Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

Soizic Garaud; Chunyan Gu-Trantien; Jean-Nicolas Lodewyckx; Anaïs Boisson; Pushpamali De Silva; Laurence Buisseret; Edoardo Migliori; Myriam Libin; Céline Naveaux; Hugues Duvillier; Karen Willard-Gallo

doi:10.3791/52392

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

19.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52392

⸱

6 декабря 2014 г.

Soizic Garaud^*¹^,² , Chunyan Gu-Trantien^*¹^,² , Jean-Nicolas Lodewyckx¹^,² , Anaïs Boisson¹^,² , Pushpamali De Silva¹^,² , Laurence Buisseret¹^,² , Edoardo Migliori¹^,² , Myriam Libin³ , Céline Naveaux¹^,² , Hugues Duvillier¹^,⁴ , Karen Willard-Gallo¹^,²

¹Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, ²Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, ³Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, ⁴Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает быструю неферментативную диссоциацию свежих фрагментов тканей человека для качественной и количественной оценки CD45⁺ клеток (лимфоцитов/лейкоцитов), присутствующих в различных нормальных и злокачественных тканях человека. Кроме того, надосадочная жидкость, полученная из первичного гомогената тканей, может быть собрана и сохранена для дальнейшего анализа или экспериментирования.

Аннотация

Способность опухолевых клеток, чтобы избежать иммунной системы, характеризующийся выхода опухоли с обеих врожденных и адаптивных иммунных ответов, в настоящее время принимается в качестве важной отличительной чертой рака. Наше исследование на рак молочной железы сосредотачивается на активной роли, что опухолевые проникновения лимфоциты играют в опухолевой прогрессии и результаты лечения. С этой целью мы разработали методику быстрого выделения интактных лимфоидных клеток от нормальных и аномальных тканей с целью оценки их вблизи их родного государства. Гомогенаты, полученные с использованием механического диссоциатора показывать обе повышенную жизнеспособность и клеток восстанавливаться при сохранении поверхностной экспрессии рецептора по сравнению с ферментом усваивается тканями. Кроме того, ферментативное расщепление оставшихся нерастворимого материала не восстановить дополнительные CD45 ⁺ клеток, указывающие, что количественные и качественные измерения в первичной гомогената вероятно, действительно отражают Проникнув субпопуляции в ткани ФрагмEnt. В лимфоидных клеток в этих гомогенатах может быть легко характеризуется использованием иммунологических (фенотип, пролиферацию и т.д.) или молекулярный (ДНК, РНК и / или белка) подходы. CD45 ⁺ клетки могут быть также использованы для очистки субпопуляций, расширение в пробирке или криоконсервации. Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что первичный супернатант ткани из гомогенатов может быть использован для характеристики и сравнить цитокины, хемокины, иммуноглобулины и антигенов, присутствующих в нормальных и злокачественных тканей. Этот протокол функционирует очень хорошо для ткани молочной железы человека, а также должны быть применимы к широкому спектру нормальных и ненормальных ткани.

Введение

Микроокружение опухоли состоит из различных типов клеток, многочисленные исследования показывают, что каждый из них играет определенную и важную роль в онкогенезе^1,2. К ним относятся, помимо прочего, инфильтрирующие иммунные клетки, стромальные клетки, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки³. Исследования ex vivo инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL; CD45⁺ или лейкоциты, которые преимущественно являются лимфоцитами в опухолях молочной железы) из свежих образцов тканей человека, затруднено их низкой частотой, небольшими размерами образцов, часто доступными для исследований, и потенциальной потерей жизнеспособности во врем....