Радиальная Мобильность и цитотоксическую функцию ретровирусных Репликация Векторный Трансдуцированные неприлипшие Alloresponsive Т-лимфоцитов

Summary

Мы описываем протокол мониторинга радиальной подвижности неадгезивных иммунных клеток in vitro с использованием клеточного седифольда/слайдового аппарата. Миграция клеток отслеживается на монослоях опухолевых клеток или на белках внеклеточного матрикса. Исследование с помощью световой и флуоресцентной микроскопии позволяет наблюдать подвижность клеток и цитотоксическую функциональность.

Abstract

Мы сообщаем о новой адаптации радиального монослойной клеточной миграции анализа, впервые сообщили для измерения радиального миграцию адгезивных клеток опухоли на белки внеклеточного матрикса, для измерения моторику флуоресцентно меченных клеток иммунной системы, не соблюдают человека или мышиный эффекторных. Этот метод использует коллектор из нержавеющей стали и 10-а тефлон слайд централизовано хранение неадгезированных Т-клеток в лунки составляться либо сливающихся монослоев опухолевых клеток или белков внеклеточного матрикса. Свет и / или многоканального флуоресцентной микроскопии используется, чтобы отслеживать движение и поведение эффекторных клеток в течение долгого времени. Флуоресцентные красители и / или вирусные векторы, которые кодируют для люминесцентных трансгенов, используемые для по-разному маркировать типы клеток, для работы с изображениями. Этот метод отличается от аналогичного типа в анализах пробирке, которые отслеживают горизонтальную или вертикальную миграцию / вторжение с использованием камеры слайдов, агар или Transwell пластин. Анализ позволяет подробные данные отображения бе собирали с различными типами клеток, отличающихся от конкретных флуоресцентных маркеров; даже конкретные субпопуляции клеток (то есть, трансдуцировали / nontransduced) можно контролировать. Поверхностные интенсивность флуоресценции участки формируются с использованием конкретных каналов флуоресценции, которые соответствуют типу Миграция клеток. Это позволяет лучше визуализировать неадгезивные мобильности иммунных клеток в определенное время. Можно собирать доказательства других эффекторных функций клеток, таких как цитотоксичности или передачи вирусных векторов из эффектора к клеткам-мишеням, а также. Таким образом, метод позволяет исследователям микроскопически документ от клетки к клетке взаимодействия дифференциально-меченого неприлипшие с прикрепленных клеток различных типов. Такая информация может быть особенно актуально при оценке биологически-манипулировать или активированных типов иммунных клеток, где наглядное доказательство функциональности желательно с опухолевых клеток-мишеней перед их использованием для лечения рака.

Introduction

Радиальная однослойная миграция клеток для анализа был первоначально разработан для измерения инфильтративные свойства адгезивных клеток опухоли ^1-4 на предметные стекла, покрытые внеклеточного матрикса (ECM) белков ^5-7 или отдельных компонентов ECM, таких как фибронектин или ламинин ^1,2. Методика участие посева суспензии отдельных клеток опухолевых клеток в центре скважин с использованием клеток седиментации коллектор из нержавеющей стали (CSM). После седиментации, опухолевые клетки будут прилипать к нижней части скважины и изменению диаметра исходной клеточной популяции с течением времени был использован, чтобы установить скорость горизонтальной подвижности. Радиальная однослойная миграция клеток для анализа обеспечили визуальную преимущество перед другими существующими методами, которые использовали Transwell пластины для анализа в пробирке мигрирующих возможности клеток; Эти анализы не являются благоприятной для визуализации ^8. Кроме того, он также предоставил большое количество свободы в выборе временной точкех годов, когда миграция оценивается, без ограничения по количеству временные интервалы исследователь может выбрать изображения после осаждения.

Поскольку способность к миграции является важным функциональность для не-адгезивные клетки, особенно в области иммунотерапии или где они могут быть использованы в качестве средств доставки вирусных векторов, мы адаптировали использование CSM для оценки миграции неприлипающими клетки Типы на опухолевых клеточных монослоев, в дополнение к белкам ЕСМ. Дополнительным преимуществом микроскопом визуализации миграцию без прикрепленных клеток на жизнеспособных опухолевых клеток монослоев, на комплексном ECM, выделенной из опухолей, или на отдельные компоненты ECM делает этот анализ универсальным. Анализы, которые используют лунки, покрытые с одной внеклеточной белка не отражают точно ECM тканей субстрата или опухоль клетки будут мигрировать через в естественных условиях.

Здесь мы использовали аллореактивными цитотоксические T-лимфоциты (alloCTL), с повышенной чувствительностью к главной histocompatibility комплекс (МНС) белки, использующие одну сторону опухоли смешанной культуры лимфоцитов клеток реакции (MLTR) или смешанные реакции лимфоцитов (MLR) ^9, как наш представитель неприлипающими типа клеток. Мы протестировали клетки человека, так и мышиный происхождения. При миграции измеряли на опухолевых монослоев, опухолевые клетки, используемые были либо частично соответствующих целей, показывая некоторые из тех же белков МНС, найденных на клеточной популяции, используемого для сенсибилизации эффекторы или полностью соответствующие цели, с полным набором молекул МНС, что эффекторы были осведомлены навстречу. В некоторых экспериментах мы использовали флуоресцентный CellTracker Red CMPTX или пролиферации клеток красителя eFluor 670 различать эффекторных и клеток-мишеней. Мы также использовали трансдукции кодирования вирусных векторов для флуоресцентных белков в качестве дополнительного способа визуализации клеток. Для некоторых анализов, мы трансдуцировали alloCTL с ретровирусных векторов реплицирующихся (макака), кодирующих изумрудно-зеленый (EMD) флуоресцентного белка ^10,11; для дрERS, опухолевые клетки трансдуцированных лентивирусов векторов, кодирующих mStrawberry.

AlloCTL высевают через канал коллектора в центре либо монослоев опухолевых клеток или ECM, собранных с опухолевых клеток монослоя. Адгезивные и не прилипшие межклеточных взаимодействий были визуализированы с помощью света и / или с помощью флуоресцентной микроскопии с течением времени. Нарушения в опухолевых клеток монослоя на малой мощности, или опухолевые клетки с фрагментированными ядрами при высокой мощности были показатели повреждения клеток в результате лизиса и апоптоза, соответственно. Мы цифровой создал интенсивности поверхностного дневного карты, показывающие миграции неприлипающих флуоресцирующий Т-клеток над однослойных культур. Мы также отметили, цитотоксичность гендерная проблематика, клейкой монослоя глиомы клеток после формирования кластерной накладным неадгезированных alloCTL. Кроме того, было отмечено горизонтальной трансдукция RRV-EMD от alloCTL к глиомы монослоя.

Protocol

1. Презентация Подготовка

1. Вставьте сотовый седиментации в коллекторе слайды в мешочки стерилизации и печать с автоклава ленты. Лицо с тефлоновым покрытием сторону слайд бумаги сторона мешка, чтобы избежать пластиковые отложений на скважинах.
2. Автоклав мешки течение 15 мин при 121 ° С.
3. Удалить слайд из стерилизации сумке в шкафу биобезопасности и место в стерильной 150 х 15 мм стерильную чашку Петри. До четырех слайдов может поместиться на чашку. Поставьте 35 х 10 мм чашки Петри рядом с горками. Добавьте 2-3 мл стерильного H ₂ O, чтобы обеспечить увлажнение.
4. Pre-пальто слайды с поли-D-лизина в 100 мкг / мл с помощью достаточного объема для покрытия всей скважины. После одного часа при комнатной температуре, аспирации раствора и промыть поверхность и два раза с помощью пипетки 1X PBS на поверхности лунки.
5. При желании можно добавить фибронектин и другие компоненты ECM, чтобы обеспечить сильную приверженность опухолевых клеток. Добавить фибронектин в 5 мкг / мл в достаточно объемной Thaт в лунки не высохнет в течение короткого периода времени при комнатной температуре.
   1. После 1 ч, аспирации остатки раствора и промыть в два раза с помощью пипетки вверх и вниз с 1x PBS.
6. Держите PBS на скважинах до опухоли не готов к обшивке. Слайды тот же день.
7. Урожай сливающийся колбу желаемого приверженцем типа опухолевых клеток. Количество жизнеспособных клеток с использованием красителя исключение трипанового синего с помощью световой микроскопии и ресуспендируют в 5 × 10 ⁶ клеток / мл в адекватно-буферном роста средней например, минимальная поддерживающая среда Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), L- глутамина и пирувата натрия.
8. Если флуоресцентные изображения из клейкого клеточной популяции желательно, маркер прилипшие клеточной популяции с жизненно флуоресцентным красителем или краской пролиферации клеток следующие протоколы, предусмотренные изготовителем.
9. Плавно пипетки 10 мкл полной среды в каждую лунку слайд заботясь, чтобы избежать образования пузырьков в вэйLs, так как они могут предотвратить равномерное соблюдение опухолевых клеток.
10. Добавить 2,5-5,0 × 10 ⁴ клеток (5-10 мкл клеточной суспензии) в среде в каждой лунке (фиг.1А). Регулировка оптимального количества в зависимости от типа опухолевых клеток и числом дней роста желаемых. Большие опухолевые клетки или быстро растущие клетки может потребовать меньше клеток на начальном этапе. Доведите объем также до 40 мкл добавлением среды и пипетку вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
11. После того как все колодцы высевают, позволяют опухолевые клетки придерживаться при комнатной температуре, а затем поместите крышку на 150 х 15 мм чашки Петри и тщательно перемещайте антенну в 37 ° C / 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе в течение по крайней мере 24 часов.
12. Изменение культуральную среду в день. Тщательно пипетки часть отработанного среды из монослоя и заменить свежей полной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за испарения, больший объем нужно будет добавить, чем был вывезен. Wells будет готов для анализа, когда даже confluent слой клеток присутствует. Это, как правило, через 1-3 дней после первоначального посева.
13. Промыть монослой осторожно один раз PBS, как описано в стадии 1,4 и либо перейти к шагу 2, если монослои желании или к шагу 1,13 ниже, чтобы извлечь белков ЕСМ в монослое.
14. Сделать 0,5% Тритон-X (об / об) раствор в полной среде и добавить 30 мкл в каждую лунку. Пусть монослой переварить в капот в течение 2 мин, а затем дважды промывали полной средой с помощью пипетки, как описано выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ECM слой может быть видимым с помощью световой микроскопии (рис 2). Используйте слайды сразу, или держать в полной среде в увлажненной CO ₂ инкубаторе в течение 1-2 дней. Не позволяйте лункам высыхать.

2. Осаждение неадгезированных Т-клеток на слайд

1. Если флуоресцентный томография неадгезированных клеточной популяции желательно, маркировать неадгезированных клеточных популяций с жизненной флуоресцентного красителя, таких как CFSE, сотовый Tracker Красной CMPTX или eFluor670, следуя протоколы, предусмотренные заводом-изготовителем, по крайней мере 1 час до начала анализа. С другой стороны, манипуляции, чтобы экспрессировать флуоресцентные белки, кодируемые вирусные векторы.
2. Автоклав сотового оседания коллектор в автоклаве сумке, как описано в разделе 1.2 выше.
3. Снимите влажной камере, содержащей тефлоновым покрытием слайды из инкубатора и место в кабинете биологической безопасности.
4. Промыть скважин с 1x PBS с помощью пипетки вверх и вниз, а затем добавить 45 мкл полной среде, содержащей, по меньшей мере 10% сыворотки.
5. Удалить коллектор из конверта стерилизации и тщательно скользить в течение скважин до "крючок" в конце коллектора касается нижней части ползуна (Фиг.1В).
6. Убедитесь, что культуральная среда видна в каждом из каналов. Если ничего не видели, снять коллектор и добавить больше средних и соответствующую лунку, то заменить и проверить еще раз.
7. Повторите шаг 2,5 для каждого чанNel коллектора, или на столько скважин по желанию.
8. Граф неадгезированных клетки и ресуспендируют в размере не менее 1,0-2,0 х 10 ⁵ / мкл. Составьте 1 мкл клеток и медленно пипетки их в канал (рис 1в). Сделайте это для каждой скважины лучшего.
9. Оставьте весь загруженный устройство клеток, то есть, коллектор и слайд, внутри биологической капотом в течение 20-30 мин, чтобы клетки в канале осесть.
10. Снимите коллектор, касаясь обеих сторон и аккуратно поднимите вертикально вверх от слайда, чтобы не нарушить клетки очагово высевают в центре скважин (рис 1D).
11. Проверить каждую лунку, чтобы гарантировать, что не-адгезивные клетки были успешно высевают в центре и оставаясь в пределах окружности коллектора канала. В не-адгезивные клетки в идеале немного прилипать к монослоя или ECM и друг к другу, поэтому аккуратно перемещая выпасть не вызывают клеточный Pelleт расходиться. Не толкаться слайда.

3. флуоресцентной микроскопии

1. При соответствующем экспериментальном оборудовании, выполните визуализацию после оседания подтверждается. В идеале, использовать микроскоп, оснащенный камерой СО ₂ и влажности. Изображение на малой мощности, т.е. 4X или 10X, чтобы обеспечить несколько изображений, которые будут приняты большей площади, так что полнота скважины могут быть видны.
2. Приобретать цифровых изображений с помощью программного обеспечения для съемки. Выполните светлого поля и / или изображений многоканальный флуоресценции.
3. При желании, настроить покадровой записи изображения в различных каналов, по той или иной области, или оставить слайд увлажняется и в 37 ° C / 5% CO ₂ инкубатора и вручную вывести на изображении в точках желаемое время (рис 1Е и F, рекомендуется для более длительных).

4. Анализ и отображение

1. Использование ПО для редактирования изображений, объединить свет и ЭПuorescent изображения в один слой, так что несколько типов клеток и маркеров можно увидеть в том же изображении. Перетащите файлы изображений для каждого отдельного цвета в программе и, когда будет предложено, выберите опцию «Добавить слой", чтобы создать файл изображения с несколькими слоями.
   1. При большем увеличении, взять, выравнивания и склеивать изображения через скважины в цифровом виде. Выравнивание файлы, глядя на консервативных областей между двумя изображениями, и не накладывая одно изображение на верхней части другой, пока полное изображение генерируется.
2. Добавить микрон баров на изображения во время съемки с использованием программного обеспечения захвата для определения расстояния отдельные клетки мигрировали.
3. Для определения миграции клеток в различные моменты времени, делать карты интенсивности флуоресценции поверхность с программным обеспечением обработки изображений, т.е. ImageJ, количественно флуоресцентный агрегации или разнести во времени Т-клеток.
   1. Для создания графики поверхностей, принять слоистую изображение, созданное на шаге 4.1 и под окном Layers,снять все слои, кроме тех, соответствующих каналу желаемого. Например, если поверхность участка желательно, чтобы визуализировать выражение EMD, только «зеленые» слои, соответствующие фильтру, используемого для этого маркера должны быть видны.
   2. Свести изображение и сохранить его в формате, признанного (например, .png) и загрузить изображение в программу. Для создания поверхности сюжет, изменить тип изображения с 8-бит, изменить яркость / контрастность, сколько необходимо для уменьшения фона и выберите опцию "Анализ / Площадь участка». Изображения на рисунке 5, путем проверки "Тень", "Нарисуйте ось ',' один полигон на линии ', и' Smooth 'флажки.
   3. Кроме того, выполнять измерения, используя радиус или диаметр от месторождения фокальной клеток в нулевой момент времени и сравнить с клетками в крайнюю точку в различные моменты времени. Диаметр тефлоновой скважин 6,0 мм.

Results

Вирусные векторы, кодирующие флуоресцентные белки могут быть использованы в дополнение к, или вместо, флуоресцентным красителем. Вирусный трансдукция должны быть выполнены до начала моторики анализа. Как адгезивные и не адгезивные типы клеток могут быть дифференциально-меченных. Протокол трансдукции будет зависеть от типа используемого вектора. Здесь мы трансдуцировали alloCTL в цифрах 3, 5 и 6 с RRV-EMD по крайней мере два дня до начала анализа, используя протокол, описанный ^12.

Discussion

Опухолевые клетки в суспензии отдельных клеток пипеткой в ​​лунки тефлоном маскируется слайда. Клетки дают возможность прилипать, а затем формируется монослоев в увлажненной 5% CO _2, 37 ° С инкубатор (фиг.1А). Установленные монослои или ECM белки, полученные из монослоя могут быть собраны для этих анализов (фиг.1В). Эффекторные Т-лимфоциты, помеченные витальных красителей люминесцентных или трансдуцированные векторов, кодирующих EMD высевают в центре скважины с использованием...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Предметные стекла микроскопа с тефлоновой маскировкой	научные методы	CSM002
коллектор для осаждения клеток	творческие научные методы	, чашка Петри
, чашка Петри, 150 мм	Corning	430597
чашка Петри, 35 мм	Corning	430588
фосфатно-солевой буфер (PBS)	Mediatech	21-040
20 μ l Пипетман	Гилсон	F123600
200 μ l Пипетман	Гилсон	F123601
200 μ l наконечники для пипеток	VWR	89003-060
Дистиллированная, деионизированная вода (стерильная)	Mediatech	25-055
Trypsin	Mediatech	25-054-CL
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (опционально)	Gibco	12604
Среда для культивирования опухолевых клеток (например DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V Сыворотка бессывороточная	Invitrogen	12055-083
Фетальная бычья сыворотка	Omega Scientific	FB-02
Инвертированный микроскоп
SPOT Advanced	Diagnostic Instruments
Poly-D-лизин Millipore		A-003-E
Фибронектин	BD	354008
31/2 x 51/4 Autoclave Pouches	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Пролиферация клеток eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH