Крыса Гетеротопическая животе Сердце / Трансплантация одного легкого в объеме загружены Configuration

Краткое содержание

Мы описываем новую технику гетеротопической абдоминальной трансплантации сердца и легких (HAHLT) у крыс. Конфигурация трансплантата приводит к частичной нагрузке кровообращения трансплантата, что позволяет проводить прямую функциональную оценку. Эта модель может быть использована для острых или хронических исследований функции и иммунологического статуса трансплантированного трансплантата.

Аннотация

Здесь мы описываем новую технику гетеротопической абдоминальной трансплантации сердца и легких (HAHLT) у крыс. Конфигурация трансплантата включает в себя анастомоз нижней полой вены (НПВ) донора до реципиента НПВ и восходящей аорты донора (Ао) до абдоминального аорты реципиента Ао. Правая, верхняя и средняя доли легких сохраняются и функционируют как каналы для кровотока от правого сердца к левому.

У использования этого метода есть несколько преимуществ, и он подходит для широкого спектра применений. Поскольку трансплантат трансплантируется в конфигурации, обеспечивающей динамическую объемную нагрузку, сердечная функция может быть непосредственно оценена in vivo. Использование катетеров для измерения давления-объема проводимости позволяет определить характеристики гемодинамических параметров, зависящих от нагрузки и не зависящих от нагрузки. Трансплантат может быть преобразован в нагруженную конфигурацию путем наложения зажима на инфрапеченочный НПВ реципиента. Мы описываем модифицированные хирургические методы как для донорских, так и для реципиентных операций, а также идеальную стратегию защиты миокарда. В зависимости от цели эксперимента эта модель может быть адаптирована для использования как в острых, так и в хронических исследованиях функции трансплантата, иммунологического статуса и условий переменной нагрузки на желудочки. Проводящие дыхательные пути к трансплантированному легкому сохраняются и позволяют проводить острую ревентиляцию легких. Это облегчает анализ эффектов смешанной венозной и артериальной крови, обеспечивающей коронарную перфузию трансплантата.

Ограничением этой модели является ее техническая сложность. Существует значительная кривая обучения для новых операторов, которые в идеале должны быть наставниками в этой технике. Хирургическая подготовка выгодна для тех, кто хочет применять эту модель. Несмотря на свою сложность, мы стремимся представить модель в понятном и легко применимом формате. Из-за физиологического сходства этой модели с ортотопической трансплантацией и широкого спектра ее исследовательских применений, усилия, вложенные в изучение этой техники, вероятно, будут оправданы.

Введение

Первая модель гетеротопической трансплантации брюшного сердца (HAHT) у грызунов была описана Эбботтом и коллегами в 1964 году¹. Этот метод и последующие модификации широко применялись для характеристики функции трансплантата и иммунологического статуса. Большинство описанных методов HAHT включают работу сердца без объемной нагрузки^2,3. Были описаны модели HAHT с участием желудочков, нагруженных объемом, но они часто ограничены в одном или нескольких отношениях.

Ранее была описана гетеротопическая абдоминальная трансплантация сердца и легких (HAHLT) с объемным левым желудочком (ЛЖ). Chen и коллеги⁴, а затем Ibrahim и коллеги⁵ описали HAHLT с помощью одного аорто-аортального (донорский восходящий к реципиентной брюшной аорте) анастомоза. Единственной объемной нагрузкой, предъявляемой к желудочку в этом круге кровообращения, является коронарный венозный возврат. Асфур и его коллеги описали метод HAHT, в котором легочный контур устранялся путем анастомозирования донорской легочной артерии (ПА) в донорское левое предсердие (ЛП)⁶. В этом кровотоке венозный приток к правому желудочку (ПЖ) происходит через донорский ВПК к реципиентному анастомозу НПВ, а последующая нагрузка ЛЖ выбрасывается в аорто-аортальный анастомоз. Сердечную функцию частично оценивали in vivo, а также in vitro с помощью установки Лангендорфа. Фигейреду и его коллеги описали модель HAHLT, похожую на нашу^{собственную 7}, но на мышах. Венозный приток к ПЖ происходит через донорский СВК к реципиенту НПВ анастомоз. В дальнейшем кровь проходит через единственный круг кровообращения, а нагрузка ЛЖ выбрасывается в аорто-аортальный анастомоз. Сердечная функция в их исследовании оценивалась с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Вэнь и его коллеги описали уникальную технику HAHT, при которой ЛЖ загружается через реципиентную аорту в донорский анастомоз LA⁸. Таким образом, ЛЖ заполняется при системном давлении. Сердечная функция, а также то, выбрасывается ли ударный объем ЛЖ антеградно в их модели, не оценивались.

Многие из методов, упомянутых выше, включают нефизиологические условия нагрузки ЛЖ, включая методы, частичная нагрузка на ЛЖ которых представлена только коронарным венозным возвратом. С другой стороны, многие методики подходят к физиологической нагрузке ЛЖ. Большинство этих методов, как и в технике Asfour и коллег, опускают легочный круг кровообращения и используют анастомоз донора PA к донорскому LA^6,9. Циркуляция крови, описанная Galinanes и^{коллегами 10}, использует прямого реципиента кавы к донорскому анастомозу LA, опуская легочное кровообращение и правые отделы сердца. Йокояма и коллеги достигают того же эффекта путем лигирования донорского ПА и создания межпредсердной связи в донорском сердце (исключая донорское легкое и правое кровообращение)¹¹. Циркуляция крови Маруямы и коллег¹² включает в себя анастомоз между левым PA донора и реципиентом Ao, что позволяет заполнять ЛЖ через легочный круг кровообращения в качестве канала, но эффективно исключает правое сердце.

В случаях, когда были соблюдены условия, близкие к физиологическим, мы совершенствуем технику HAHLT в 2 основных аспектах. Во-первых, насколько нам известно, точная конфигурация, о которой мы сообщаем, не была описана у крыс. Это, возможно, наиболее универсальное кровообращение для исследователей, желающих изучить физиологию, структуру и иммунологию трансплантированного трансплантата сердца и легких. Во-вторых, мы описываем, как функция трансплантата может быть непосредственно охарактеризована in vivo. Для этого применения катетеры с давлением-объемом проводимости могут быть введены непосредственно в верхушку ЛЖ трансплантата, что позволяет полностью оценить сердечную функциональную характеристику.

Описанный здесь метод может быть применен как к острым, так и к хроническим исследованиям функции трансплантата, в то время как функциональная оценка может быть выполнена либо in vivo, либо in vitro. Мы представляем модель, в которой условия нагрузки могут быть близкими к физиологическим, однако степенью желудочковой нагрузки можно манипулировать как остро, так и хронически, отклоняя венозный возврат к трансплантату или от него. Также можно манипулировать условиями постзагрузки. Поскольку легкое и его дыхательные пути сохраняются в этой конфигурации трансплантата, исследователи могут остро провести повторную вентиляцию донорского легкого. Уникально то, что ревентиляция легких изменяет состав крови, перфузирующей коронарные артерии трансплантата. В условиях невентиляции кровь, выбрасываемая из донорской аорты, деоксигенируется и смешивается с насыщенной кислородом кровью в аорте реципиента. В условиях острой вентиляции выброшенная кровь становится насыщенной кислородом. Таким образом, функция трансплантата может быть сравнена в условиях вентиляции и невентиляции, а также в условиях переменной нагрузки.

Приведенный ниже протокол описывает важные изменения в ранее описанных операциях донора и реципиента HAHLT. В нем также описан оптимальный метод защиты трансплантата на протяжении всего периода ишемии (время между эксплантом донора и имплантатом реципиента). Преимущества этого метода включают физиологические состояния, потенциально приближающиеся к физиологическим состояниям ортотопически трансплантированного трансплантата, а также широкий спектр исследовательских применений. Важным ограничением является его техническая сложность. При надлежащем наставничестве и практике преимущества этого метода, скорее всего, перевесят трудности при его внедрении.

Протокол

Все животные были размещены и уход в соответствии с национальными и институциональные рекомендации по уходу и использованию лабораторных животных. Утверждение этики для этого протокола был предоставлен университетом комитета по уходу за животными Британской Колумбии. Мужской, Спрэг Dawley крыс весом от 300 - 450 г были использованы для этого протокола.

Операция 1. Донор

1. У примерно в 100 мл кардиоплегии (RT) в цилиндрической колбе, подключенного к длительного внутривенного (IV) трубки катетера с помощью 3-ходовым запорным краном. Используйте подставку, чтобы поднять колбу примерно 80 см выше поверхности оперативного, позволяет доставку КАРДИОПЛЕГИИ под действием силы тяжести.
2. Для визуализации структур адекватно использовать либо пару хирургических луп или рассекает микроскоп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы в настоящее время используют бинокулярного микроскопа с операционной 3.4 - 21.3X увеличения.
3. Поместите донора в анестезиологической камеры и вызывают анестезию 4 - 5% изофлуран.
4. Перевести крысу операционной платформы и поддержания анестезии по носового конуса с 1 - 2% изофлуран. Применить ветеринар мазь для глаз животного, чтобы предотвратить сухость. Администрирование мидазолам (2 мг / кг) внутрибрюшинно с иглой 25 G.
5. Использование хирургических ножницы, брить донора от мечевидного отростка до нижней челюсти. Бритье небольшую область в левой паховой области (для последующего доступа IV). Нанесите средство для удаления волос на рабочих поверхностей, подождите примерно 5 мин, и удалить волосы с куском марли.
6. Приготовительный хирургические участки с раствором повидон-йод или chlorexidine основе (мы используем только хлоргексидин). Проникнуть инцизионная сайты с 0,1 - 0,5% лидокаина подкожно.
7. Закрепите передние конечности и левой задней конечности операционной платформе с клейкой лентой, оставляя правую задней конечности бесплатно для мониторинга глубины анестезии и жизненно важных.
8. После обеспечения надлежащего глубину анестезирующего по педали крайнем случае, сделать надрез в левой паховой складки с помощью22-лезвие скальпеля. По тупым, выставить левую общую бедренную вену и получить доступ IV следующим образом:
   1. Аккуратно убрать ткань, лежащую в бедренную вену, и иглу в вену с 24 G IV. Подключите IV в короткой длины соленой заполненные трубки IV, и закрепите трубку в месте с клейкой лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура бедренной венозной катетеризации у крыс описана в других по Jespersen и коллег ^14.
   2. Подключите солевой заполненные 10 мл шприц с трубкой IV, и мягко аспирации крови, чтобы обеспечить правильное позиционирование IV.
   3. Вводите 300 - 500 МЕ нефракционированного гепарина через трубопровод IV, а затем промойте трубки с 3 - 5 мл физиологического раствора.
9. Далее, tracheotomize донора следующим образом:
   1. Сделайте срединный разрез в мягких тканях между яремной вырезки и нижней челюсти с использованием 22-лезвие скальпеля. Проникнуть капсулу щитовидной железы в средней линии, используя МетценBaum ножницы, и отдельные его доли, использующие тупым.
   2. Использование тупым, отделить ремень мышцы шеи по средней линии, чтобы разоблачить передней поверхности трахеи.
   3. Используйте изогнутые щипцы прямо рассекать по окружности плоскости вокруг трахеи. Обхватите трахеи с 4-0 шелковый галстук.
   4. Использование диафрагмы ножницами, сделать поперечный разрез в передней трахеи, примерно 5 мм ниже щитовидного хряща. Аккуратно ввести трахеи канюли (14 г IV) и закрепите его на месте с помощью 4-0 шелковый галстук.
   5. Подключите трахеи канюли с механической ИВЛ. Перенаправление потока кислорода и изофлураном через цепь вентилятора, и проветрите донора в размере и дыхательного объема прогнозируемого своим весом ^13.
10. Сделайте надрез по средней линии груди (с использованием 22-лезвие скальпеля), расширяя разрез на яремной выемкой ниже в xipisternum.
11. Пребывание в средней линии, Выполните средний стернотомию используя резак кости. Уберите края грудины с самоудерживающийся втягивающим. Введите перикарда и плевральной полости.
12. Выполните тимэктомия. Проще всего сначала тупо разделить тимус в средней линии, а затем отделить его от окружающих структур, используя комбинацию тупым и острым рассечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: происхождение внутренних грудных артерий может быть ранен, когда рассекает тимуса от вышестоящих грудных ребер. Чтобы предотвратить кровотечение, кровоостанавливающие зажимы могут быть применены перед удалением тимуса в этих точках.
13. Использование Metzenbaum ножницы и / или резкое Лауэр, рассекают пригородных вены жира от нижней полой вены (НПВ). Убедитесь, что ИВЦ является относительно свободной от жира и соединительной ткани от каво-предсердий перехода сверху, с диафрагмой книзу.
14. Используя острый Лауэр, по окружности бесплатно верхней полой вены (ВПВ) и окружить его с 4-0 шелковый галстук.
15. Далее, рассекатьосталось полой вены свободной от окружающих структур, и перевязывать его проксимально и дистально с 4-0 шелковых галстуков. Резецировать вмешиваясь часть вены, чтобы выставить левую подключичную артерию.
16. По окружности бесплатно дуги аорты суда, использующие резкое Лауэр. Применить проксимальных и дистальных хирургические зажимы в безымянной артерии, и разделить его между клипами. Оставьте левую общую сонную артерию и левой подключичной артерии ООН-обрезанную.
17. Далее, иглу ВПВ с катетером 24 G IV. Закрепите катетер с ранее размещенных 4-0 шелковый галстук.
18. Подготовка к целесообразной, но нежным урожая трансплантата.
19. Использование острыми ножницами, разделить IVC просто превосходит поверхности диафрагмы. Разделите SVC превосходит его катетеризации сайте, гарантируя, что около структуры дыхательных путей не пострадал.
20. Выключите вентилятор и отсоедините трахеи канюли. Трансекте трахеи проксимально.
21. Возьмитесь за перерезают трахеи пинцетом и удалить сердцеи легкие блочный. Это потребует нежное сцепление с резким вскрытия, как трансплантат сердца легких удаляется. Отделите трахею от основной пищевода. Не повредить нисходящей аорты, так что длинные часть его остается неизменным после сбора урожая.

2. Подготовка сердце-легкие трансплантат

ПРИМЕЧАНИЕ: время завершения этой части процедуры, помощник должен быть обезболивающее грызунов получателя и готовится к имплантации трансплантата.

1. Поместите трансплантат сердца легких на хирургическое марли с передней поверхности сердца, обращенной вниз. Использование острый рассечение, удалить остатки пищевод, избегая травм задних дыхательных путей.
2. Найдите нисходящей грудной аорты и вставьте 16 G тупым наконечником канюли. Закрепите канюли в месте с 4-0 шелковый галстук.
3. Найдите дуги аорты сосудов, и применить хирургическое клип на левой подключичной артерии. Оставьте левую сонную артерию ООН отсечение субсеквенция де-проветривание.
4. Администрирование первая доза кардиоплегии при подключении труб кардиоплегии в аорты канюли 16 G. Сонной артерии должны быть временно окклюзии щипцами, чтобы обеспечить адекватную доставку кардиоплегии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: польза от аорты канюли прилагается, что кардиоплегию можно вводить непрерывно и / или периодически, как желательно. Для прерывистого дозирования, мы обычно доставить КАРДИОПЛЕГИИ каждый 10 - 15 мин в 5 мл болюсов в течение 30 - 45 сек.
5. Использование Metzenbaum ножницы и / или резкое Лауэр, рассекают пери-аортальный жир от аорты. Убедитесь, что аорта относительно свободной от жира и соединительной ткани от левой подключичной артерии (дистальный) арки к ее катетеризации сайта.
6. Далее, выставить левую mainstem бронхов, используя острый Лауэр, и перевязывать его проксимально с 4-0 шелковый галстук. Трансекте левого бронха дистальнее лигатуры, используя диафрагмы ножницы. Выполните левый пневмонэктомии путем лигирования левой легочнойартерии и вены с 4-0 шелковых галстуков. Трансекте дистальнее лигатуры и удалить левое легкое.
7. Как указано выше, удалить все другие долей легких, за исключением правых верхних и средних долей. Избегайте ранив IVC в процессе выполнения lobectomies.
8. Подключите шланг к кардиоплегии аорты канюли и управлять непрерывный кардиоплегии в то время как получатель готовится. Поместите трансплантат сердца легких в стерильный контейнер (например, стакана).

3. Получатель Эксплуатация

1. Обезболить получатель, как в работе доноров, выше. Используйте ветеринар мазь для защиты глаз животного от сухости. Подтвердите анестезии часто по педали крайнем случае.
2. Поместите животное, как в работе доноров, на этот раз оставляя правую переднюю конечность свободное контролировать жизненно важные признаки и глубины анестезии.
3. Бритье живот от мечевидного отростка к пенису. Бритье небольшую область в левой паховой области (для последующего доступа IV). Применитьэпиляции агента в рабочих поверхностей, подождите примерно 5 мин, и удалить волосы с куском марли.
4. Приготовительный хирургические участки с повидон-йодом или chlorexidine-решения. Проникнуть инцизионная сайты с 0,1 - 0,5% лидокаина подкожно.
5. Tracheotomize и проветрите получателя, как указано выше. Кроме того, поддерживать емкость под нос конуса анестезии.
6. Ввести катетер в бедренную вену, как описано выше. Вводите 300 - 500 МЕ нефракционированного гепарина через трубопровод IV, а затем промойте трубки с 3 - 5 мл физиологического раствора.
7. Выполните лапаротомии путем срединный разрез брюшной с 22 лезвиями скальпеля от мечевидного отростка к пенису. Уберите брюшной стенки с использованием самоудерживающийся втягивающим. Далее, убрать кишечника сверху и слева крысы. Оберните их в теплой соленой, пропитанной марли.
8. Expose аорты IVC и брюшной резким рассекает через вышележащие ReТро-перитонеального жира.
9. Есть изогнутый зажим судно доступны и готовы.
10. По окружности освободить IVC и аорты проксимально и дистально и окружить их с 4-0 шелковых галстуков. Там должно быть примерно 2 - 3 см пространства между этими сайтами.
11. Осторожно применять изогнутые зажим сосудов, обеспечивая достаточную часть как IVC и аорты подвергаются выше челюстей зажима.
12. Сделать разрез в передней стенке нижней полой вены с иглой 25 G, подключенного к физиологическим заполненные 1 мл шприца. Расширьте разрез с ножницами Поттс, чтобы соответствовать длине донора IVC отверстия.
13. Удалить трансплантат сердца легких из контейнера и отключите его от кардиоплегии. Поместите трансплантата в животе получателя в оптимальном положении для выполнения венозный анастомоз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: трансплантата сердце-легкое, в конечном счете быть ориентированы наклонно немного, с вершины указывая на живот годов в левом нижнем квадранте.
14. Безопасный каблуки ног заканчивается анастомоза с 9-0 нейлона шва. Tie безопасное узел на каждом конце, в результате чего иглу, прикрепленную к длинного плеча шва, а короткий конец нити, чтобы быть привязаны к позже. Администрирование дозу кардиоплегии.
15. В управлении моде, полная половина линии шва и галстук на противоположной короткой шва руку. Администрирование дозу кардиоплегии.
16. Заполните вторую половину шва и связать его вниз. Венозный анастомоз завершена. Администрирование дозу кардиоплегии
17. Восточный трансплантата сердце-легкое с верхушки указывая сердца к живота годов в левом нижнем квадранте. Убедитесь, что венозная анастомоза не перекручен или витой.
18. Оценить длину донорской аорты, которые будут необходимы для достижения аорты получатель, поддерживая как IVC и аорты анастомозов в натяжных свободной и снимите с изломом конфигураций.
19. Разделите нисходящую аорту (дистальнее левой подключичной артерии) с ножницами ириса.
20. Сделать incisioн в передней стенке аорты реципиента с иглой 25 G, подключенного к физиологическим заполненные 1 мл шприца. Расширьте разрез с ножницами Поттс, чтобы соответствовать длине донора аорты отверстия.
21. Закрепите палец (выше аспект) донора аорты получателю аорты с помощью 9-0 нейлона шов в. Затем пропустите иглу в медиальной части аорты и завершить половину анастомоза в управлении моду.
22. В пятой аорты анастомоза, обратный ориентацию линии шва (перехода в направлении строчки), и завершить боковую половину анастомоза в управлении моду.
23. Медленно снимите IV катетер в ВПВ, и перевязывать ВПВ с хирургической клипа.
24. Де-воздух аорты путем размещения не-обрезается левой общей сонной артерии. Удерживая артерию открытой, в вертикальном положении, что позволит воздуху свободно эвакуировать.
25. Кратко открыть челюсти изогнутой зажима сосуда и позволяют сонной артерии кровотечение (dе-воздух) для 2 - 3 сек. Re-применять зажим сосудов.
26. Нанесите хирургического клип на сонной артерии. Снимите изогнутый зажим сосудов.
27. Проверьте кровотечение шовных линий. Если присутствует, нежный сжатие с хирургической марли или ремонта длиной 9-0 нейлоновой нити (в зависимости от интенсивности кровотечения).
28. Донорское сердце должно возобновить избиения в течение нескольких минут.
29. Обратите пристальное внимание на жизненно важных получателя, глубины анестезии, и управлять громкости реанимации мере необходимости.
30. В зависимости от экспериментальных конечных точек, либо закрыть живот животного, и пусть он оправиться от наркоза, или подготовить животное для сердечно-сосудистой оценке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры оценки трансплантата включают в естественных мер в зависимости от нагрузки и нагрузки зависит гемодинамики, меры в пробирке функции в Langendorff и режимы работы сердца, и (в хирургии выживания) эхокардиографии или МРТ исследования.
31. Наконец острых терминальных экспериментов, животные эвтаназии кровопусканием.

Результаты

Техника HAHLT описано выше, сугубо технический и требует пристального внимания к деталям. Таблица 1 приведены некоторые из ключевых факторов, связанных с успешным по сравнению с неудачных процедур, и могут быть использованы в качестве руководства для устранения неполадок с техническими трудностями.

После аорты получатель unclamped, привитые коронарных артерий следует рассматривать заполнить кислородом крови. Соответственно, миокард должен стать розовый и хорошо перфузии. В т...

Обсуждение

Успех с методикой, описанной здесь будет основываться на нескольких факторах. Ключевой среди них будет обеспечение стабильности как доноров, так и получателей животных, приняв тщательного технику операции, что является безопасным и ассоциируется с минимальной кровопотерей, обеспечивая полную кардиоплегический арест с равномерным охлаждением трансплантата, минимизируя общее время ишемического и адекватно де-трансляция трансплантата. Как признается выше, техническая сложность техники является ее главным ограничением.

...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Celsior Cardioplegic Soution	Genzyme		Раствор держится на льду на протяжении всей процедуры. Мы готовим собственное решение, с небольшими изменениями.
Аппарат искусственной вентиляции легких для грызунов	Гарвардский аппарат	модели 683
Монитор жизненно важных показателей	Nonin	модели 9847V	отображает SpO2 и частоту сердечных сокращений.
Канюли для внутривенных вливаний	Jelco	3063	24 - 26 G x 3/4" канюли.
Уход за трубками для внутривенных вливанийFusion		MP9259-C	Короткая соединительная трубка (18 см).
Хирургические клипсы	Teleflex Medical	001204	титановые лигирующие клипсы Horizon.
Шовные материалы	Ethicon, Sharpoint	LA54G, AK-0107	3-0 шелковая катушка и 9-0 проленовая шовная нить (однорукая, игла DR5).
Хирургические инструменты	не применимы	Не применимы	Используемые инструменты являются универсальными и могут быть приобретены в любой компании-поставщике хирургических материалов.