 30 сек. Если происходит существенная потеря жидкости, вводят мыши внутрибрюшинно до 0,5 мл стерильной 0,9% солевого раствора с использованием 25 или 27 G иглу.
  8. Используйте несколько ключевых достопримечательностей, спинного нерва, наружный слуховой проход, а впереди двубрюшная мышцы (как описано ниже), чтобы найти лицевого нерва. Проанализируйте вокруг этих ориентиров, пока ветви лицевого нерва не визуализируется. Нерв появляется в качестве существенного твердого белого структуры, когда это показано, и слой прилипает фасции его основных структур.
    1. Найти спинного нерва, который проходит от каудальной части черепа для иннервации трапециевидной мышцы, как только подкожный жир и фасции были расчленены. Лицевой нерв является глубоко, чтобы спинного нерва.
    2. Найти хрящевой ушной канал, который выглядит жемчужно-белая, и можно увидеть ростральнее лицевого нерва.
    3. Найти мышц живота в передней двубрюшной мышцы, которая находится в верхней части и сaudal лицевого нерва.
  9. Когда основные ветви лицевого нерва визуализировать, отслеживать их спинки, чтобы найти свое происхождение от stylomastoid отверстия. Использование тонких наконечником Дюмон щипцы # 5/45 провести хирургическую сайт открыт, продвижения весной ножницами кончики следующие пути нерва, а затем перейти щипцы дорсально, чтобы вновь передовые область открыта.
  10. Представьте ствол лицевого нерва с скуловой, щечной и предельные нижней челюсти ветви в этой точке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: височной ветви будут найдены ближе к отверстию. Краевые нижнечелюстного нерва разветвляется на его верхней и нижней частей ближе к челюсти, таким образом, эти нервные ветви не будет видна на этом уровне.
    1. Если выполнение пересечения нерва, стабилизировать нерв аккуратно с помощью тоненького кончика пинцетом и перерезать нерв с помощью пружинных ножниц. Избегайте применения слишком много сцепления к нерву с помощью пинцета, чтобы предотвратить avulsing нерв из мозга. От Себяпни друг от друга, или вырезать и удалить часть дистального нерва, чтобы гарантировать, что не может произойти повторное подключение.
    2. При выполнении травмы раздавить, использовать Дюмон # 5/45 щипцы для сжатия нерва в течение 30 сек с использованием постоянного давления разорвать все аксоны, а затем повторите этот влюблен под вторым углом перпендикулярно к первой раздавить сайте. Избегайте применения различное количество давления при 30 сек давке, в противном случае травмы будут несовместимы между животными.

4. Закрытие и восстановление

  1. Повторно жир и мышцы над базовых структур.
  2. Приблизительная края разреза и закрыть рану с помощью 7,5 мм, свернутой клип. Швы или клей также являются приемлемыми для закрытия раны. Послеоперационные анальгетики могут быть предоставлены в это время.
  3. Удалите ленту от уха мыши. Выключите поток ИФ и позволяют мышь, чтобы дышать чистым кислородом в течение 30 сек до 1 мин. Plтуз мышь в пустую клетку, не постельные принадлежности, чтобы оправиться от наркоза.
  4. Когда мышь восстанавливается, изучить его поведение подтверждающих признаков паралича лицевого нерва. Усы будет парализована и под углом назад по направлению к щеке, нос сместятся, и глаз не будет мигать в ответ на облаке воздуха.
  5. Дом животные совместно после операции, если они являются женщинами. Избегайте жилье самцов мышей совместно, потому что они более агрессивны и склонны к принудительной высылке раны клипы их cagemate, которая приводит к инфекции. Обеспечить послеоперационные анальгетиков в это время, если это необходимо.
  6. Монитор мышей раз в день в течение нескольких дней после операции, чтобы гарантировать, что никакая инфекция или другое осложнение не происходит после операции. Удалить раны клипы 7 - 10 дней после операции, если они не упали на свои собственные.
  7. Применить смазочных глазную мазь, чтобы пораженный глаз ежедневно, чтобы предотвратить роговицы осложнений, либо до тех пор, моргание глазом рефлекс не будет сноване покрыты или пока эвтаназии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После лицевого нерва аксотомии выполняется, потеря мотонейронов происходит в результате травмы. Выживание двигательных нейронов после травмы зависит от многих переменных, таких как пол, возраста животных на момент операции, и временной точки, при которой на счету мотонейронов сделали, и Моран и рассмотрения Graeber 24 и Jinno и рассмотрения Ямада 22 и суммировать данные выживаемости мотонейронов. Как правило, около 86% мотонейронов выжить 28 дней после аксотомии 14,15,26. Кинетика потери...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критическим шагом для этого протокола является правильное положение мыши до начала операции. Если мышь лежит не ровно на боку, ухо не заклеено под правильным углом или разрез сделан в неправильном месте, то найти лицевой нерв становится намного сложнее. Когда эта техника будет освоена, операции будут занимать всего несколько минут на одну мышь.

Для закрытия раны можно использовать швы, клей или зажимы для раны. Раневые зажимы предпочтительны из-за небольшого размера разреза и быстроты, с кото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансируется NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
СтереомикроскопLeicaM60
Маркировочная лентаFisherScientific 15-952
Vannas-Tü Пружинные ножницы bingen - прямые/острые/режущая кромка 8,5 см/5 ммИнструменты Fine Science15003-08Стерилизуйте перед использованием
щипцы Dumont #5/45 - стандартные наконечники/угловые 45°/Dumoxel/11 смИнструменты для тонкой науки11251-35Стерилизуйте перед использованием
зажимы для швов Michel - 7,5 мм x 1,75 ммИнструменты для тонкой науки12040-01Описаны как "зажим для раны" в протоколе, стерилизовать перед использованием
аппликатор зажима для ран перекрестного действия Hagenbarth 5"George Tiemann & Co160-910Используется для наложения зажима для раны, стерилизации перед использованием
Аппликатор и средство для снятия швов Michel - Для зажимов 7,5 ммFine Science Tools12029-12Используется для снятия зажима для раны
0,9% Хлорид натрия для инъекций, USPHospira0409-4888-10
Бетадин, 16 унций, с дозаторомFisher Scientific19-027132
70% Этанол
со стеклянными шариками
Стерилизатор

Ссылки

  1. Kaufman, M., Bard, J. The Anatomical Basis of Mouse Development. , Elsevier. New York, NY. (1999).
  2. Ashwell, K. The adult mouse facial nerve nucleus: morphology and musculotopic organization. Journal of Anatomy. 135, 531-538 (1982).
  3. Sunderland, S. A classification of peripheral nerve injuries producing loss of function. Brain : A Journal Of Neurology. 74, 491-516 (1951).
  4. Beahrs, T., Tanzer, L., Sanders, V. M., Jones, K. J. Functional recovery and facial motoneuron survival are influenced by immunodeficiency in crush-axotomized mice. Experimental Neurology. 221, 225-230 (2010).
  5. Mesnard, N. A., Haulcomb, M. M., Tanzer, L., Sanders, V., Jones, K. J. Delayed functional recovery in presymptomatic mSOD1G93A mice following facial nerve crush axotomy. Journal of Neurodegeneration & Regeneration. 4, 21-25 (2013).
  6. Komiyama, M., Shibata, H., Suzuki, T. Somatotopic representation of facial muscles within the facial nucleus of the mouse. A study using the retrograde horseradish peroxidase and cell degeneration techniques. Brain Behav Evol. 24, 144-151 (1984).
  7. Canh, M. Y., Serpe, C. J., Sanders, V., Jones, K. J. CD4(+) T cell-mediated facial motoneuron survival after injury: Distribution pattern of cell death and rescue throughout the extent of the facial motor nucleus. Journal of Neuroimmunology. 181, 93-99 (2006).
  8. Isokawa-Akesson, M., Komisaruk, B. Difference in projections to the lateral and medial facial nucleus: anatomically separate pathways for rhythmical vibrissa movement in rats. Exp Brain Res. 65, 385-398 (1987).
  9. Streit, W., Kreutzberg, G. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. The Journal of Comparative Neurology. 268, 248-263 (1988).
  10. Serpe, C. J., Tetzlaff, J. E., Coers, S., Sanders, V., Jones, K. J. Functional recovery after facial nerve crush is delayed in severe combined immunodeficient mice. Brain, Behavior, And Immunity. 16, 808-812 (2002).
  11. Lal, D., et al. Electrical stimulation facilitates rat facial nerve recovery from a crush injury. Otolaryngology--Head And Neck Surgery. Official Journal Of American Academy Of Otolaryngology-Head And Neck Surgery. 139, 68-73 (2008).
  12. Tomov, T., et al. An Example of Neural Plasticity Evoked by Putative Behavioral Demand and Early Use of Vibrissal Hairs after Facial Nerve Transection. Experimental Neurology. 178, 207-218 (2002).
  13. Skouras, E., Angelov, D. N. Experimental studies on post-transectional facial nerve regrowth and functional recovery of paralyzed muscles of the face in rats and mice. Anatomy (International Journal of Experimental and Clinical Anatomy). 4, 1-27 (2010).
  14. Xin, J., et al. IL-10 within the CNS is necessary for CD4+ T cells to mediate neuroprotection). Brain, Behavior, And Immunity. 25, 820-829 (2011).
  15. Mesnard, N. A., Sanders, V. M., Jones, K. J. Differential gene expression in the axotomized facial motor nucleus of presymptomatic SOD1 mice. The Journal of Comparative Neurology. 519, 3488-3506 (2011).
  16. Mesnard, N. A., Alexander, T. D., Sanders, V. M., Jones, K. J. Use of laser microdissection in the investigation of facial motoneuron and neuropil molecular phenotypes after peripheral axotomy. Experimental Neurology. 225, 94-103 (2010).
  17. Franchi, G. Changes in motor representation related to facial nerve damage and regeneration in adult rats. Experimental Brain Research. 135, 53-65 (2000).
  18. Munera, A., Cuestas, D. M., Troncoso, J. Peripheral facial nerve lesions induce changes in the firing properties of primary motor cortex layer 5 pyramidal cells. Neuroscience. 223, 140-151 (2012).
  19. Liu, L., et al. Hereditary absence of complement C5 in adult mice influences Wallerian degeneration, but not retrograde responses, following injury to peripheral nerve. Journal of the Peripheral Nervous System. 4, 123-133 (1999).
  20. Ferri, C., Moore, F., Bisby, M. Effects of facial nerve injury on mouse motoneurons lacking the p75 low-affinity neurotrophin receptor. Journal of Neurobiology. 34, 1-9 (1997).
  21. Zhou, R. Y., Xu, J., Chi, F. L., Chen, L. H., Li, S. T. Differences in sensitivity to rocuronium among orbicularis oris muscles innervated by normal or damaged facial nerves and gastrocnemius muscle innervated by somatic nerve in rats: combined morphological and functional analyses. The Laryngoscope. 122, 1831-1837 (2012).
  22. Jinno, S., Yamada, J. Using comparative anatomy in the axotomy model to identify distinct roles for microglia and astrocytes in synaptic stripping. Neuron Glia Biology. 7, 55-66 (2011).
  23. Jones, K. J., Serpe, C. J., Byram, S. C., Deboy, C. A., Sanders, V. M. Role of the immune system in the maintenance of mouse facial motoneuron viability after nerve injury. Brain, Behavior, And Immunity. 19, 12-19 (2005).
  24. Moran, L. B., Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain research. Brain research. 44, 154-178 (2004).
  25. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. New York, NY. (2011).
  26. Serpe, C. J., Kohm, A. P., Huppenbauer, C. B., Sanders, V., Jones, K. J. Exacerbation of Facial Motoneuron Loss after facial nerve transection in severe combined immunodeficient (scid) mice. Neuroscience. 19, (1999).
  27. Mesnard-Hoaglin, N. A., et al. SOD1(G93A) transgenic mouse CD4(+) T cells mediate neuroprotection after facial nerve axotomy when removed from a suppressive peripheral microenvironment. Brain, Behavior, And Immunity. 40, 55-60 (2014).
  28. Wang, H., et al. Establishment and assessment of the perinatal mouse facial nerve axotomy model via a subauricular incision approach. Experimental Biology And Medicine. 237, 1249-1255 (2012).
  29. Sharma, N., Moeller, C. W., Marzo, S. J., Jones, K. J., Foecking, E. M. Combinatorial treatments enhance recovery following facial nerve crush. The Laryngoscope. 120, 1523-1530 (2010).
  30. Lieberman, D. M., Jan, T. A., Ahmad, S. O., Most, S. P. Effects of corticosteroids on functional recovery and neuron survival after facial nerve injury in mice. Archives of Facial Plastic Surgery. 13, 117-124 (2011).
  31. Serpe, C. J., Coers, S., Sanders, V. M., Jones, K. J. CD4+ T, but not CD8+ or B, lymphocytes mediate facial motoneuron survival after facial nerve transection. Brain, Behavior, And Immunity. 17, 393-402 (2003).
  32. Haulcomb, M. M., et al. Axotomy-induced target disconnection promotes an additional death mechanism involved in motoneuron degeneration in ALS transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. , (2014).
  33. Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (60), (2012).
  34. Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (54), (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи