Запись Light-вызывала постсинаптические реакции нейронов темно-адаптированных, мышь сетчатки ломтик препаратов с использованием методов локальной фиксации

Краткое содержание

Мы продемонстрируем, как приготовить срезы сетчатки из глаза мыши и записать световые реакции в нейронах сетчатки. Вся процедура проводится в условиях, адаптированных к темноте.

Аннотация

Сетчатка является воротами в зрительной системе. Чтобы понять, визуальные механизмы обработки сигнала, мы исследуем функции сетчатки нейронных сетей. Нейронов сетчатки в сети включают в себя многочисленные подтипы. Более 10 подтипов биполярных клеток, ганглиозных клеток и амакринных клеток были определены морфологических исследований. Несколько подтипов нейронов сетчатки, как полагают, кодируют различные особенности визуального сигналов, таких, как движение и цвет, и форма несколько нервных путей. Тем не менее, функциональные роли каждого нейрона в визуальной обработки сигнала, полностью не поняты. Метод локальной фиксации полезно для решения этой фундаментальный вопрос. Здесь протокол к записи легкие, вызвали синаптические реакции в мышиных нейронов сетчатки с использованием локальной фиксации записи в темно-адаптированы условиях предоставлена. Глаза мыши темно-адаптированы O / N, и сетчатки препараты ломтик расчленены в темной комнате с помощью инфракрасного освещения и зрителей. Инфракрасный свет неактивировать фоторецепторы мыши и, таким образом, сохраняет свой свет реагировать. Патч зажим используется для записи световых вызвали ответы в нейроны сетчатки. Флуоресцентный краситель вводится и в процессе записи, чтобы характеризующих нейронов морфологические подтипы. Эта процедура позволяет определить физиологические функции каждого нейрона в сетчатке мыши.

Введение

Сетчатка — одна из уникальных частей нервной системы. Поскольку он является доступной частью мозга, его синаптическая архитектура хорошо охарактеризована. Кроме того, функции этой нейронной сети можно исследовать с помощью физиологического стимула: света. Если ткань сетчатки изолировать в темном помещении с помощью соответствующих процедур, нейроны в ткани будут реагировать на свет. Этот препарат был использован для изучения обработки визуальных сигналов и выяснения различных синаптических механизмов и функций нейронной сети, а также механизмов заболеваний.

Световые реакции в нейронах сетчатки записывались в течение десятилетий. В ранних исследованиях использовались острые электроды для внутриклеточной записи нейронов сетчатки у грязных щенков¹. В 1980-х годах была изобретена техника наложения пластыря², которая вскоре стала популярным методом среди исследователей зрения^3,4. Записи отдельных клеток низших позвоночных, включая нейроны сетчатки у илистых щенков и рыб, были популярными методами, способствовавшими выяснению механизмов обработки визуальных сигналов^5,6.

После того, как были разработаны методы генетической мутации, сетчатка мыши стала более популярной моделью для исследователей зрения^7-9. Сетчатка млекопитающих более привлекательна, чем у низших позвоночных, потому что она эволюционно ближе к сетчатке человека, и есть возможность использовать модели заболеваний. Тем не менее, клетки сетчатки мыши маленькие и хрупкие^, поэтому подготовка сетчатки и проведение записей с помощью пластыря в темной комнате является сложной задачей. По мере совершенствования технологий стали доступны различные подходы к изучению механизмов визуальной сигнализации, такие как визуализационные исследования¹¹ и электроретинограмма (ЭРГ)¹². Тем не менее, запись отдельных клеток с помощью метода патч-зажима по-прежнему важна, поскольку она очень чувствительна во времени и пространстве по сравнению с другими методами. Поэтому мы постоянно проводили регистрацию патч-клэмпов и усовершенствовали наши методы исследования обработки визуальных сигналов в препаратах среза сетчатки мыши^13-15.

В этом видеоуроке протоколы представлены с важными советами. Хороших записей можно добиться только при хорошей подготовке. Практика вскрытия животных и создание прочной установки для зажимов позволит большинству исследователей добиться успешных записей.

Протокол

О себе Этика: Процедуры, связанные с животными предметы были одобрены уходу и использованию комитета за животными (IACUC) в Wayne State University в.

1. Подготовка экспериментального решения

1. Подготовка рассекает раствор 1 день 1 неделю до фактического эксперимента. Используйте буферный раствор HEPES для сетчатки рассечение из-за его сильной способностью буферизации при более низких температурах ^16. Смешайте все химикаты следующим образом (в мм): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl _2, 1,0 MgCl _2, 10 HEPES, 28 глюкозы. Регулировка рН до 7,4 с помощью NaOH. Держите решение в холодильнике до 1 недели.
2. Решение для записи средних Эймса, который является искусственным спинномозговой жидкости (ACSF) предназначен для сетчатки препаратов ^17. К день эксперимента, вес порошка из Эймса (4,4 г на 500 мл раствора) в трубке. Кроме того, взвесить NaHCO ₃ (0,95 г на 500 мл раствора) и смешать с Aпорошок MES.
3. Подготовка внутриклеточный пипетки решение для локальной фиксации записи на день эксперимента. Смешать все химические вещества следующим образом (в мМ): 111 К-глюконат, CaCl _2, 1,0, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl _2, 5 АТФ-Mg и 1,0 ГТФ-Na. Регулировка рН до 7,2 с помощью КОН. Фильтр пипетки раствор с обычным шприцевой фильтр. Сделайте ~ 500 мкл аликвоты и хранить их в холодильнике или морозильная камера.

2. Подготовка к Дню эксперимента

1. В ночь перед экспериментом, поместите курсор в клетку (C57BL / 6J или аналогичного фоне, 4 - 8 недель, самцы) в темном пространстве для O / N адаптации к темноте.
2. Подготовка для вскрытия:
   1. Заполните рассекает решение (100 - 200 мл) в стеклянном стакане, положите его на льду, и пузырь с кислородом, по крайней мере, 10 мин.
   2. Начните оксигенации темный ящик для сетчатки хранения препарата.
   3. Подготовка пластиковых покровные с пластичной рельсов для повторногокишечные препараты срезов и место каждого из них в 35 мм пластиковую чашку.
   4. Приложите новый лезвие к измельчителя (ткани резки).
   5. Сокращение мембрану фильтра на две половины. Это для сетчатки нарезки.
   6. Совместите рассекает инструменты и передачи пипетки рядом с микроскопом рассекает. Рабочая зона должна быть хорошо организована так, что каждый инструмент может быть легко доступны в темноте.
3. Подготовка к локальной фиксации записи:
   1. Растворите порошок и NaHCO ₃ в дистиллированной воде (Ames 4,4 г и NaHCO ₃ 0,95 / 500 мл DDH ₂ O) Эймса. Средний пузыря Эймса при смешанном кислорода (95% O ₂ и 5% СО _2), по крайней мере 30 мин при нагревании до температуры записи (~ 35 ° C). Доводят рН до 7,4 с NaHCO ₃ в то же время барботирования.
   2. Оттепель внутреннее решение пипетки во время вскрытия. После ее оттаивают, добавить 0,01% сульфородамина B для внутриклеточного окрашивания.

3. сетчатки Препарирование

1. В темной комнате, усыпить мыши, используя углекислый газ и двустороннего пневмоторакса. После 2 - 3 мин с использованием диоксида углерода, мыши теряют сознание.
2. Когда мышь не реагирует на хвост крайнем случае, быстро не выяснять глаза и поместите их в холодной вскрытии решения в пластиковую чашку. Выполните двустороннее пневмоторакс, чтобы обеспечить смерть животного. Быстро сохранить глаз в чашке в темном поле. Используйте инфракрасный зрителя проводить процедуру в темноте.
   Примечание: В качестве альтернативы, изофлуран, обезглавливание или цервикальной дислокации могут быть использованы для эвтаназии. Метод эвтаназии должен следовать указаниям Национального института здоровья (NIH) и / или Комитета по уходу и использованию Институциональная животных.
3. В темной комнате, отрегулируйте рассекает микроскоп и инфракрасную подсветку. Под микроскопом, передать глаз от его тарелки в 10 см пластиковой чашке масIth охлажденной рассекает решения. Непрерывно пузырьков кислорода через трубу помещают на дно пластмассовой чашке. Регулировка громкости потока, так что не слишком низко, но убедитесь, что это не достаточно высоко, чтобы нарушить рассечение.
4. Роговица и хрусталик удаление:
   1. Сделать надрез в верхней части роговицы с микро-хирургический нож. Проведение зрительный нерв на другом конце глазного яблока предотвращает глаз от перемещения. Продлить разрез с помощью пары хирургических ножниц. Вырежьте роговицы с некоторой склеры вокруг него.
   2. Возьмите объектив с тонким пинцетом и медленно потяните линзу из. Если стекловидное тело слишком липким, чтобы снять объектив, вырезать стекловидного тела с ножницами.
   3. После наглазник сделан, мягко залить холодной, кислородом рассекает решение в наглазник с небольшим пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: глазное яблоко быстро сдувается после разрез делается в роговице. Важно, чтобы поддерживать форму глаза, как деформации глаза при этом пропроцедура будет повредить сетчатку и вызвать отслоение сетчатки.
5. Определение спинной и брюшной стороны сетчатки:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за неравномерного распределения зеленый и ультрафиолетовой (УФ) конусов ^18, идентификации определенного область сетчатки имеет важное значение для легких записей реагирования.
   1. Определить линию, идущую через сетчатки наглазника, проходящей вблизи зрительного нерва. Эта линия проходит в основном через брюшной стороне зрительного нерва; в том числе со стороны зрительного нерва спинной стороне, а другой вентральной ^19. Смотрите эту достопримечательность явно находился под инфракрасными зрителей.
   2. В зависимости от целей эксперимента, сделать разрез на ненужной части. Это будет полезно после выделения сетчатку из чаши глаз.
6. Стекловидное удаление:
   1. При желании, инкубировать глаз чашки с гиалуронидазы (0,5 мг / мл) в течение 15 мин.
   2. Удалить стекловидного с экстра-тонким пинцетом. Стекловидное тело, в основном,прикрепленный к нижней и наружной кромкой глаз чашку. Аккуратно удалите его, не касаясь или тыкать сетчатки. Как стекловидного тела может быть плотно прикреплена к окуляру, удалить осторожно, чтобы избежать отслойки сетчатки от глаз чашку. Продолжайте тянуть до тех пор, никакой напряженности не ощущается.
      Примечание: Этот шаг особенно важен для рассечения сетчатки мыши; Однако, это не является проблемой для сетчатки других видов, таких как крысы или саламандры.
7. Изолировать сетчатки от глаз чашку. Возьмите склеры и осторожно снимите сетчатку с помощью зад щипцов.
   Примечание: Всего монтажа сетчатки препараты могут быть изготовлены из изолированной сетчатки. Сделать 3:57 надрезы на краях и придавить сетчатку, или вырезать сетчатку на несколько частей.
8. Обрезать сетчатку и отбросить ненужные половине сетчатки (шаг 3,5). В то же пластиковую чашку, сократить оставшееся сетчатку на две части. Для каждой части сетчатки, обрезать края, чтобы сделатьсетчатки плита, и отделка складывания края.
9. Передача сетчатки плиту на стеклянную пластину с помощью большой пипетки передачи (~ 2 мл). Всасывать избытка раствора с небольшим пипетки, использовать кусок фильтровальной бумаги для выравнивания плиту, а затем быстро поместить кусок фильтровальной мембраны поверх ткани.
   1. С помощью небольшой пипетки передачи, поместите каплю рассекает решение на фильтрующей мембраны. Подождите ~ 15 сек, пока раствор не распространяется на мембране. В течение этого времени, ткани сетчатки будет прилипать к мембранный фильтр.
   2. Налейте более холодный рассекает решение под и вокруг фильтра. Ткани сетчатки с мембранный фильтр будет плавать. Возьмите мембрану фильтра с пинцетом и поместить его в нарезки камеры. Налейте рассекает решение на ткани, и хранить препарат в темном поле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, описанная здесь имеет решающее значение. Важно, чтобы выполнить эти шаги быстро, чтобы гарантировать, что ткань сетчатки прилипает к MEM фильтровбран и не высыхает.
10. Использование вертолет, сократить ткани сетчатки ломтиками. Вокруг 200 мкм толщина является допустимым для локальной фиксации исследований.
11. Поместите пластиковую покровное с жиром рельсы в нарезки камеры. Передача сетчатки срез сверху смазки рельсов на пластиковой покровное. Поверните ломтик 90 ° так, чтобы поперечное сечение видна. Пресс мембрану фильтра вниз на покровное, затем, охватывают боковые стороны фильтровальной бумаги смазкой.
    1. После ломтик обездвижен на пластиковой покровное, возьмите покровное и перенести его на 35 мм пластиковую чашку. Залить холодной рассекает раствор на сетчатке подготовке и погрузить подготовки. Храните каждое блюдо в темный ящик, который должен быть постоянно кислородом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: вся процедура должна быть выполнена тщательно, чтобы мембранный фильтр не деформируется. В противном случае, сетчатки срез легко отделяется от мембранный фильтр.

4. Патч зажим Recordings от сетчатки Slice Подготовка

1. Запись подготовку:
   1. Премьер перфузии трубы со средним Эймса. Разрешить все пузыри, чтобы пройти через при заполнении трубы.
   2. Сделать запись локальной фиксации пипетки с съемника. Чтобы заполнить пипетку с пипеткой раствор, провал в задней пипетки в течение 1 мин, пока наконечник пипетки не засыпается. Далее, заполните ~ 1/3 пипетки с помощью микро-пипетки наполнитель. Хранить каждый пипетки во влажной коробке пипетки.
   3. Включите оборудования для локальной фиксации записи; включая компьютер, усилитель, CCD камеры и микроскопа.
2. Выключите свет в помещении. Поставьте препарат сетчатки срез на предметном столике микроскопа камере с помощью инфракрасного зрителя. После того, как будет обездвижен, начать непрерывное перфузии. Установите температуру перфузии на 33 до 37 ° C.
3. Просмотр поверхность среза с ПЗС-камерой. Сосредоточьтесь на целевые места, где цель CELL виды проживания. Выберите здоровый вид ячейки для патча записи зажим (т.е., он должен иметь гладкую вид поверхности и хорошую форму клеток).
4. Поставьте записи пипетки в держатель пипетки. Предварительная пипетку к подготовке среза. Когда она близка к подготовке среза (~ 2 мм выше), найти кончик пипетки с микроскопом. После того, как наконечник пипетки это видно под микроскопом, перемещать наконечник вниз по направлению к клетке-мишени.
5. Установите усилитель. Отрегулируйте пипетку на 0 мВ / 0 Па (обнуления) и начать непрерывный электрический импульс ~ 5 мВ при ~ 10 Гц. Проверьте сопротивление пипетки; идеально подходит сопротивление от 5 до 10 МОм для большинства нейронов сетчатки.
6. Начните дует из наконечника. Использование мундштук, или использовать шприц, чтобы применить положительное давление, когда пипетки погружается в раствор бани. Непрерывно продуть внутреннюю решение пока наконечник находится на поверхности клетки-мишени.
   1. Когда положительное давление делает небольшой ямочкой на гоПоверхность электронной клеток, заранее кончик чуть-чуть и остановится на выдув. Проверьте сопротивление пипетки, которая должна возрастать. Если он постоянно растет, оставить его и контролировать сопротивление, пока не достигнет> 1 ГОм (gigaseal). Если сопротивление не спонтанно расти, мягко установите отрицательное давление, пока оно не станет gigaseal.
7. После gigaseal достигается, измените держит потенциал -70 мВ. Затем, периодически применять отрицательное давление для разрыва мембраны внутри пипетки. Когда конфигурация цельноклеточная выполнен, сопротивление пипетки может быть в пределах от 500 МОм и 1 ГОм, и емкостный ток видно. Иногда спонтанные постсинаптические токи можно наблюдать.
8. Запишите IV отношения от -80 до +40 мВ. Различные типы напряжения закрытого канала активизируются в зависимости от типа клеток.
9. Запись светло-вызванных синаптических токов или напряжений.

Результаты

Представитель препарат срез не показан на рисунке 1. Препарат срез в прямом положении, показывающий фоторецепторов ганглиозных клеток в плоскую поверхность, а не отделение от фильтровальной бумаги. Если срез наклонены, только частью подготовки находится в фокусе, что делает его трудно определить подходящую ячейку для патч зажима. Для записи, важно выбрать хороший Сома, который обычно имеет блестящую поверхность, даже круглую форму, без видимых темных бляшек. После конфигурации цельных клеток было сделан...

Обсуждение

Хорошие записи могут быть достигнуты только при хорошей подготовке сетчатки и хорошо продуманных установках зажимов для патчей. Несмотря на то, что все описанные выше шаги важны, обсуждение выделяет некоторые критические шаги как для вскрытия, так и для записи.

Для вскрытия особенно важны две вещи: охлаждение и насыщение кислородом. После энуклеации глаза быстро удалите переднюю часть глаза в препарирующей камере с кислородно-пузырьковым охлажденным диссекционным раствором и налейте холодный ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мыши (28-60 дней, самцы)	Jackson laboratory	C57BL/6J штамм
Эймс' средний порошок	Sigma	A1420	отличный
стереомикроскоп	Nikon	SMZ745	отличный
Инструмент для препарирования: щипцы	Dumont	#4, #5, #55	отличный
Инструмент для препарирования: ножницы	Roboz	RS-5605	отличный
Инструмент для препарирования: хирургический нож	Surgistar	7514	отличный
лезвие бритвы (для измельчителя)	EMS	71970	отличный
чоппер	ручной работы
инфракрасный просмотрщик	Night Owl Оптика	NOBG1	Он показывает яркий вид. Фокусировка мелких объектов является проблемой.
Съемник	Sutter	P-1000	отличный; делает пипетки постоянного размера.
Темный ящик	Pelican	темный ящик	отличный
Патч зажим система	Scientifica	срез прицел 2000	Отличная настройка. Большинство ключевых компонентов входят в одну упаковку. Микроманипуляторы отличные.
Усилитель	Molecular Devices	multiclamp 700B	Отличное и простое управление.
Программное обеспечение для эквайринга	Molecular Devices	программное обеспечение pClamp	Отличное и простое управление.
Источник света (LED)	Cool LED	pE-2 4-канальная система	Отличная
ПЗС-камера	Q-imaging	Retiga 2000	Отличная
клетка Фарадея	ручной работы