Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

Деградация Регулируемый белок имеет решающее значение практически для каждого клеточной функции. Многое из того, что известно о молекулярных механизмах и генетических требований к деградации эукариотической белка была первоначально создана в Saccharomyces CEREVISIAE. Классические анализ деградации белков полагались на биохимические импульсно-Чейз и циклогексимид погони методологий. Хотя эти методы обеспечивают чувствительные средства для наблюдения деградации белка, они являются трудоемкими, отнимающим много времени, и низкая пропускная способность. Эти подходы не поддаются быстрому или крупномасштабного скрининга мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе анализа для поспешном идентификации генетических требований к деградации белков описано. В этом анализе, фермент-репортер требуется для роста в конкретных условиях селективного слит с неустойчивой белка. Клетки, не имеющие эндогенного фермента-репортера, но, экспрессирующие слитый белок может расти в СелеCTIVE условия только тогда, когда слитый белок стабилизируют (т.е. при деградации белка нарушена). В анализе роста, описанного здесь, серийные разведения дикого типа и мутантных клеток дрожжей, несущих плазмиду, кодирующую слитый белок, наносили на селективной и неселективной среды. Рост в селективных условиях в соответствии с обесценение деградации данного мутации. Увеличение белка обилие должны быть биохимически подтверждено. Способ быстрого извлечения дрожжевых белков в форме, подходящей для электрофореза и Вестерн-блоттинга также продемонстрировал. Считывание рост на основе стабильности белка, в сочетании с простым протоколом для экстракции белка для биохимического анализа, облегчает быструю идентификацию генетических требований к деградации белка. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных короткоживущих белков. В примере, представленном фермент HIS3, который необходим для биосинтеза гистидина, был слитв Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 предназначен для деградации после аномально занимается эндоплазматической сети транслокон. Клетки, несущие Deg1 -Sec62-his3 удалось вырастить в селективных условиях, когда белок был стабилизирован.

Introduction

Селективный деградации белка имеет важное значение для эукариотической жизни, и деградация измененный белок способствует ряда заболеваний, в том числе некоторых видов рака, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, и кистозный фиброз ^1-5. Система убиквитин-протеасомный (ИБП), который катализирует селективное разрушение белка, является новым терапевтической мишенью для этих условий ^6-10. Убиквитин-лигазы ковалентно присоединить полимеры убиквитина 76-аминокислота белков ^11. Белки, которые были отмечены с полиубиквитиновый цепей признаются и proteolyzed по ~ 2,5 megadalton 26S протеасом ^12. Исследования, начатые в модели эукариотических организмов Saccharomyces Cerevisiae (почкованием дрожжей) были основополагающими в выяснении механизмов деградации белка в эукариотических клетках. Впервые продемонстрирована физиологический субстрат ИБП был дрожжи транскрипции репрессор MATα2 ¹³, 14, и многие высоко консервативные компоненты ИБП впервые были определены или отличающийся тем, дрожжей (например, ^15-26). Открытия, сделанные в этом универсальном и генетически послушный модельного организма, скорее всего, продолжит оказывать важную информацию консервативных механизмов убиквитин-опосредованной деградации.

Признание и деградация большинства субстратов ИБП требуют совместных действий нескольких белков. Таким образом, важной задачей при характеристике регулируемого деградации данного нестабильной белка, чтобы определить генетические требования для протеолиза. Классические методы (например, импульсно-чейз и циклогексимид-чейз-эксперименты ²⁷⁾ для мониторинга деградации белка в млекопитающих или дрожжевые клетки трудоемким и занимает много времени. В то время как эти типы методологии обеспечивают высоко чувствительные средства для детектирования деградацию белков, они не подходят для быстрого анализа деградации белка или крупномасштабного screeniнг для мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе тест для быстрой идентификации генетических требований к деградации неустойчивых белков представлены.

В дрожжей на основе экономического роста метод анализа деградации белка, неустойчивый интерес белок (или деградации сигнала) сливают, в рамке, с белком, который необходим для роста дрожжей при определенных обстоятельствах. Результатом является искусственный субстрат, который может служить в качестве мощного инструмента для определения генетического требованиям деградации белков нестабильной белка. Удобно, наиболее часто используемые дрожжевые штаммы лаборатории укрывает панель мутаций в генах, кодирующих метаболические ферменты, участвующие в биосинтезе определенных аминокислот или азотистых оснований (например, ^20,28-30). Эти ферменты имеют важное значение для клеточной пролиферации в отсутствие экзогенно предоставленных метаболитов в которых синтез ферменты участвуют. Такиеметаболические ферменты могут, таким образом, функционировать в качестве роста на основе репортеры за деградацию нестабильных белков, к которым они слиты. Генетические требования к деградации белков могут быть легко объяснены, так как мутации, которые предотвращают протеолиз позволит клетки, несущие деградации репортер расти при селективных условиях.

Преимущество рост косвенным свидетельством того, что особенности мутация увеличивает изобилие белка. Тем не менее, прямой биохимический анализ необходим, чтобы подтвердить, что мутация позволяет рост за счет увеличения содержания белка, а не через косвенные или артефактом причин. Эффект мутации на белковой изобилии, может быть подтверждено с помощью Вестерн-блот анализа уровней стационарных белка в клетках, что делать, и не питают особого мутацию. Способ быстрого и эффективного извлечения дрожжевых белков (последовательной инкубацией клеток дрожжей с помощью гидроксида натрия и образец буфера) в форме, пригоднойдля анализа с помощью Вестерн-блоттинга также представлены ^31. Вместе, эти эксперименты содействия скорейшей идентификации регуляторов кандидатов деградации белка.

Protocol

1. Дрожжи Анализ роста к выявления возможных мутантов, дефектных по Protein деградации

1. Преобразование дикого типа и мутантных клеток дрожжей с плазмидой, кодирующей нестабильную белок, слитый в рамке, с репортером метаболического фермента.
2. Посев трансформантов в 5 мл синтетической определенной (SD) минимальной среде, что является селективным для клеток, несущих плазмиды молекулы. Инкубируют в течение ночи при 30 ° С, вращение.
3. Измерение оптической плотности при 600 нм (OD ₆₀₀₎ в каждой ночной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации в течение ночи, клетки в культуре могут быть в любом логарифмической или стационарной фазы роста, но должны были достичь минимальной OD ₆₀₀ 0,2. Очень медленно растущие штаммы дрожжей может потребовать времени инкубации дольше, чем одну ночь, или прививка большего числа клеток, как определено эмпирически.
4. Подготовьте шесть-кратные серийные разведения трансформированных дрожжевых клеток в стерильной 96-луночного планшета, начиная с клетки разводили дон OD ₆₀₀ 0,2. Место каждого трансформанта дрожжей для анализа в другой строке в 96-луночного планшета.
   1. Для каждого трансформанта, рассчитать объем ночной культуры, необходимой для разбавления клеток к OD ₆₀₀ 0,2 в конечном объеме 200 мкл. Добавить этот объем в течение ночи культуры в соответствующую лунку в колонке 1. Добавьте соответствующее количество стерильной воды, чтобы довести объем до 200 мкл.
   2. Для каждой строки дрожжей, добавить 125 мкл стерильной воды в лунки в колонках 2, 3, и 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуально упакованные стерильные 96-луночные планшеты могут быть упакованы с стерильных крышек. Крышки могут быть использованы в качестве резервуаров для стерильной воды, который распространяется на этой стадии. Это позволяет одновременную передачу стерильной воде для всех скважин в данном столбце с многоканальной пипетки.
   3. Смешайте содержимое первого столбца (дрожжевой разбавляют до OD ₆₀₀ 0,2) с помощью пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной пипетки.
   4. Transfэ 25 мкл дрожжей из колонки 1 в колонку 2, с помощью многоканального дозатора. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Передача 25 мкл из колонки 2 в колонку 3, и 25 мкл из колонки 3 на колонку 4 (хорошо перемешивая на каждом шагу).
5. Смешайте каждого образца многоканальной пипетки. Исходя из наиболее разбавленных до менее разбавленных колонны дрожжей, пипетки 4 мкл каждого образца на двух пластинах, содержащих соответствующую селективную среду. Используйте одну пластину со средой, которая поддерживает выбор плазмиды (это пластина служит дрожжей кровянистые выделения и контроля роста). Использование второй пластины со средой, которая выбирает для поддержания плазмиды и экспрессии в неустойчивом белка, слитого с фермента-репортера. Потому что дрожжи быстро оседают, смешать клетки с помощью пипетки вверх и вниз на регулярной основе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сушилка пластины будут с большей готовностью поглощает жидкость, чем свежеприготовленных пластин и, следовательно, рекомендуется для этих экспериментов. Влажные пластины могут быть высушены путем инкубации при комнатной температуре в ЛоW влажности в течение 1 – 2 дней или более короткие инкубации в ламинарном потоке. Плиты могут высохнуть неравномерно, если ламинарный поток воздуха параллельно скамье. Использование шаблона делает его легче обнаружить дрожжевых клеток через равные расстояния. Два Образцы шаблонов предусмотрены на фиг.1. Они могут быть напечатаны, вырезали и прикреплены к внутренней крышке посудомоечной Петри.
6. Разрешить пластин для просушки на скамейке наверху.
7. Планшеты инкубируют при 30 ° С в течение 2 – 6 дней.
8. Фотоснимок каждой пластины после инкубации.

Рисунок 1. Шаблоны для пятнистость дрожжевых клеток на 100-мм чашках с агаром. Эти шаблоны могут быть использованы для облегчения пятнистость дрожжи через равные промежутки с помощью многоканальной пипетки. Шаблоны могут быть напечатаны, вырезали и прикреплены к внутренней крышке посудомоечной Петри. Поместите чашку Петри с ростомсреда внутри крышки с шаблоном прикреплена. Шаблоны отмечены с выемкой для отслеживания ориентации. Рекомендуется, чтобы пластины, используемые в анализах роста быть аналогичным образом помечены с выемкой для отслеживания ориентации. Шаблоны для кровянистые выделения четырех (а) или пяти (B) серийные разведения дрожжевых клеток предоставляются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть версию для печати этой фигуры с шаблонами 100-мм.

2. Биохимический Подтверждение Пробирной роста дрожжей

1. Рост дрожжевых клеток и пост-щелочной протеиновый Добыча (модифицированный из ³¹⁾
   1. Преобразование дикого типа и мутантных клеток дрожжей с плазмидой, кодирующей белок нестабильную.
   2. Привить трансформантов в 5 мл SD среде, которая является селективной для клеток, несущих молекулы плазмиды. Инкубируют в течение ночи при 30 ° С, вращение.
   3. Измерьте OD ₆₀₀ каждой ночи кубlture.
      Примечание: После инкубации в течение ночи, клетки могут быть в любом логарифмической или стационарной фазе роста, но должны достигли OD _600, который позволит разбавление до OD ₆₀₀ 0,2 в 10 мл свежей селективной среде (этап 2.1.4). Очень медленно растущие штаммы дрожжей может потребовать времени инкубации дольше, чем одну ночь, или прививка большего числа клеток, как определено эмпирически.
   4. Развести дрожжевых клеток на OD ₆₀₀ 0,2 в 10 мл свежей селективной средой.
   5. Продолжали инкубировать клетки при 30 ° С, вращающихся или встряхивании, пока культура не достигает наружный диаметр ₆₀₀ между 0,8 и 1,2 (т.е. в середине логарифмической фазе роста).
      Примечание: Если неустойчивым интерес белок находится под контролем регулируемого промотора, оптимальный выбор времени индукции экспрессии белка и урожай клеток может изменяться в зависимости от предыдущих исследований или эмпирических наблюдений.
   6. Соберите 2,5 OD ₆₀₀ единиц культуры в 15-мл коническаяаль трубки центрифугированием при 5000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
      Примечание: Один из OD ₆₀₀ единица определяется как количество дрожжей, присутствующих в 1 мл культуры в ОД ₆₀₀ из 1,0. Объем культуры (в мл), необходимое для сбора 2,5 OD ₆₀₀ единиц (V) может быть определена с помощью следующего уравнения: V = 2,5 OD ₆₀₀ единиц / Измеренные OD ₆₀₀
   7. Ресуспендируют клеток в 1 мл дистиллированной воды. Передача взвешенных клеток в микроцентрифужных трубки.
   8. Гранул клетки центрифугированием при 6500 х г в течение 30 сек при комнатной температуре. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
   9. Ресуспендируют клеток в 100 мкл дистиллированной воды с помощью пипетки вверх и вниз или встряхивания и добавить 100 мкл 0,2 М NaOH. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при комнатной температуре.
   10. Пелле клеток (большинство из которых так и не выпустили белки и еще жизнеспособна) путем центрифугирования при 18000 хг в течение 5 мин. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
   11. Ресуспендируют осадок в 50 – 100 мкл буфера Лэммли 1x образца, который будет лизировать клетки, с помощью пипетки вверх и вниз или вортексе.
       Примечание: Удаление щелочной супернатанта следующей центрифугированием и последующей ресуспендирования клеток в буфере Лэммли образца извлекает белки при рН, совместимого с додецилсульфатом натрия гель-электрофореза в полиакриламидном сульфат (SDS-PAGE) с использованием трис-глицин систему рабочего буфера и Вестерн-блоттинга.
   12. Для полной денатурации белков, инкубировать лизатов при 95 ° С в течение 5 мин.
       Примечание: Агрегирование-склонные белки (например, белки с несколькими трансмембранных сегментов) может стать нерастворимым при инкубации при 95 ° С. Таким образом, лизаты должны быть инкубировали при более низких температурах (например, 37 ° С – 70 ° С) в течение 10 – 30 мин, как определено эмпирически, для анализа таких белков.
   13. Холодные лизаты путем размещения на льду в течение 5 мин.
   14. Центрифуга лизаты в 18000 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре для осаждения нерастворимого материала. Отделить супернатант (солюбилизируют экстрагируют белка) в ДСН-ПААГ перед последующим Вестерн-блот-анализа (раздел 2.2). Кроме того, магазин лизаты при -20 ° С.
2. Представитель вестерн-блоттинга протокол
   1. Загрузка определены эмпирически объем лизата в SDS-PAGE гель.
   2. Бегите гель при 200 V до передней красителя достиг дна геля.
   3. Передача белков из геля из поливинилиденфторида (ПВДФ) мембраны влажной передачи при 20 В в течение 60 – 90 мин при 4 ° С.
   4. Блок мембраны путем инкубации в 5% обезжиренном молоке в Трис-солевом буфере (TBS), качалки, в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
   5. Слейте блокировании решения.
   6. Инкубируйте мембраны с первичным антителом, специфичным для белка, представляющего интерес (или эпитопов тега их) в 1% обезжиренным молоком в TBS с 0,1% Твин-20 (TBS / T) в течение 1 ч при комнатной Temperature, покачиваясь.
   7. Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
   8. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора-сопряженных вторичными антителами в 1% обезжиренным молоком в TBS / T в течение 1 ч при комнатной температуре, качалки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку флуорофоры светочувствительный, разведения флуорофорных-сопряженных антител должны быть подготовлены в темноте. Кроме того, инкубирование мембраны в присутствии флуорофора-конъюгированного антитела должно происходить в светонепроницаемыми контейнеров. Это может быть достигнуто путем обертывания инкубации лотки в алюминиевую фольгу.
   9. Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
   10. Получить изображение мембраны с помощью Li-Cor Odyssey CLX и Image Studio программного обеспечения (или сравнимой комплектации изображения и программное обеспечение), в соответствии с рекомендациями производителя.
   11. После визуализации мембраны, мембраны инкубируют с первичным антителом, специфичным к нагрузкечисле белок управления в 1% обезжиренным молоком в TBS / T в течение 1 ч при комнатной температуре, качалки.
   12. Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
   13. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора-сопряженных вторичными антителами в 1% обезжиренным молоком в TBS / T в течение 1 ч при комнатной температуре, качалки.
   14. Декантировать раствор антител и мыть мембраны 3 х 5 мин при TBS / T при комнатной температуре, качалки.
   15. Получить изображение мембраны с помощью Li-Cor Odyssey CLX и Image Studio программного обеспечения (или сравнимой комплектации изображения и программное обеспечение), в соответствии с рекомендациями производителя.

Representative Results

Discussion

Методология, представленные здесь позволяет для быстрого определения и биохимического подтверждения генетических требований к деградации белков в дрожжевых клетках. Эти эксперименты выделить полезность и власть дрожжей в качестве модели эукариотических организмов (несколько отличные отзывы дрожжей биологии и сборники протоколов для обработки, хранения и манипулирования дрожжевых клеток (например, ^41-44) доступны для исследователей новых для организма). Методы могут быть легко применены для исследования деградации и обилие различных классов белков. Например, другие использовали эту стратегию, чтобы охарактеризовать механизмы деградации нестабильной цитозольным, ядерной и ER просвета и трансмембранных белков ^45-49.

Несколько факторов, должны быть рассмотрены при выборе метаболического фермента предохранитель к нестабильной белка. Во-первых, очень важно, чтобы это функциональный вариант гена, кодирующего фермент, неприсутствовать в геном хозяина. Чтобы свести к минимуму ложные положительные результаты (т.е. рост в селективных условиях, когда неустойчивое белок фактически деградирует), рекомендуется, чтобы работать со штаммами, которые укрывают необратимая мутантные аллели гена-репортера (предпочтительно полные генные делеции) ^50. Другое соображение для выбора фермент-репортер является наличие конкурентных ингибиторов, которые могут быть включены в селективной среде роста, чтобы уменьшить рост фона и повышения жесткости анализа. Это может быть полезно в случаях белков с относительно низкой скорости оборота даже в присутствии полностью функциональных механизмов деградации. В представительных экспериментов, представленных здесь, включение 3-AT, который конкурентно ингибирует фермент HIS3, уменьшает рост фона ^40. Кроме того, соединение 6 ингибирует azauracil-URA3, фермента, необходимого для биосинтеза урацила ^51. Определяют концентрацию ингибитора, при которой рост происходит в деградации-Defective, но не дикого типа, клетки должны быть определены эмпирически. Некоторые метаболические ферменты могут быть также против выбран против. Под противоположных селективных условиях, клетки могут расти только при нестабильным белок разрушается (а конденсированный метаболического фермента нет). Например, URA3 преобразует соединение 5-fluoroorotic кислоту (5-FOA) к токсичным соединением, 5-фторурацил ^52. Клетки, экспрессирующие белок URA3-слитый будет расти только в присутствии 5-FOA, если слитый белок URA3 ухудшается. Аналогичным образом, соединение 5-fluoroanthranilic кислоты (5-АВС) является токсичным для клеток с функциональной биосинтеза триптофана. 5-FAA Таким образом, можно использовать для борьбы с терроризмом, выберите клеток, экспрессирующих TRP1-слитые белки ^53. Стратегии борьбы с отбора могут быть полезны для идентификации супрессоров деградации, затрудняющего мутаций.

Используемый промотор для управления экспрессией разложения, репортер также должен быть тщательно отобраны. Как низкий уровень biosynthEtic ферменты могут быть достаточным, чтобы поддерживать рост в отсутствие экзогенно метаболита, слабый промотор рекомендуется ^54. В представительных экспериментов, представленных здесь, GAL4, промотор, который подавляется в присутствии глюкозы ^55, используется, чтобы способствовать транскрипции Deg1 -Sec62-HIS3. Базальная экспрессия этого слитого белка под репрессирующих условиях (т.е. 2% глюкозы) достаточно, чтобы поддержать рост в селективных условиях (т.е. отсутствие гистидина и наличия +1 – 2 мм 3-АТ), когда механизм деградации отключена. Тем не менее, уровень белка, достаточных для поддержания роста в селективных условиях, скорее всего, будет ниже порога обнаружения по вестерн-блоттинга. Таким образом, это может быть необходимо для управления экспрессией со слабым промотором для анализа роста и более сильного промотора для биохимического подтверждения. В случае Deg1 -Sec62 (с или без слияния his3), более Robusт промотор (здесь, промотор МЕТ25 ³⁹⁾ требуется для визуализации белка с помощью Вестерн-анализа.

Как описано здесь, дрожжи основе анализа роста может быть выполнена на малой, кандидата подхода. Серийные разведения клеток дрожжей получают в 96-луночный планшет с и передается с помощью пипетки на твердой среде для выращивания; Альтернативный способ для эффективного и воспроизводимого передачи разбавленных суспензий дрожжевых клеток на твердой среде является использование нескольких контактный репликатор в, обычно называют как "Frogger" ^56. Идеальное время, чтобы сфотографировать пластины будут меняться в зависимости от деформаций и условий дрожжей. Рекомендуется, чтобы сфотографировать данную пластину, когда колонии из наиболее быстро растущих культуры сначала становятся видимыми на самом разбавленной месте. Это, как правило, точка, в которой различия в темпах роста среди образцов наиболее очевидны. Это может быть целесообразным, чтобы сфотографировать на нескольких дней, особенно в случае дрожжейвыставляется широкий диапазон скоростей роста.

Рост журналистом анализ также может быть адаптирована для крупномасштабных анализов. Например, ухудшение репортер может быть введен в коммерчески доступной библиотеки ~ 5000 жизнеспособных штаммов гаплоидный геном дрожжей с делецией с использованием синтетических Генетический Массив (СЕО) технологии ^46,57. В этой технике, гаплоидный штамм дрожжей с хромосомой комплексного метаболического белка репортер слитого соединяется с каждого штамма библиотеки делеции гена. Полученные диплоидные клетки привлечен к образуют споры (пройти мейоз) и подвергали отбора на гаплоидный мейоза потомства укрывательство как метаболический репортер и индивидуальные удаления гена. Эти штаммы затем переносили в массе до средней селективным в отношении клеток, в которых этот белок был стабилизирован. Что касается малого масштаба анализа, если ген с роли в деградации белка удаляется, слитый белок будет стабилизирована и рост клеток будет усилена. Сопоставимыеpproaches были разработаны, которые позволяют одновременно трансформации большой коллекции штаммов с экстра-хромосомном поддерживается плазмид; Эта стратегия позволяет избежать хромосомной интеграции, спаривание, образование спор и мейоза выбор ^54.

При мутации найдены, чтобы придать преимущество роста в клетки, несущие метаболически репортер, необходимо подтвердить, что биохимически мутация увеличивает обилие белка, представляющего интерес. Быстрый и надежный порядок дрожжи лизис, лучше адаптирована из метода Kuhsnirov ^31, представлен. Этот протокол позволяет для извлечения белков в виде непосредственно пригодной для анализа с помощью Вестерн-блоттинга. Для анализа данного белка, количество лизата должны быть загружены на лунку, свойства акриламида гель, выбор мембраны, антител, используемых и их разведений, и способ обнаружения должны быть определены эмпирически. Представитель Вестерн-блоттинга протокол, описанный утilizes вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентных красителей; другие часто используемые протоколы полагаться на зависимость от антител, конъюгированного ферментов ⁵⁸ хемилюминесценции. Как описано здесь, мембрана используется для обнаружения белка, представляющего интерес, могут быть непосредственно повторно зондировали с антителом белок управления загрузкой. Если первичные антитела, используемые для обнаружения белка, представляющего интерес белка и управления загрузки были подняты из того же вида, reprobing мембрану можно тех пор, пока полосы, возникающие из этих белков не мигрируют совместно. Если, однако, первичные антитела, используемые для обнаружения белка, представляющего интерес белка и управления загрузки были подняты из различных видов, так же мембрана может быть последовательно зондируют, даже если полосы совместно мигрируют, если вторичные антитела были конъюгированы с флуорофоров с различные длины волн излучения. В случае, когда представляющий интерес белок и белок управления загрузкой совместно мигрируют и соответствующих первичных антител были раиСЭД из того же вида, то пробы могут быть решен на двух гелей SDS-PAGE, переданных PVDF мембрану и зондировали отдельно с использованием антител, специфических для белка, представляющего интерес, и управления загрузкой белка. С другой стороны, загрузка последовательность может быть оценен путем инкубации мембраны с неспецифических белковых пятен (например Кумасси или Ponceau S). Кроме того, представитель протокол Вестерн-блоттинга предполагает белок или эпитоп, который обнаруживается путем последовательной инкубации первичных и вторичных антител, как это характерно. Слитые белки, проанализированные в представительных результатов содержит два эпитопы, полученные из золотистого стафилококка протеина А (АФР на рисунках 2 и 3). Белок соединяется непосредственно с иммуноглобулинов млекопитающих и, следовательно, могут быть обнаружены с помощью одиночку (т.е. не первичное антитело инкубации шаг не требуется) ⁵⁹ вторичного антитела. Вполне возможно, что слияние с фермент-репортер может влиять белка изобилие илидеградация. Поэтому желательно, чтобы биохимически подтвердить результаты, используя версию подложки неизрасходованного-репортер белка. Наконец, оба анализы, описанные здесь, полагаются на различия в уровнях стационарных белка в качестве прокси для различий в стабильности белка. Поскольку белок обилие отражает интеграцию скоростей синтеза белка и деградации, дальнейшего биохимического анализа (например, циклогексимид Chase или импульсный Chase экспериментах) должны быть использованы для анализа непосредственно динамический профиль деградации белка.

Представительные результаты устанавливают новый применение этого протокола для определения генетических требований к деградации белка, который аберрантно входит в зацепление с ER транслокон. Deg1 -Sec62-his3 присвоено преимущество в росте дрожжей в селективных условиях, когда путь деградации инактивируют (например, в отсутствие убиквитинлигазы Hrd1). Быстрый и надежный экс белокМетод тяги с последующим вестерн-блоттинга подтвердил увеличение обилия Deg1 -Sec62 (с или без his3) в отсутствие Hrd1. Предыдущие исследования показали, что механизм Hrd1-зависимой деградации транслокона белков, ассоциированных отличается от других Hrd1 ER просвета или трансмембранных подложек ^32. Будущая работа будет использовать гибридный белок Deg1 -Sec62-his3 в крупномасштабных генетических экранов для идентификации новых генов, необходимых для этого уникального механизма деградации.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components			Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (<em>e.g.</em> from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1<em>H</em>-1,2,4-triazole	Fisher Scientific	AC264571000	Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.
Endoglycosidase H (recombinant form from <em>Streptomyces plicatus</em>)	Roche	11088726001	May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.
Disposable borosilicate glass tubes	Fisher Scientific	14-961-32	Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (<em>e.g.</em> Heratherm Incubator Model IMH180)	Dot Scientific	51028068	Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)	New Brunswick	M1053-0450	Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped	Sarstedt	82.1581.001	Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &mu;l	Gilson	F14401	Available from a variety of manufacturers<br />&nbsp;<br />&nbsp;<br />&nbsp;<br /><br />&nbsp;
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu;l	Gilson	F14403	Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.
Plate imaging system (<em>e.g.</em> Gel Doc XR+ System)	Bio-Rad	170-8195	A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene	Sarstedt	62.554.205	Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater	Fisher Scientific	1172011AQ	Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane			Will vary by lab and application
Western blot imaging system (<em>e.g.</em> Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)	Li-Cor	9140-01	Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes	Fisher Scientific	IPFL00010	Will vary by lab and application
Primary antibodies (<em>e.g.</em> Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))	Life Technologies	459250	Will vary by lab and application
Secondary antibodies (<em>e.g.</em> Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))	Life Technologies	A-21065	Will vary by lab and application