Методическая статья

Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

DOI:

10.3791/52392

⸱

6 декабря 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает быструю неферментативную диссоциацию свежих фрагментов тканей человека для качественной и количественной оценки CD45+ клеток (лимфоцитов/лейкоцитов), присутствующих в различных нормальных и злокачественных тканях человека. Кроме того, надосадочная жидкость, полученная из первичного гомогената тканей, может быть собрана и сохранена для дальнейшего анализа или экспериментирования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность опухолевых клеток, чтобы избежать иммунной системы, характеризующийся выхода опухоли с обеих врожденных и адаптивных иммунных ответов, в настоящее время принимается в качестве важной отличительной чертой рака. Наше исследование на рак молочной железы сосредотачивается на активной роли, что опухолевые проникновения лимфоциты играют в опухолевой прогрессии и результаты лечения. С этой целью мы разработали методику быстрого выделения интактных лимфоидных клеток от нормальных и аномальных тканей с целью оценки их вблизи их родного государства. Гомогенаты, полученные с использованием механического диссоциатора показывать обе повышенную жизнеспособность и клеток восстанавливаться при сохранении поверхностной экспрессии рецептора по сравнению с ферментом усваивается тканями. Кроме того, ферментативное расщепление оставшихся нерастворимого материала не восстановить дополнительные CD45 + клеток, указывающие, что количественные и качественные измерения в первичной гомогената вероятно, действительно отражают Проникнув субпопуляции в ткани ФрагмEnt. В лимфоидных клеток в этих гомогенатах может быть легко характеризуется использованием иммунологических (фенотип, пролиферацию и т.д.) или молекулярный (ДНК, РНК и / или белка) подходы. CD45 + клетки могут быть также использованы для очистки субпопуляций, расширение в пробирке или криоконсервации. Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что первичный супернатант ткани из гомогенатов может быть использован для характеристики и сравнить цитокины, хемокины, иммуноглобулины и антигенов, присутствующих в нормальных и злокачественных тканей. Этот протокол функционирует очень хорошо для ткани молочной железы человека, а также должны быть применимы к широкому спектру нормальных и ненормальных ткани.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроокружение опухоли состоит из различных типов клеток, многочисленные исследования показывают, что каждый из них играет определенную и важную роль в онкогенезе1,2. К ним относятся, помимо прочего, инфильтрирующие иммунные клетки, стромальные клетки, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки3. Исследования ex vivo инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL; CD45+ или лейкоциты, которые преимущественно являются лимфоцитами в опухолях молочной железы) из свежих образцов тканей человека, затруднено их низкой частотой, небольшими размерами образцов, часто доступными для исследований, и потенциальной потерей жизнеспособности во время экстракции. Поскольку иммунные клетки, проникающие в опухоли, обычно присутствуют в качестве пассажиров, а не постоянных жителей, в целом их легче высвободить из тканевого матрикса.

Диссоциация опухолевой ткани при сохранении клеточной целостности является технически сложной задачей и традиционно выполняется с использованием комбинации механических и ферментативных этапов для получения одиночных клеточных суспензий4-8. Этот подход предполагает длительные инкубационные периоды и связан со значительным снижением жизнеспособности клеток, а также с потерей рецепторов клеточной поверхности в результате ферментативного расщепления. Высококачественные исследования проточной цитометрии, характеризующие TIL в опухолевом микроокружении, а также чистая очистка субпопуляций CD45+ с помощью проточной цитометрии или гранул, покрытых антителами, сложнее получить из опухолевой ткани, расщепленной ферментами. Кроме того, надосадочная жидкость (SN) из полученного опухолевого гомогената не поддается дальнейшему анализу, включая количественную оценку секретируемых белков (цитокинов, хемокинов, иммуноглобулинов или опухолевых антигенов) или экспериментальному лечению нормальных клеток, из-за возможности деградации белка в ферментативных расщеплениях.

В поисках метода получения одноклеточных гомогенатов из тканей молочной железы [включая опухолевые, несмежные неопухолевые (NANT) и нормальные (из уменьшенных молочных желез) тканей молочной железы] без ферментативного расщепления, мы протестировали различные методы механической гомогенизации. Гомогенаты, полученные с помощью механического диссоциатора, имели повышенную жизнеспособность клеток (в 2 раза) и общее восстановление клеток (в 2 раза) при сохранении экспрессии поверхностных рецепторов. Ферментативное расщепление оставшегося нерастворимого материала не привело к восстановлению дополнительных CD45+ клеток, что позволяет предположить, что все они были высвобождены в исходном гомогенате. Таким образом, этот быстрый и простой подход позволяет как качественно, так и количественно оценить субпопуляции CD45+, присутствующие в различных нормальных и злокачественных тканях человека. Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что SN из исходного гомогената (SN первичной ткани) может быть собран и сохранен для дальнейшего анализа или экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы были получены с помощью протокола одобрен Комитетом по этике Медицинского института Жюля Борде мимо с письменного информированного согласия, полученного от каждого пациента.

1. Получение гомогената ткани

  1. Проанализируйте Резецированная тканей (злокачественных и нормальных тканей Резецированная из операционной) находятся в лаборатории патологии обученным персоналом для немедленного пуска. Опухоль, NANT (берутся по дальней дистанции от опухоли, как это возможно) и нормальные фрагменты ткани регулярно обрабатываются в течение 1 - 3 ч хирургического иссечения в BSL2 лаборатории с использованием стандартных процедур биобезопасности для тканей человека. Блок-схема протокола проиллюстрировано на фиг.1.
  2. Взвесьте все фрагменты тканей (обычный, Нант и опухоль) и измерить длину, ширину и высоту (длина х ширина х высота). Это важный шаг для последующей нормализацией клеточных субпопуляций, экстрагировали РНК, и т.д.
    НЕТTE: диапазон размеров образца составляет от 100 до 10000 мм 3 без жира, если это возможно.
  3. Отказ от ответственности фрагмент опухоли на предметное стекло для H & E окрашивания, чтобы убедиться, что ткань на самом деле часть опухоли.
    1. Для этого нажмите на предметное стекло микроскопа, на фрагменте опухоли и, слегка надавливая пальцами на несколько секунд.
    2. Закрепите слайд с изопропанола в течение 2 мин с последующим стадии промывки в воде. Контрастирующая ткань на 30 сек с гематоксилином Майера.
    3. Вымойте слайд в шести ванн воды. Пятно в Phloxine В 2% в течение 15 сек.
    4. Промыть в одном ванну водой, а затем четыре ванны изопропанола и отделки с одной ванне с водой.
    5. Выдержите в изопропанола в течение 1 мин и канализации. Ясно в двух ваннах ксилола.
    6. Установите ксилолом основе монтажа среды. Проверьте для клетками опухоли (рис 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В основном, опухолевые клетки прилипают к тисненой слайд - стромы, лимфоидные или объявлениемipose клетки редко остаются, оставляя промежутки между опухолевыми клетками (фиг.2).
  4. Поместите ткани фрагмент в небольшой чашки для культивирования, содержащей 1 мл в химически определенной, не содержащей сыворотки среде гемопоэтических клеток (далее по тексту среды) при комнатной температуре и кости его на мелкие кусочки (~ 1 - 2 мм 2) с использованием стерильной скальпель.
  5. Передача все (фрагменты ткани + среда) с механической Диссоциатор C трубки.
  6. Промойте чашку Петри и скальпель с 2 мл среды с использованием пипетки Пастера и добавить к С трубки (объем среды для диссоциации = 3 мл).
  7. Используйте механическую Диссоциатор программы A.01 Для C трубок (самый нежный программы) для гомогенизации фрагментов ткани в одной клеточной суспензии. Поместите C трубку в аппарате и запустить программу два раза подряд (один цикл = 25 сек).
    Примечание: Эта процедура гомогенизации была создана и утверждена для человеческой ткани молочной железы, другие товойили или ткани типа, возможно, потребуется использовать другую программу и должны быть проверены в первую очередь.
  8. Снимите C трубку от аппарата и переливать гомогената непосредственно в сито 40 мкм клетки, сидящего на 50 мл трубки. Используя ту же пипетку Пастера как на стадии 1.6, передача какой-либо жидкости, оставшейся в C трубки к клеточный фильтр.
  9. Передача отфильтрованной жидкости в 15 мл пробирку с помощью микропипетки наконечник в 1 мл. Временно держать сотовый сетчатый фильтр и его 50 мл трубку.
  10. Промойте C трубку с дополнительными 3 мл среды и передавать это, опять же, используя тот же пипетку Пастера как в шаге 1.6, в ячейки фильтра еще сидящего на 50 мл трубки. Сожмите максимальное количество остаточной жидкости в ловушке в unhomogenized ткани в 50 мл пробирку, осторожно перемещая его вокруг сито с чистой пипетки Пастера или 1 мл наконечником, который впоследствии выбросить, чтобы избежать загрязнения элюата.
  11. Поместите ячейки фильтра вверх дном на тОн оригинала С трубки и промыть 3 мл среды таким образом, что unhomogenized ткани падает обратно в C трубки.
  12. Re-гомогенизации, как в шаге 1,7 в течение двух циклов программы A.01.
  13. Вылейте эту вторую гомогената через ячейки сетчатого фильтра, сидящего на 50 мл трубку, промыть C трубку снова 3 мл среды (как в шаге 1,10) и передачи с пипетки Пастера в ячейки фильтра, сидящего на 50 мл трубку снова сжимая максимум Количество жидкости от остаточного соединительной ткани, захваченного в клеточный фильтр.
  14. В этот момент, объем ~ 2,5 мл в 15 мл пробирку и ~ 9 мл в 50 мл пробирку.

2. Разделение тканей супернатанта и клеток

  1. Центрифуга гомогенатах в 15 мл и 50 мл пробирки в течение 15 мин при 600 х г при комнатной температуре.
  2. Декантировать SN от 15 мл пробирку в чистую пробирку и временно хранить при 4 ° С. Этот супернатант = первичная опухоль, NANT или нормальный тиСГУП SN (конечный объем 2,5 мл) с последующим уточнением и аликвоты перед хранением при -80 ° С в течение будущих анализов (см. ниже)
  3. Жидкость над осадком сливают из 50 мл пробирку.
  4. Осторожно ресуспендирования обеих клеточных гранул в конечном объеме 1 мл среды. Короче говоря, сначала слегка нарушить осадок клеток в обеих трубках (нажав трубку на твердую поверхность). Ресуспендируют осадок клеток свободную в 50 мл 500 мкл среды и передачи этой клеточной суспензии в 15 мл пробирку для ресуспендирования второй осадок. Повторите этот шаг, как только со второй 500 мкл среды для максимального восстановления клеток.
  5. Передача 10 мкл клеточной суспензии в небольшой трубки, смешать с 10 мкл трипанового синего (разведение 1: 1) и подсчитать количество жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра.
    Примечание: В этот момент часть клеточной суспензии могут также быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, чтобы оценить размер ячейки, детализации и, если желательно ограниченное число маркеров субпопуляций для получения дополнительной PRECISE оценка относительного распределения клеток в гомогенате до всестороннего анализа или эксперимента. Все анализы методом проточной цитометрии включают CD45 маркировки для нормализации субпопуляции.
  6. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки из опухоли, NANT, или нормальной ткани готовы к дальнейшей очистки или анализа. Эти дополнительные шаги лучше всего, когда выполняется в тот же день, как операции.
    Примечание: Для анализа проточной цитометрии, но не сортировки клеток остаточные красные кровяные клетки лизируют следует после мечения антител путем добавления 0,4 мл буфера для лизиса клеток красных кровяных к осадку клеток, сразу же встряхиванием в течение 1 сек и инкубации минимум 10 мин при комнатной Температура (в защищенном от света) перед анализом.

3. Уточнение ткани супернатанта

  1. Центрифуга трубки 1,5 мл тканевой SN при 15000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
  2. Осторожно снимите тон супернатант, не касаясь или нарушая гранул. Передача в чистую пробирку (или труб), в зависимости от количества и объема аликвоты желаемых.
  3. Хранить надосадочную жидкость при температуре -80 ° С для последующего использования.

4. Пациент крови

  1. Возьмите образец крови от каждого пациента в качестве контроля из вены в гепаринизированные труб день до операции. Центрифуга крови при 400 х г в течение 10 мин при 20 ° С с тормозом выключения для получения плазмы и лейкоцитарной пленки.
  2. Удалить плазму и уточнения его центрифугированием при 10000 х г в течение 15 мин при 20 ° С. Аликвоты и хранить в плазме при -80 ° С для последующего использования. Развести Баффи пальто в среде
  3. Отделите мононуклеарных клеток, используя стандартные Ficoll-гипак центрифугирование в градиенте до немедленного анализа, выделения субпопуляции, ДНК / РНК / извлечения белка или криоконсервации.

5. проточной цитометрии

  1. Этикетка клетки в соответствии с производстваИнструкция по R, при 4 ° С, в защищенном от света месте. Лизировать красные кровяные клетки в суспензии клеток из фрагментов ткани после маркировки антител путем добавления 0,4 мл клеточной буфера для лизиса к осадку клеток.
  2. Вихревой сразу же в течение 1 сек и инкубировать минимум 10 мин при комнатной температуре, в защищенном от света. Проходят меченых клеток в проточной цитометрии для сбора данных без промывки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переваривание ферментом фрагментов ткани с коммерчески доступными ткани диссоциации растворов или смесей различных лабораторных коллагеназы, ДНКазы и / или ингибиторов гиалуронидаза, расщеплять широкий спектр рецепторов на поверхности клеток. Наши исследования, изначально нацеленные на CD4 + Т-клетки проникают опухолей молочной железы, были быстро представлены в основных технических проблем в связи с расщеплением поверхностных CD4 рецепторов с использованием стандартных ферментативного расщепления протоколы <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование описывает оптимизированный способ быстрого приготовления нормальных и злокачественных гомогенатах ткани молочной железы без ферментативного расщепления для последующей сортировки клеток, экстракции, криоконсервации и / или фенотипического анализа CD45 + субпопуляций. Цель этого экспериментального подхода является создание образы TIL, что точно отражают их состояние в естественных условиях и сравнить их с нормальными тканями с минимальной манипуляции тканей свежих из операционной. На ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что никакого конфликта интересов не существует.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами FROMTHE Бельгийского фонда научных исследований (FNRS), Les Amis де l'Institut Борде, FNRS-операции Télévie, плана раке Бельгии, Fonds Ламбо-Marteaux, Fonds JC Heuson и Fonds Барсы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Диссоциатор GentleMacsMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine является чем-то эквивалентом
центрифуги 5810 REppendorfили другой стандартной настольной центрифуги
Centrifuge 5417 REppendorfили другой стандартной микроцентрифуги
Esco Class II A2 Biosafety CabinetESCO globalили другого стандарта BSL2 hood
Инвертированный микроскопNikon eclipse TS100или другой микроскоп, совместимый с гемацитометром
Bü rker ChamberMarienfield 640210или другой стандартный гемацитометр
Navios Проточный цитометрBeckman Coulterили другой проточный цитометр (рекомендуется 8-10 цвет)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine использует Filcon
Cell Culture CupSarstedt72,710или другую непирогенную пластиковую посуду
Одноразовый скальпельSwann-Morton0510или стандартный одноразовый стерильный скальпель
BD Cell Strainer 40 µ mBecton Dickinson734-0002или другая непирогенная пластиковая посуда
BD Falcon Tube 50 млBecton Dickinson352070или другая непирогенная пластиковая посуда
BD Falcon Tube 15 млBecton Dickinson352097или другая непирогенная пластиковая посуда
BD FACS Tube 5 млBecton Dickinson352008или другая непирогенная пластиковая посуда
Sterile Pasteur Пипетка 5 млVWR612-1685или другая непирогенная пластиковая
пробирка Microfuge Tube 1,5 млEppendorf7805-00или другая непирогенная пластиковая посуда
X-vivo 20LonzaBE04-448Qрекомендуемая бессывороточная среда
Фосфат буферный физиологический LonzaBE17-516Fстандартный физиологический PBS
Trypan синийVWR17942Eили другое жизненно важное пятно
VersaLyseBeckman CoulterA09777для экспериментов по проточной цитометрии
Поправимая жизнеспособность красителя eFluor 780eBioscience65-0865-14для экспериментов по проточной цитометрии
Anti-CD3 FITCBD Biosciences345763для экспериментов по проточной цитометрии
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363для экспериментов
по проточной цитометрииanti-CD4 PEBD Biosciences345769для экспериментов по проточной цитометрии
anti-CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232для экспериментов с проточной цитометрией
anti-CD8 ECD BeckmanCoulter737659для экспериментов с проточной цитометрией
anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774для экспериментов с проточной цитометрией
anti-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643для экспериментов с проточной цитометрией
anti-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906для экспериментов с проточной цитометрией
, , , ,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229(2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tissue HomogenizationMechanical DissociationLymphocyte IsolationFlow CytometryCell ViabilityCD45 Positive CellsTissue SupernatantCytokine AnalysisBreast TissueCell Recovery

Похожие статьи