Методическая статья

Определение на основе экономического роста и биохимическая Подтверждение генетическим требованиям белка деградации в Saccharomyces Cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 февраля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается анализ на основе роста дрожжей для определения генетических потребностей для деградации белка. В нем также демонстрируется метод быстрой экстракции дрожжевых белков, пригодный для вестерн-блоттинга для биохимического подтверждения требований к деградации. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных белков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Деградация Регулируемый белок имеет решающее значение практически для каждого клеточной функции. Многое из того, что известно о молекулярных механизмах и генетических требований к деградации эукариотической белка была первоначально создана в Saccharomyces CEREVISIAE. Классические анализ деградации белков полагались на биохимические импульсно-Чейз и циклогексимид погони методологий. Хотя эти методы обеспечивают чувствительные средства для наблюдения деградации белка, они являются трудоемкими, отнимающим много времени, и низкая пропускная способность. Эти подходы не поддаются быстрому или крупномасштабного скрининга мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе анализа для поспешном идентификации генетических требований к деградации белков описано. В этом анализе, фермент-репортер требуется для роста в конкретных условиях селективного слит с неустойчивой белка. Клетки, не имеющие эндогенного фермента-репортера, но, экспрессирующие слитый белок может расти в СелеCTIVE условия только тогда, когда слитый белок стабилизируют (т.е. при деградации белка нарушена). В анализе роста, описанного здесь, серийные разведения дикого типа и мутантных клеток дрожжей, несущих плазмиду, кодирующую слитый белок, наносили на селективной и неселективной среды. Рост в селективных условиях в соответствии с обесценение деградации данного мутации. Увеличение белка обилие должны быть биохимически подтверждено. Способ быстрого извлечения дрожжевых белков в форме, подходящей для электрофореза и Вестерн-блоттинга также продемонстрировал. Считывание рост на основе стабильности белка, в сочетании с простым протоколом для экстракции белка для биохимического анализа, облегчает быструю идентификацию генетических требований к деградации белка. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных короткоживущих белков. В примере, представленном фермент HIS3, который необходим для биосинтеза гистидина, был слитв Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 предназначен для деградации после аномально занимается эндоплазматической сети транслокон. Клетки, несущие Deg1 -Sec62-his3 удалось вырастить в селективных условиях, когда белок был стабилизирован.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Селективный деградации белка имеет важное значение для эукариотической жизни, и деградация измененный белок способствует ряда заболеваний, в том числе некоторых видов рака, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, и кистозный фиброз 1-5. Система убиквитин-протеасомный (ИБП), который катализирует селективное разрушение белка, является новым терапевтической мишенью для этих условий 6-10. Убиквитин-лигазы ковалентно присоединить полимеры убиквитина 76-аминокислота белков 11. Белки, которые были отмечены с полиубиквитиновый цепей признаются и proteolyzed по ~ 2,5 megadalton 26S протеасом 12. Исследовани....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дрожжи Анализ роста к выявления возможных мутантов, дефектных по Protein деградации

  1. Преобразование дикого типа и мутантных клеток дрожжей с плазмидой, кодирующей нестабильную белок, слитый в рамке, с репортером метаболического фермента.
  2. Посев трансформантов в 5 мл синтетической определенной (SD) минимальной среде, что является селективным для клеток, несущих плазмиды молекулы. Инкубируют в течение ночи при 30 ° С, вращение.
  3. Измерение оптической плотности при 600 нм (OD 600) в каждой ночной культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации в течение ночи, клетки в культуре могут быть в любом логарифмической или стационарной фазы р....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проиллюстрировать эту методологию, фермент HIS3 был слит с карбокси-конца модели эндоплазматического ретикулума (ER) -associated деградации (ERAD) подложки, Deg1 -Sec62 (2А), чтобы создать Deg1 -Sec62-HIS3 (фиг.3) . Deg1 -Sec62 представляет членом-основателем нового класса ERAD субстратов, которые ориентированы ниже стойким, отклоняющееся связь с транслокона, канал, прежде всего, отвечает за перемещение белков через ЭР мембраны 32-34. Такие не.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методология, представленные здесь позволяет для быстрого определения и биохимического подтверждения генетических требований к деградации белков в дрожжевых клетках. Эти эксперименты выделить полезность и власть дрожжей в качестве модели эукариотических организмов (несколько отличные отзывы дрожжей биологии и сборники протоколов для обработки, хранения и манипулирования дрожжевых клеток (например, 41-44) доступны для исследователей новых для организма). Методы могут быть легко применены для исследован.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим нынешних и бывших членов лаборатории Рубинштейн для обеспечения благоприятных и энтузиазма исследовательскую среду. Мы благодарим Райана Т. Гибсон за помощь в оптимизации протокола. Мы благодарим Отметить Хохштрассер (Йельский университет) и Дитер Вольф (Universität Stuttgart) для штаммов дрожжей и плазмид. Мы благодарим наших рецензентов за их помощь в улучшении ясности и полезности этой рукописи. Эта работа была поддержана научным награду от главы Ball State University Сигма Кси к SGW, Национальный институт гранта здравоохранения (R15 GM111713), чтобы ЭМИ, исследования награда Ball State University стремиться к ЭМИ, а также средства от Ball State Univ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Желаемые штаммы дрожжей, плазмиды, стандартные среды и буферные компонентыШтаммы дрожжей с желаемыми мутациями могут быть получены в лаборатории исследователя. Дрожжи дикого типа и различные мутанты также коммерчески доступны (например от GE Healthcare). Плазмиды, кодирующие гибридные белки, могут быть получены в лаборатории исследователя.
3-амино-1<эм>H-1,2,4-триазолНаучныйAC264571000Фишера Конкурентный ингибитор фермента His3. Может быть включен в среду для повышения строгости анализа роста с использованием репортерных конструкций His3
Эндогликозидаза H (рекомбинантная форма из Streptomyces plicatus)Roche11088726001может быть использована для оценки N-гликозилирования белков; совместима с концентрациями SDS и бета-меркаптоэтанола, обнаруженными в 1x буфере для образцов Laemmli.
Одноразовые трубки из боросиликатного стеклаFisher Scientific14-961-32Доступны у различных производителей
Инкубатор с регулируемой температурой (например Инкубатор Heratherm Модель IMH180)Dot Scientific51028068Доступен у различных производителей
Новый Брансуик Сменный барабан для трубок 18 мм (трубчатый роликНью-БрансуикM1053-0450Трубчатый ролик рекомендуется для поддержания в течение ночи дрожжевых заквасок дрожжевых клеток во взвешенном состоянии. Для поддержания более крупных культур во взвешенном состоянии можно использовать встряхиватель на платформе или трубчатый ролик.
Нью-Брансуик TC-7 Роликовый барабан 120V 50/60 HНью-БрансуикM1053-4004Для использования с трубчатым роликом
SmartSpec Plus СпектрофотометрBio-Rad170-2525Доступен у различных производителей
Стерильные 96-луночные плоскодонные микротестовые планшеты с крышкой в индивидуальной упаковкеSarstedt82.1581.001Доступны у различных производителей
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & мю; lGilsonF14401Доступен у различных производителей
 
 
 

 
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403Одноканальные и многоканальные дозаторы используются на различных этапах протокола. В то время как многоканальные пипетки снижают нагрузку на пипетирование на нескольких этапах, одноканальные пипетки можно использовать на протяжении всего протокола. Выпускается от различных производителей.
Центрифуга 5430Eppendorf5427 000.216Ротор, который продается с устройством, вмещает микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 и 2,0 мл. Ротор может быть заменен на тот, который вмещает конические пробирки объемом 15 мл и 50 мл.
Система визуализации пластин (например Gel Doc XR+ System)Bio-Rad170-8195Для визуализации пластин могут использоваться различные системы, включая сложные системы визуализации, компьютерные сканеры и камерофоны.
Ротор с фиксированным углом наклона F-35-6-30 с крышкой и адаптерами для центрифуги Модель 5430/R, 15/50 мл Конические пробирки, 6-местнаяEppendorfF-35-6-30
15 мл с трафаретной печатью завинчивающаяся крышка 17 x 20 мм коническая, полипропиленSarstedt62.554.205В наличии у различных производителей
гибкая пробирка 1,5 мл, PCR чистая, натуральная микроцентрифужная пробиркаEppendorf22364120В наличии у различных
производители Аналоговый нагреватель для капельной ванныFisher Scientific1172011AQКипящая водяная баня с горячей плитой также может использоваться для денатурации белков
аппаратов для запуска и переноса SDS-PAGE, источников питания и оборудования для визуализации или фотолабораторий для SDS-PAGE и переноса на мембрануБудет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
Западная блоттинговая система визуализации (например Сканер Li-Cor Odyssey CLx и программное обеспечение Image Studio)Li-Cor9140-01Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
Первичные антитела (например Фосфоглицераткиназа (Pgk1) Моноклональное антитело, мышь (клон 22C5D8))Life Technologies459250Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
Вторичные антитела (например Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))LifeTechnologiesA-21065Будет варьироваться в зависимости от лаборатории и применения
.)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmi....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи