Методическая статья

Неинвазивная оценка эффективности новых терапевтических средств для кишечника патологий помощи последовательной Эндоскопическая визуализации Живая мышей

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52383

⸱

10 марта 2015 г.

 ,  , 
1The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 2The Department of Medical Biology, University of Melbourne, 3Olivia Newton-John Cancer Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем методы лонгитюдного мониторинга эффективности терапевтических средств для лечения патологий толстой кишки у мышей с использованием жесткого эндоскопа. Этот протокол может быть легко использован для характеристики терапевтического ответа на отдельную опухоль у живых мышей, а также для мониторинга потенциального рецидива заболевания.

Аннотация

Животные модели воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) и колоректального рака (КРР) предоставили значительное представление о внутренних и внешних механизмах клетки, которые способствуют возникновению и прогрессированию кишечных заболеваний. Идентификация новых молекул, способствующих возникновению этих патологий, привела к всплеску активности, направленной на разработку потенциальных новых методов лечения для подавления их функции. В результате в настоящее время активно используются различные доклинические модели мышей с интактной иммунной системой и стромальным микроокружением. В данной работе мы описываем три экспериментальных протокола для проверки эффективности новых методов лечения в доклинических моделях (1) острого повреждения слизистой оболочки, (2) хронического колита и/или связанного с колитом рака толстой кишки и (3) спорадического колоректального рака. Мы также описываем процедуры серийного эндоскопического обследования, которые могут быть использованы для документирования терапевтической реакции отдельной опухоли и мониторинга здоровья отдельных мышей. Эти протоколы обеспечивают дополнительные экспериментальные платформы для проверки эффективности терапевтических соединений, хорошо переносимых мышами.

Введение

Колоректальный рак (CRC) является 4-й наиболее частой причиной злокачественных опухолей во всем мире 1. Несмотря на значительный прогресс в нашем понимании семейной основе этого заболевания, генетическая предрасположенность только способствует ~ 20% от CRC случаях 2. Остальные относятся к многочисленным внешних и экологических факторов, в том числе хронического воспаления. У людей, связь между хроническим воспалением и раком толстой кишки проявляется в язвенном колите (UC) пациентов, которые имеют более высокий риск развития колит, ассоциированных рак толстой кишки (CAC), в зависимости от продолжительности, степени и тяжести воспалительного заболевания 3 -5. Соответственно, новые методы лечения находятся в стадии разработки, чтобы контролировать иммунный ответ и соответствующую продукцию факторы роста воспалительными микросреды опухоли 6-8. Существует растущая потребность в соответствующих доклинических моделей животных охарактеризовать терапевтическую эффективностьэти препараты против развития и прогрессирования заболевания.

Мышиные модели однозначно показали, что воспалительное микроокружение вносит вклад в прогрессирование CRC, даже в отсутствие явной воспаления 9,10. Эти модели включают в себя использование сульфата полисахарида декстрана натрия (DSS), представленную в питьевой воде мышей, чтобы моделировать повреждения эпителия и острый и хронический Воспалительные заболевания кишечника (IBD) 11,12. Хотя механизм, с помощью которого DSS вызывает повреждение слизистой оболочки и колит полностью не поняты, некоторые исследования показывают, что DSS ингибирует клеточные обратной транскриптазы и рибонуклеазы деятельности внутри клеток, или способствует образованию нано-липидных комплексов, которые сливаются с толстой мембраной приводит к повреждение эпителия 13,14. Изменения в стандартной модели DSS также оказали значительную понимание механизмов, посредством которых толстой эпителиальные клетки сохраняют гомеостаза тканей и REGUпоздно слизистой иммунной реакции 15.

Внутрибрюшинное введение Azoxymethane (АОМ) в одиночку или в сочетании с DSS, обеспечивает модель для изучения взаимосвязи между соматических мутаций в эпителиальной слизистой и воспалительного и стромального микроокружения 16,17. АОМ метаболит канцероген 1,2-диметилгидразином (ДМГ), что непосредственно не приводит к мутациям ДНК. Вместо этого, АОМ гидролизуют с methylazoxymethanol (МАМ) по изоформы цитохрома CYP2E1 в печень, где МАМ, конъюгированного с глюкуроновой кислотой, а затем транспортируется в кишечник через желчные секреции 18. Считается, что бактериальная β-глюкуронидазы способствует деградации МАМ в результате алкилирования ДНК и к накоплению мутаций в эпителиальных клетках 19. Большинство АОМ, вызванных толстой опухоли укрывает миссенс мутации в гене, кодирующем β-катенина, что делает белок устойчив к протеасом degradatiна, что приводит к аберрантной активации канонического Wnt-сигнального пути 20. Когда деятельность ОСО сочетается с повреждением слизистой оболочки, вызванной DSS, последующее заживление ран ответ создает микросреду, которая способствует росту и расширению мутагенизированным эпителия. В одном из вариантов этой модели, повторяющиеся введение ОСО одна в течение нескольких недель могут быть использованы для моделирования спорадический рак толстой кишки, в отсутствие DSS-индуцированной колит 10,17. Эти два бесплатные модели обеспечивают экспериментальные установки для изучения САС и спорадические CRC соответственно, оба из которых связаны с про-воспалительных опухолевого микроокружения 10.

Использование последовательной эндоскопии у мышей был впервые Becker и коллеги 21, и обеспечивает продольную мониторинг колит и опухолевой прогрессии. Здесь мы предлагаем три доклинические протоколы на основе DSS-индуцированной повреждение слизистой оболочки и / или ОСО-опосредованной ТуМор индукции воспроизводимо вызывают определенные толстой патологии. Первый протокол описывает индукции острого повреждения слизистой оболочки в ответ на введение DSS, чтобы вызывать многие из гистопатологических признаков, связанных с IBD. Второй протокол основан на трех последовательных циклов управления DSS, чтобы имитировать вспышки воспаления, обычно наблюдаемой у пациентов с IBD, и может быть осуществлена ​​в сочетании с АОМ-индуцированных мутаций. Итоговый протокол основан на АОМ-индуцированной спорадических эпителиальных мутаций. Для каждого из этих протоколов, мы расширяем на соответствующих стандартных процедур включает профилактические и терапевтические методы вмешательства, которые мы разработали для мониторинга эффективности новых лекарственных препаратов.

Протокол

Уолтера и Элизы Холл Институт медицинских исследований по этике животных комитета утверждается каждый из процедур, описанных в этих протоколах.

1. Подготовка подопытных мышей

  1. Написать экспериментальные когорты, по меньшей мере, 4 соответствующего пола 6-8-недельных мышей C57BL / 6 (М. Musculus), которые разводят и находится в том же специфических патогенов (SPF) за животными / номер и снабжены автоклавного пищи и воды. Использование самок мышей позволит сотрудничество жилья мышей из разных линий, цифр предел окна, и уменьшить клетка-к-клетке вариации.
  2. Убедитесь, что у мышей, по крайней мере, в возрасте 6 недель для того, чтобы эндоскопии процедуры, используя 3,0 мм Диаметр эндоскопии оболочку.
  3. Использование мышей того же генетического фона, и, по возможности, из клеток, хранящихся на той же стойке, чтобы уменьшить колебания, связанные с кишечной микрофлоры. Изменения в микрофлоре между предприятиями животных должны быть приняты во внимание WHEп определения соответствующих контрольных мышей и генотипов для каждого эксперимента 22.
  4. Отметить мыши на слух / ног вырезки, татуировки, или подобны, чтобы позволить для легкой идентификации.
  5. Взвешивание мышей на день 0, чтобы определить базовый экспериментальные веса.
  6. Выполните эндоскопии (см раздел 5) мышей на день 0, чтобы записать исходные толстой фенотипы.

2. Pre-клиническое исследование в ущерб эпителиальных и острого колита модели

  1. Приготовьте раствор терапевтического агента для тестирования. Для терапии поставляемых через желудочный зонд (ПО), подготовить решения для максимального объема 100 мкл. Для терапии предоставляемых внутрибрюшинного (IP) инъекции, подготовить решения для максимального объема 200 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное IP или перорального введения лекарственного средства в течение длительного периода времени может привести к изменению поведения мыши. Чередуйте место инъекции IP избегать длительного дискомфорта. Для перорального введения, обеспечивают мыши с autoclaved семена подсолнечника, как "лечение", чтобы свести к минимуму негативное связь с процедурой через зонд.
  2. В День 1, управлять терапевтического интереса (полученного на стадии 2.1) и соответствующего контроля транспортных средств. В приведенном примере (6А), 5 мкг рекомбинантного человеческого (RH) iInterleukin (ИЛ) -11 белок раствор ют в 200 мкл фосфатно-солевом буфере (PBS), и вводили внутрибрюшинно
  3. Определить время и частоту администраций, которые будут зависеть от фармакокинетического профиля, установленного для терапевтического реагента, который проходит испытания. Рисунок 1 описывает профилактическое лечение с использованием два раза в день инъекции IP Over ходе эксперимента.
  4. Монитор, в том числе консистенции стула и наличием крови, и взвешивать каждый мышь ежедневно. В дни лечения, весом должно совпадать с введением терапевтического средства, чтобы свести к минимуму нагрузку на мышей, вызванных повторной обработки.
  5. На 3-й день, готовят 2,5% (2,5 г / 100 мл) раствор DSS в питьевой воде обычно представленной на мышах путем установки животных. Приблизительно 5 мл / мышь / день в растворе DSS требуется для эксперимента. Расход воды DSS может измениться, если температура окружающей среды объекта животного колеблется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DSS является раздражителем и должны быть обработаны в соответствии с инструкциями MSDS.
  6. Обеспечить доступ свежего DSS мышам вволю в чистых бутылок воды в течение 5 дней подряд. Вечером 5-й день, обеспечить нормальную питьевую воду в дополнение к пюре Пищевые гранул и белковой добавки, представленной в небольших чашках Петри (100 г пищевого гранулы / 10 г протеиновый коктейль / 10 мл воды). Это предотвращает обезвоживание и помогает с минимизации серьезные потери веса.
  7. Эвтаназии мышей CO 2 интоксикации и собирать ткани для последующего гистологического анализа на утро 8-го дня, или когда мыши испытывают ≥15% потери веса в течение более трех сonsecutive дней, в зависимости от того что наступит раньше.
    Примечание: Регулировка дозы DSS между 1-4% (вес / объем) в зависимости от микрофлоры объекта животного и партии DSS. Провести, по заведенному порядку испытания партии, чтобы установить соответствующую дозировку DSS и обойти изменение от партии к партии. Соответствующая доза должна быть основана на потере веса (не больше, чем 15% от первоначального веса) и подтвердил колит гистопатологию.

3. Pre-клиническое исследование в хроническом колите или колит, связанной модели рака

  1. Для модели хронического колита начинается с шага 3.7.
  2. Для колит, связанный с раком (CAC) модели, в День 1, вводят каждой мыши с 10 мг / кг (вес / вес) Azoxymethane (ОСО, 250 мкл, IP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: АОМ канцерогеном и должны быть обработаны в соответствии с инструкциями MSDS.
  3. Маточные растворы ОСО получают, как 10 мг / мл аликвоты и хранили при -20 ° С. В день инъекции, раствор АОМ оттаивают и разбавл ют до 1 мг / мл в PBS. Повторное замораживание и оттаивание раствора ОСО следует избегать.
  4. Доза АОМ можно регулировать между 8-12 мг / кг. Регулярное партия требует проведения испытания для определения соответствующего ОСО дозировку для того, чтобы обойти токсичности у мышей из-за партии к партии вариации.
  5. В дни 1-7 следующие веса управления АОМ будет стабильна и по этой причине мониторинг веса может быть опущен во дней 1-7, чтобы избежать контакта с животными, которые выделяют цитотоксические метаболиты в их фекалиях.
  6. На 7-й день все постельные принадлежности должны быть изменены следующие цитотоксические процедур. После того, как изменение постельное белье в комплекте, животные больше не требуют цитотоксических процедуры обработки, так как они не будут больше выделяя цитотоксические метаболитов.
  7. На 8-й день, готовят 2,5% (2,5 г / 100 мл), DSS (как описано в стадии 2,5) и предоставить мышей без ограничений.
  8. Взвесьте мышей ежедневно в течение всего эксперимента и контролировать на наличие признаков болезни, в том числе взъерошенными фуг, скрючившись, кровавый стул и снижение движения.
  9. На 13-й день, удаления раствора DSS и не дают мышей с нормальной питьевой водой до 28-й день Дни 8-28 составляют один «цикл» протокола хронический колит / CAC.
  10. В дни 13-28, когда мыши даны нормальный питьевой воды, обеспечить мышей с пюре Пищевые гранул и протеин, представленную в небольших чашках Петри (100 г пищевого гранул / 10 г белка дрожания / 10 мл воды). Это предотвращает обезвоживание и помогает с минимизации серьезные потери веса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: белковые добавки в пюре не должно быть обеспечено когда мыши получают DSS, содержащих питьевой воды в целях обеспечения согласованности потребления DSS.
  11. На 20-й день выполнять вторую экспертизу эндоскопической контролировать индивидуального здоровья мыши (см раздел 5).
  12. На день 29 повторить цикл DSS (цикл 2: 2,5% (вес / объем) при условии, DSS течение 29-33 дней и нормальной питьевой воде в течение 34-50 дней).
  13. В День 40 выполнить THIий эндоскопическое исследование для контроля индивидуального здоровья мыши и определить опухолевой (см раздел 5).
  14. Если не видны опухоли при эндоскопии на день 40, начинают третий цикл DSS в дни 50-72 (цикл 3: 2,5% (вес / объем) при условии, DSS течение 50-55 дней и нормальной питьевой воде в течение 56-72 дней). Как правило, опухоли видны на день 40 и, следовательно, третий цикл DSS могут быть опущены.
  15. После того, как опухоли становятся видимыми, эндоскопического обследования, назначить на каждую мышь эндоскопическое счет опухоли (см раздел 5) и назначить индивидуальные мышей когорт с аналогичными исходными бремени опухолей.
  16. На 42-й день (или при видны опухоли), администрирования терапевтическое соединение или соответствующий контроль транспортного средства (см раздел 2.2). Время от дозы будет зависеть от фармакокинетический профиль терапевтического. Пример лечения вмешательства вводят IP три раза в неделю на мышах с установленными опухолями предусмотрено (рисунок 2).
  17. Выполните еndoscopic экзаменов один раз в неделю в течение всего срока терапевтического лечения для мониторинга нагрузки опухоли. Как правило, 4 недели терапевтического лечения, достаточно заметить, объективный ответ лечения. После прекращения лечения, когорта мышей также можно контролировать с помощью эндоскопии рецидива опухоли.
  18. Эвтаназии мышей CO 2 интоксикации и собирать ткани для биохимического и / или гистологического анализа на утро Дня 72 или когда мыши испытывают ≥15% потери веса в течение более трех дней подряд, что наступит раньше.

4. Предварительно клинических испытаний, в которых спорадически колоректального рака модели

  1. В День 1, вводят Каждый IP мыши с 10 мг / кг ОСО (см шаг 3,2). Доза АОМ можно регулировать между 8-12 мг / кг. Регулярное партия требует проведения испытания для определения соответствующего ОСО дозировку для того, чтобы обойти токсичности у мышей из-за партии к партии вариации.
  2. Повторите инъекции в первый день каждой неделидля следующих 5 недель (фиг.3). Мыши должны быть обработаны в соответствии с цитотоксическими процедур безопасности для всего 6 недель.
  3. Взвешивание каждой мыши в день АОМ инъекции, чтобы минимизировать стресс в мышей, вызванных повторной обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: АОМ канцерогеном и должны быть обработаны в соответствии с инструкциями MSDS.
  4. Все животные должны быть обработаны в соответствии с цитотоксическими процедур безопасности при 6 недель острого среднего отита IP-инъекций, необходимых для этого протокола.
  5. В 8-й неделе выполнить эндоскопическое исследование для контроля за возникающих опухолей (см раздел 5). Эндоскопическое исследование следует проводить каждые две недели, пока опухоли не становятся видимыми. Как правило, дикого типа C57BL / 6 животных начинают развиваться опухоли примерно на 40 недель после первоначального введения ОСО.
  6. После того, как опухоли становятся видимыми, эндоскопического обследования, назначить на каждую мышь эндоскопическое счет опухоли (см раздел 5) и назначить индивидуальную мышей к когорте с аналогичным опухолевые бремя до начала терапевтического лечения.
  7. Во время недели 40 (или когда опухоли первым видимым), администрирования терапевтическое соединение или соответствующий контроль над автомобилем.
  8. Время от дозы будет зависеть от фармакокинетический профиль терапевтического (см шаг 2,1). Пример лечения вмешательства вводят IP 3 раза в неделю на мышах с установленными опухолями предусмотрено (рисунок 3).
  9. Выполнение эндоскопическое обследование еженедельно в течение продолжительности периода лечения терапевтических мониторинга нагрузки опухоли. Как правило, через 4 недели терапевтического лечения является достаточным для объективного ответа на лечение. После прекращения лечения, когорта мышей также можно контролировать с помощью эндоскопии рецидива опухоли.
  10. Эвтаназии мышей CO 2 интоксикации и собирать ткани для биохимического и / или гистологического анализа толстой кишки и опухоли в течение недели 45, или после 4 недель терапии.
ve_title "> 5. Эндоскопические исследования

  1. Эндоскопии оборудование должно быть собраны в соответствии со стандартными процедурами 16.
  2. Стерилизовать и очистить эндоскопа зонда с 70% этанола или антибактериальным смазки.
  3. Видео может быть записано с помощью ноутбука или настольного компьютера и стандартного программного обеспечения средств массовой информации, таких как IMOVIE. Стандартный монитор компьютера, а не монитор медицинского класса, достаточно представить себе толстой кишки во время процедуры эндоскопии (рис 4).
  4. Обезболить группы из 5-6 мышей одновременно в камере с 3% изофлуран в 100% O 2 со скоростью 0,2-0,4 л / мин. После того, как мышей под наркозом, что подтверждается ног крайнем случае; уровни изофлуран должна быть изменена, чтобы 0,5-2% на техническое обслуживание.
  5. Удалить индивидуальный мышь из камеры, и поместить его брюшной стороне с голову закреплен в носовой конус. Полная анестезия должна контролироваться и задние ноги должны быть скорректированы таким образом, чтобы они сtretched из-за мыши.
  6. Поставьте ветеринар мазь на глазах у мышей, чтобы предотвратить сухость.
  7. Держите хвост мыши, где она встречается нижней части позвоночника четко выявить анус. Вставьте жесткий эндоскоп оболочку в стакан воды и отрегулировать поток воздуха для отвода одного небольшого пузырька в то время.
  8. Воздуха позволит толстой кишки, чтобы раздуть. Если поток воздуха слишком сильный, воздух будет закачиваться в желудке мыши. Дополнительная смазка не требуется.
  9. Осторожно вставьте жесткий эндоскоп оболочку в прямую кишку. Как правило, эндоскоп может быть вставлен до 3 см, на которые указывают двоеточия в кривых мышей и не доступен для жесткой эндоскопа.
  10. Общая трудность при эндоскопии процедур блокирования доступа к просвете толстой кишки из-за фекалий. Избежать этого можно, мягко массируя живота мышей до процедуры, чтобы поощрять дефекации, или тщательно маневрирования эндоскопа вокруг FECAл независимо от того, во время процедуры. Перистальтика может также произойти, в ходе которой эндоскоп должен быть проведен в должности до толстой кишки мускулатура расслабляется.
  11. Начать запись видео на любом этапе процедуры эндоскопии. Болезнь забил может быть записан с помощью опытного ассистента во время процедуры, или на более позднем этапе из видео файлов.
  12. После эндоскопической экзамена, вернуть мышей в клетку и контролировать их во время выхода из наркоза. Животные, как правило, просыпаются и с мобильного в течение 2 мин после удаления из ИФ введение носового конуса.
  13. Убедитесь, что эти процедуры проводятся опытным ученым. Каждая процедура эндоскопии займет около 2 мин на мыши.

6. Болезнь Скоринг

  1. Для контроля колит, оценка видео для мышиного эндоскопической Индекс колита выраженности (MEICS) 16, какие документы изменения в (I) с толщиной стенки толстой кишки, указанном прозрачности(II) консистенции стула, (III) целостность кровеносных сосудов и присутствие, (IV) язвы и участки регенерации, что присутствует в модульное (v) кровотечения показано отложений фибрина (рис 5а).
  2. Для контроля опухолевой, оценка видео для падения и размера опухоли. Размер опухоли определяется диаметром просвете ободочной кишки, занимаемых опухоли 16 (фиг 5b). Оно является общим для использования как колит и опухоли скоринг параметры для одной мыши. Использование эндоскопии, отдельные опухоли и здоровье слизистой оболочки толстой кишки можно контролировать с течением времени, что обеспечивает считывание для успеха новых терапевтических средств в одном животном.
  3. (Необязательно) Неподвижные изображения могут быть извлечены из видео для генерации представительных фигур (Рисунок 6).

Результаты

Похудение используется в качестве стандартного параметра, чтобы отслеживать заболевания, связанного с колитом, который обычно используется для мониторинга общего состояния здоровья мышей. Животные, как правило поддерживать свой вес в то время как DSS воды, содержащей вводят, и только начинают терять вес, когда они вернулись к нормальной питьевой воды. В качестве параметров для похудения должны быть установлены в соответствии с этикой животных комитета организации. Для того чтобы предотвратить дегидратацию, связанную с длительной диареи, использовать обычную предоставление сусла (пищевые таблетки пюре и смешивают с питьевой водой), дополненной протеиновый коктейль, в дополнение к обычной питьевой воде.

Как можно использовать альтернативный анестезии, кетамин / ксилазин или аналогичные агенты, при изофлуран оборудование не доступно. Из-за жесткой природы эндоскопа, эти процедуры позволяют только для визуализации наиболее дистальных 3 см толстой кишки мыши. Новые эндоскопы с Дополнительные возможности (в том числе гибкости и флуоресценции) доступны в зависимости от потребностей эксперимента. Однако, поскольку вредные эффекты DSS в основном ограничивается дистальном отделе толстой кишки мышей, с мягким патологии, наблюдаемой в средней ободочной кишки, жесткий эндоскоп не мешает мониторинг здоровья слизистой отдельных мышей. Хотя мы описали протокол для профилактического лечения острого DSS-индуцированной колит, этот протокол может быть легко изменен, чтобы проверить стратегии лечения вмешательства. Эффективность препарата разработанного, чтобы облегчить повреждение эпителия и колит могут быть проверены в продольном направлении в отдельных мышей и количественно на основе параметров, забил описанных (рисунок 5). Это выгодно по сравнению с традиционными экспериментальными конструкций, требующих забой мышей при определенных временных точках в ходе экспериментального протокола, и не допускает характеристику ответ болезни обработке с течением времени.

т "> Клинические исследования на людях выявили значительные различия в том, как разные опухоли у конкретного пациента реагировать на лечение. Процедуры, описанные здесь обеспечивают средства для мониторинга общее бремя опухоли, а также ответ на лечение отдельных опухолей за ходом эксперимента. Это важно учитывать, что протоколы вмешательства, которые изложены в моделях рака не принимают во внимание эффекты терапии о возбуждении опухоли. Профилактические протоколы, с лечения, предоставляемого до, когда опухоли становятся видимыми при эндоскопии, требуется получить эту информацию. Протоколы, изложенные здесь предоставить информацию о терапевтических эффектов на на прогрессирование (измеряется по размеру опухоли) отдельных опухолей. регрессия опухоли также могут быть указаны с помощью сокращения количества видимых опухолей.

г "/>
Рисунок 1:. Мониторинг эффективности профилактической терапии лечения в модели острой кишечной повреждения экспериментальный протокол () требует 8 дней от начала до завершения. Therapeutics вводят (б) от 1-й день для профилактического лечения. DSS приведена в питьевой воде (с) от 3-й день от экспериментального протокола. Эндоскопия выполняется (г) контролировать прогрессирование заболевания у животных. Предлагаемые временные периоды включают в себя День 0 (необработанный) и 2-й день (мониторинг здоровья), День 5 и 8 (для определения бремени болезней). Эксперимент прекращается (е) утром День 8. В мыши дикого типа (F) в прогрессии заболевания увеличивается с течением времени.

figure-results-1
Рисунок 2: Мониторинг эффективности вмешательства терапии в модельном ОF колит, связанный с раком. Экспериментальный протокол () требует 72 дней от начала до конца. Therapeutics (б) вводят мышам с установленными опухолей с первого дня 46 для вмешательства лечения. АОМ (с) вводят на 1 день, а DSS приведена в питьевой воде в течение трех циклов в протоколе, начиная с дня 8. Хирургическая (г) выполняется для мониторинга прогрессирования заболевания у животных. Предлагаемые временные периоды включают в себя День 0 (необработанный), День 20 (мониторинга здоровья), и День 40 (для группы животных в соответствии с опухолевой). Эндоскопии выполняется еженедельно в течение терапевтического лечения для мониторинга результатов болезни. Эксперимент (е) завершается утром Дня 72. В мыши дикого типа (F) опухолевой увеличивается с Днем 40 года.

figure-results-2
Рисунок 3:. Мониторинг эффективности вмешательства терапии в модели спонтанного рака толстой кишки экспериментальный протокол () требует> 50 недель от начала до завершения. Therapeutics (б) вводят мышам с установленными опухолями вмешательства, лечения. АОМ (с) вводят на 1 день, а затем еженедельно в течение 6 последовательных инъекций в течение экспериментального протокола. Эндоскопии (г) выполняется для мониторинга прогрессирования заболевания у животных. Предлагаемые временные периоды включают в себя День 0 (необработанная) и 8-й неделе (мониторинг опухоли) и раз в две недели там после (установить опухолевой). Эндоскопия выполняется еженедельно в течение всего курса лечения для наблюдения результаты лечения. Эксперимент (е) прекращается в неделю 50. В мыши дикого типа (F) опухолевой нагрузки возрастает от недели 40 и далее. р>

figure-results-3
Рисунок 4:. Установка оборудования Экспериментальная установка () для эндоскопического устройства, с отдельными частями оборудования указано. Жесткий эндоскоп (б), с отдельными компонентами указано. Шкала бар = 2,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 5:. Параметрами болезни скоринга по эндоскопии план () мышиного эндоскопической Индекс колит степень (MEICS). План (б) отдельных параметров опухоли оценки.ES / ftp_upload / 52383 / 52383fig5highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 6: Типичные терапевтические процедуры представитель потеря веса, эндоскопические изображения и баллы за:. () Острая DSS-индуцированной повреждение слизистой оболочки (б) опухоли, которые развивались в соответствии с протоколом / DSS ОСО (с) Опухоли, которые развивались после последовательный.. Протокол ОСО. N = 3 мышей на группу. * P <0,05, *** р <0,001 (T-тест Стьюдента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Три протокола, которые описаны методы контурных надежной и воспроизводимой индукции толстой патологии болезни у мышей. В сочетании с обычной эндоскопической мониторинга и стратегий вмешательства, изложенных здесь, эти протоколы будут предоставлять мощный доклинические понимание эффективности терапии. Наши лаборатории обычно используют все из этих протоколов для мониторинга успех новой терапии 10,23,24.

Есть ряд соображений, при выборе доклинические животную модель для тестирования новых терапевтических. Они включают в себя актуальность модели на болезни человека, и вклад микроокружения опухоли к предлагаемым мерам терапевтической мишени. Здесь мы предлагаем три протокола для терапевтического вмешательства в установленных моделей кишечных заболеваний. Эти модели являются воспроизводимыми и доставка реагентов, чтобы вызвать заболевание легко управлять. Важно отметить, что модели очень актуальныв различных аспектах и ​​этапах колит начала и инициации и прогрессии опухоли. Исследователи должны учитывать генетический фон штаммов мыши, используемых при проектировании экспериментов, так как восприимчивость к болезни, вызванной DSS и / или ОСО может значительно +25 меняться. Кроме того, различные микробные сообщества могут иметь различные возможности обмена в контексте ОСО, которые метаболизируются бактерий. Мы предупреждаем против использования различных когорт мышей, которые родились в разных учреждениях животных (в том числе коммерческих поставщиков) в одном эксперименте. Точно так же, отличается микрофлора у мышей используются из различных средств может вызвать различные ответы хозяева расписок, вызванных повреждение эпителия барьера 11. Кроме того, соответствующая анализ ткани (например, для очистки РНК) также должны быть рассмотрены, поскольку способность DSS, чтобы ингибировать обратную транскриптазу повлияет на последующее молекулярного анализа 26,27.

Мышь эндоскопия техника передний край неоднократно наблюдать начало заболевания и прогрессирования в отдельной мыши. Возможность записи видео и извлекать неподвижные изображения позволяет легко мониторинг нескольких параметров заболеваний и опухолей. В дополнение к улучшению благосостояния животных, эндоскопическая мониторинга также уменьшает потребность в многочисленных когорт подопытных мышей, которые традиционно были отобраны на разных временных точках, чтобы отслеживать исход заболевания. Система подсчета очков MEICS не является заменой для гистопатологического анализа, но и обеспечивает альтернативные средства для контроля здоровья животных и повреждение слизистой оболочки в живых мышей. Мышь эндоскопия специализированная техника лаборатория, и все процедуры должны выполняться квалифицированным персоналом для обеспечения надлежащего обработке и обращении мышей, а также для обеспечения стабильного качества в изображениях, используемых для озвучивания заболевания. В руках квалифицированных кадров, мы обнаружили, что эндоскопия вызывает мало или никакого повреждения тумоRS, которые могут привести внутри опухолевой кровотечение. Для терапевтических протоколов, описанных, мы считаем, эндоскопия очень выгодно, так как он дает возможность определить начальную опухолевой, и позволяет нам группы когорт животных с похожими трудностями опухолевых до введения терапевтического препарата. Последовательное мониторирование мышей позволяет ученым определить эффективность новых методов лечения на ранней стадии, с возможностью прекращения неудачных экспериментов своевременно.

Как нашем понимании воспалительного заболевания кишечника и колоректального рака заранее, будут определены новые цели для терапии. Соответствующие модели на животных будут являться неотъемлемой частью обеспечения, что наиболее перспективными новые методы лечения движутся навстречу клинических испытаний.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить CSL Ltd. за поддержку в приобретении эндоскопического оборудования. Исследования в лаборатории МЭ поддерживаются Институтом исследований рака им. Людвига, а лаборатории ТП и МЭ — Службой поддержки оперативной инфраструктуры правительства штата Виктория и Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии. ME является старшим научным сотрудником NHMRC.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Декстран сульфат натрия (MW 36,000-50,000)MP Biochemicals160110Требуется периодическое тестирование.
АзоксиметанSigmaA5486-100MGТребует периодического тестирования.
Ванильный протеиновый коктейльН/Д Н/ДДоступен в больничных аптеках.
ИзофлуранPPCM60303Это реагент ограниченного доступа, который следует хранить под замком.
70% этанолн/дн/дСтандартный лабораторный реагент.
Миниэндоскопическая система
Endovision TricamKarl Storz20212001-020
Источник света Xenon 175 с насосом защиты от запотеванияKarl Storz20134001
Прямой телескоп HOPKINSKarl Storz64301AA
Эндоскопическая оболочка (общий диаметр 3 мм)Kalr Stroz61029C
Оптоволоконный световой кабельKalr Stroz69495ND
Программное обеспечение для компьютера и медиаплеераAppleiMovie
ScaleAny Любыевесы подходят для взвешивания мышей.
Coloview

Ссылки

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
  2. Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
  3. Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
  4. Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
  5. Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
  6. Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
  7. Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
  8. Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
  9. Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
  10. Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
  11. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  12. Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41(2012).
  13. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084(2012).
  14. Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
  15. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
  16. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
  17. Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
  19. Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
  20. Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
  21. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
  22. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
  23. Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
  24. Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
  25. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  26. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350(2013).
  27. Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Модели колитаколоректальный рактерапевтическая эффективностьэндоскопическая оценкамониторинг заболеваниямышиные моделидоклинические испытания
Неинвазивная оценка эффективности новых терапевтических средств для кишечника патологий помощи последовательной Эндоскопическая визуализации Живая мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.