Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52436

⸱

8 января 2015 г.

 ,  , 
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Мы разработали новую Экс Vivo модель для изучения действия гормонов в груди человека. Он основан на ткани микроструктур, выделенных из хирургические образцов ткани молочной железы, сохраняющих ткани архитектуру, межклеточные взаимодействия и паракринную сигнализации.

Аннотация

Исследование действия гормонов в груди человека был затруднен из-за отсутствия адекватных модельных системах. По культуре в пробирке, первичные эпителиальные клетки молочных желез, как правило, теряют экспрессии рецептора гормона. Широко используются гормон рецепторов линии положительное клеток рака молочной железы имеют ограниченное отношение к в естественных условиях ситуации. Здесь мы опишем Экс Vivo модель для изучения действия гормонов в груди человека. Свежие образцы молочной железы человека из тканей хирургическим сброса материала, такого как mammoplasties сокращения или mammectomies механически и ферментативно переваривается, чтобы получить фрагменты тканей, содержащих каналы и дольки и несколько типов стромальных клеток. Эти ткани микроструктуры хранящиеся в базальной среде без факторов роста сохраняют свои межклеточные контакты, архитектура ткани и остаются гормона реагировать в течение нескольких дней. Они легко обрабатываются для РНК и извлечения белка, гистологического анализа или хранить в замораживании среду. ФлуоресценцияАктивированный сортировки клеток (FACS) может быть использован для обогащения конкретных клеточных популяций. Этот протокол обеспечивает простой, стандартный подход для трансляционных исследований с исключительно сложной, разнообразной человека образцов.

Введение

Информация о мутационный пейзаж рака молочной железы увеличивается на быстром темпе. Меньше внимания уделялось системных факторов, которые влияют на развитие рака молочной железы. Воздействие половых гормонов имеет большое влияние на прогрессирование заболевания 1-3. Тем не менее, механизмы, с помощью которых репродуктивные гормоны посягают на груди человека мало изучены. Работа с генетически мышиных моделях показали, что они связаны с клеточной внутренней и паракринную сигнализацию через несколько нижестоящих эффекторов 4.

Ограниченные знания о действия гормонов в груди человека в значительной степени объясняется отсутствием адекватных моделей. Большая часть работы по механизмам рецептора эстрогена (ER) и рецептора прогестерона (PR) сигнализации была выполнена с рецептор к гормону клеточных линий рака молочной железы, таких как MCF-7 и T47D. Они были получены из плеврального выпота у пациентов с распространенным раком молочной железы, которые были alreaду получил несколько процедур 5. Биологическая значимость результатов в таких простых моделей в пробирке в человеческой груди является спорным вопросом, гены-мишени, указанные в этих моделях в пробирке отличаются от генов-мишеней, которые определены в животных моделях 6. При первичной молочной железы человека эпителиальные клетки культивируют в пробирке, они теряют экспрессию рецептора гормона и, следовательно, гормон ответ 7,8. Эта проблема может быть circumventd изощренными 3D подходов с использованием Матригель. Таким образом, Кларк и его коллеги преуспели в создании молочной железы эпителиальные клетки, которые поддерживали экспрессию рецептора гормона и показал пролиферативного ответа на стимуляцию прогестерона 9. Тем не менее, два важных в естественных целевых генов рецептора прогестерона, Wnt-4 и RANKL, не индуцируется при стимуляции прогестерона в этой системе 9. Этот подход был недавно принял дальше с в пробирке гормон предварительной обработки и индукция RANKL была достигнута 10. Предостережение остается то, что матригель имеет виды деятельности, которые партия-зависимыми, стоит дорого, и требует экспериментального дизайна, что, вероятно, для только небольшое количество клеток.

Основано на обнаружении того, что в естественных условиях ER и PR сигналов в значительной степени, опосредованного паракринных взаимодействий 11, мы утверждали, что межклеточные взаимодействия должны быть сохранены. Еще одним важным фактором, который теряется в виде тканей диссоциируют на отдельные клетки культуры в пробирке являются взаимодействия эпителиальных клеток с внеклеточным матриксом; пока они имеют решающее значение для дифференциации эпителиальных и их нарушение является важным в туморогенеза 12. Имея это в виду, мы разработали способ, чтобы изолировать ткани молочной железы микроструктур из свежих хирургического сброса материала 13. Паренхимы, состоящий из двухслойного эпителия с внутренней просвета и наружной myoepitheliAl клетки, отсечен от жировой ткани и подвергают механической и ферментативной диссоциации. После промывки и центрифугирования, фрагменты молочных протоков получаются, которые сохраняют тесное взаимодействие со многими стромальных клеток. Эти ткани микроструктуры остаются гормон реагировать. Модель была подтверждена в клинических образцах 13. Таким образом, настоящее процедура может помочь изучать действие гормонов в груди в биологически и клинически соответствующем контексте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Общие соображения: загодя, созданных протокол этика, подготовить вопросники для пациентов, и посмотреть на обучение клинического персонала. Перед использованием материала из редукционная маммопластика хирургии, обеспечить разрешений, и обеспечить согласие пациента. Ткань может быть инфекционным и должен быть обработан соответствующим образом. Этот протокол был одобрен этическим комитетом ISREC - Швейцарский институт экспериментальных исследований рака.

1. Ткань Recovery, производство и Bio-банкинг

Для обеспечения оптимального качества образца для био-банкинга, количество шагов осуществляется в больнице до транспортировки в лабораторию.

В больнице:

  1. Получить тканях молочной железы в стерильных условиях в результате сокращения маммопластика хирургии и крови, если это необходимо. Ткань должна быть рассмотрена патологоанатома, который будет отведать исключить наличие злокачественных новообразований.
  2. Поместите груди твыдавать под капотом на стерильной доски и подготовить ножницы, хирургический скальпель и пинцет, которые уже стерилизованы с парового стерилизатора. Сделайте глубокий вырез на различных участках ткани молочной железы с помощью скальпеля, чтобы открыть его. В ткани молочной железы человека искать белых нитей, состоящих из воздуховодов и долек, которые встроены в желтом жировой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: соотношение белого паренхимы к желтому жировой ткани отличается у женщин; как правило, молодые женщины имеют более эпителиальной ткани.
  3. Выберите куски белой материи и держать их щипцами, а затем разделить их осторожно из жировой ткани с помощью ножниц. Избегайте брать кровеносные сосуды.
  4. Промыть кусочки ткани в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,2, чтобы удалить кровь. Передача ткани до 250 мл пластиковые флаконы, содержащие среду F12 (средний F12 модифицированной Дульбекко Игла) без фенолового красного с 2% пенициллина / стрептомицина (в том числе 5000 ед / мл пенициллина и 5000 мкг / мл стрептомицина) и 1% ANtibiotic / амфотерицин В (в том числе 10000 единиц / мл пенициллина, 10 000 мкг / мл стрептомицина и 25 мкг / мл амфотерицина B). Магазин тканей в среде для транспортировки в лабораторию.
  5. Подготовка части 3 - диаметром 5 мм для РНК и белка добычи и вспышкой заморозить их в криопробирки холодным (сухой лед) изопентана. Перевести их в сухом боксе со льдом для транспортировки в лабораторию.
  6. Положите кусочки 3 - 5 мм в форму и покрыть ее слоем оптимального раскроя температура (ОКТ), а затем поместить форму на плоской нижней части ящик, наполненный холодной изопентана. После полного замораживания передавать форму в окне сухого льда.
  7. Fix 5 штук 3 - 5 мм в диаметре в параформальдегиде (PFA) 4%, еще 5 штук в формальдегид (ФА) 4% в PBS при комнатной температуре гистологического анализа позже. Два различных фиксаторы рекомендуется, поскольку некоторые антитела лучше работать с одной или другой из этих двух.

В лаборатории:

  1. Сделатьдокументарные всю информацию о маммопластики восстановления, дата операции и будет ли образцов получены слева по сравнению с правой груди.
  2. Поместите замороженные образцы при -80 ° С и передачи фиксированных тканей в гистологии кассеты после 2 ч фиксации. Затем поместите их либо в PBS, или 70% этанола, для O / N хранении при 4 ° С. На следующий день, трансфер гистологии кассеты в гистологии объектов для парафин.

2. Ткань Пищеварение и гормональная стимуляция

  1. Передача бутылки, содержащие образцы тканей к шкафу с ламинарным потоком в комнате Р2 клеточной культуре. Поместите кусочки ткани на стерильных разделочную доску (29 х 19 см). Держите материал с пинцетом и очистить оставшиеся жировые и сосуды от паренхимы молочной железы (белая часть) скальпелем. Поместите белый материал в PBS в 10 см блюдо культуры.
  2. После удаления жирных материал из всех частей и утилизации их в соответствии с правилом безопасностис лабораторией, поместите белых частей, содержащих эпителиальных тканей обратно на разделочную доску. Использование противоположные скальпели резать ткань и нарезать его на куски диаметром до 2 мм.
  3. Поместите фарш материал в пробирки соответствующего размера: до 1, 2,5 и 10 мл в 5, 15 или 50 мл пробирки, соответственно. Обычно 5 мл дает трубки достаточно материала для парафина заделки и гормонов стимуляции и в 15 мл дает трубки достаточно материала для клеток с возбуждением флуоресценции Сортировка (FACS). Большие трубы используются для замораживания аликвот.
  4. Подготовка пищеварения мастер смесь, состоящую из среды (DMEM / F12 без фенола красного) с 1% пенициллина / стрептомицина / амфотерицина В и коллагеназы А (Clostridiopeptidase А из Clostridium histolyticum). Доза коллагеназы в соответствии с временем пищеварения.
    1. Для 12, 24 и 36 ч инкубации, использовать конечную концентрацию коллагеназы 1,5 мг / мл, 1,0 мг / мл и 0,5 мг / мл соответственно. Добавить мастер пищеварение смесь до 4 раз вОбъем переваренной материала, чтобы обеспечить адекватное перемешивание и аэрацию.
      Примечание: В зависимости от эксперимента и продолжительности стимуляции гормона, добавление гормонов во время или после ферментативного расщепления этапе восстановления и микроструктуры.
  5. Добавить гормон (ы) в желаемой концентрации для тестирования образцов и транспортного средства с контролем. Для стимуляции 17-β-эстрадиола, и promegestone (R5020) используют в конечной концентрации 20 нМ.
    Примечание: R5020 представляет собой синтетический агонист рецептора прогестерона, который является более стабильным, чем природного прогестерона в среде.
    1. Место трубки на вальцовый смеситель внутри инкубаторе при 37 ° С и 40 оборотов в минуту O / N. Перед помещением образцов на смеситель, ресуспендируют их очень хорошо для того, чтобы все материалы, распределяет по центрифужные пробирки.
  6. Как пищеварение занимает по меньшей мере 12 ч (O / N), для стимуляции гормона раза меньше, чем 12 часа, добавить гормоны после восстановления микроструктур (де-хвост под шаге 3). Добавить гормоны, как вы ресуспендируйте микроструктуры и поместите суспензии на ультра-низких пластин крепления. Тканевые микроструктуры могут быть сохранены на ультра-низких пластин крепления на срок до 7 дней в ростовых факторов среды, свободной, сохраняющих около 70% жизнеспособность.
  7. Для РНК и анализа белков, сбора ткани микроструктуры центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин и флэш замораживание в центрифужные пробирки.

3. Восстановление тканей микроструктур

  1. Центрифуга трубки (ы) в 400 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте жир из верхней части трубки центрифуги и перенести супернатант оставшегося водного супернатанта, который обогащен в фибробластах, в новом центрифужную пробирку и центрифугируют при 1250 х г в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда ткани груди микроструктуры очень липким, для всех последующих шагов ресуспендируют осадок, осторожно перемешивая трубку. Пипетирование не рекомендуется из-за риска потерять материал.
  2. Ресуспендируют гранул, обогащенных микроструктур и в фибробластах, полученных из водного супернатанта в PBS, 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Впоследствии спина обе трубки на 1250 мкг в течение 5 мин, а затем отбросить супернатанты.
  3. Ресуспендируют гранул в 3 - 5 мл красного буфера для лизиса клеток крови и передавать их в чистые пробирки. Инкубируйте их в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Добавить 2x объем PBS, 2% FCS, и центрифугировать их в 1250 х г в течение 5 мин. Промыть гранул с PBS, 2% FCS и центрифуге при 1250 х г в течение 5 мин. Повторите этот шаг дважды.

4. Образцы для проточной цитометрии

  1. Добавить 1 - 2 мл трипсина 0,25% к осадку и смешать его с помощью пипетки вверх и вниз очень осторожно в течение 2 мин с 1000 мкл Pipetman диссоциировать клетки.
  2. Блокировка активности трипсина путем добавления 9 мл PBS, 2% FCS. Центрифуга при 450 мкг в течение 5 мин и вновь суспендируют таблетку в 10 мл PBS, 2% FCS.
  3. Передача клеточной суспензии на сито 40 мкм клетки, размещенной на топ из 50 мл центрифужную пробирку, чтобы подготовить отдельные клетки. Если несколько микролитров клеточной суспензии остаются на верхней части фильтра, помочь им пройти через фильтр с аспирацией их от другой стороны фильтра с пипеткой и добавить их к отфильтрованным микроструктур.
  4. Отдельные иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки из микроструктур с коктейлем анти-CD45, анти-ФАП и анти-CD31 антитела, а затем сортировать их FACS, основанный на пан-эпителиальной маркер ЕрСАМ и CD10, чтобы отделить его стенке и базальные клетки соответственно 10 ,

5. Образцы для гистологии

  1. После промывки механически и ферментативно переваренный материал, как описано выше, устранить гранулы из 1,5 мл исходного материала в 1 мл 4% PFA в PBS при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Центрифуга на 1250 мкг в течение 5 мин и промывают 1 - 2 мл PBS в два раза.
  3. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин. В течение этого времени подготовки 1% многоцелевой агарозы в Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) буфера и нагревают раствор в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не доходит до кипения.
    1. Удалить раствор из микроволновой печи и вихрем колбу осторожно перемешать раствор и ресуспендируют оставшиеся частицы агарозы. Холодный раствор агарозы до 50 ° С и заливают 1 мл в парафин базовой формы, размером 31 × 23 × 13,5 мм.
  4. Жидкость над осадком сливают и помещают в гранул в верхней части затвердевшего слоя (1 - 3 мм) агарозы с использованием шпателя с плоским концом. Покройте их все с дополнительным слоем агарозы (40 ° C).
  5. После агарозном затвердевает, как правило, в течение 5 мин, положить агарозном блоки в гистологии кассеты для парафина замоноличивания. Наряду с образцами агарозные поместите белый офисную бумагу в кассету всей информации о количестве редукционная маммопластика, экспериментальных условиях, а также дату письменного маленькими буквами карандашом; это письмо выдерживает все последующие стадии обработки.
  6. Положите кассеты вPBS O / N, или в 70% -ном этаноле для хранения в течение выходных дней, при 4 ° С. Мы не заметили никакой разницы между двумя хранения данных. Затем перенесите гистологии кассеты для гистологии объектов для парафин.

6. морозильные микроструктуры (Future Культивирование)

  1. Ресуспендируют ткани микроструктуры в замораживании среду, состоящую из FCS с 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и заморозить 1 мл аликвоты в криопробирки. Количество полученных криопробирки зависит от количества первичного материала, полученного из восстановительной маммопластики.
  2. Замораживание криопробирки, содержащие ткани микроструктуры с использованием контролируемой скорости морозильник со следующей программой: 5 мин жилого при 4 ° С, снижение температуры до -7 ° C со скоростью 6 ° С / мин, снижении температуры до -12 ° С с Скорость 6 ° С / мин, 10 мин жилища, снижение температуры до -40 ° С со скоростью 6 ° С / мин, уменьшение температуры до -80 ° С сСкорость 6 ° С / мин. Затем передайте эти криопробирки до -80 ° C морозильнике.
  3. На следующий день, передавать криопробирки от -80 ° С до бака с жидким азотом для длительного хранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для изучения роли эстрогенов и прогестерона и лучше понять их молекулярная функции в человеческой груди, мы собираем свежие образцы ткани молочной железы человека от больных, перенесших mammoplasties сокращения (рис 1) после получения информированного согласия. Мы также получения медицинской и репродуктивного историю пациентов, а также образец крови для определения уровня сывороточного прогестерона на момент операции. Ткань из свежих mammoplasties сокращения механически и ферментативно диссоциированных....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Культура экс естественных описано здесь, представляет собой ткани микроструктуры груди, содержащие интактные каналы и дольки, наряду с другими типами клеток, обычно находящиеся в человеческом женской груди. При обработке ткани молочной железы человека, как правило, полученного из mammoplasties сокращения, удаление жировой ткани, механические и ферментативным расщеплением стромальной матрицы и лизиса эритроцитов обогащает для молочных протоков фрагментов и концевых протоков долек единиц. Нежный ферментативное ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят М. FICHE Университетского госпиталя Лозанны для обеспечения маммопластика фотографию, М. Вирт и А. Ayyanan из Швейцарского института экспериментальных исследований рака, Национальный центр компетенции в области исследований молекулярной онкологии, школа естественных наук, Высшей Федеральной политехнической де Лозанна для оказания технической помощи и Р. Кларк Университета Манчестера за критические замечания. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил поддержку от SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, и инновационных лекарственных средств инициатива совместного проекта под грантового соглашения нет. 115188, ресурсы которой состоят из финансового вклада Седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 / 2007-2013) и Европейской федерации фармацевтической промышленности и ассоциаций компаний в своем роде вклад. Веб-адрес Инициативу по инновационным лекарственным это http://www.imi.europa.eu/ .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микролитровая центрифугаHeraeus Biofuge Fresco75005521
центрифуга 5810REppendorf5810 000.327
CryoboxNalgene   5100-0001
Морозильник с регулируемой скоростью EF600 GrantAsymptote EF600
CO2Hera Cell Heraeus51022391
Роликовый миксер SRT9DSturtSRT9D
Гистологические кассетыMedizintechnik81-0021-00
Клеточный фильтрFalcon352340
Strile Surgical Blade ЭскулапBB536 
СкальпельAesculapBB084R
ЩипцыAesculapBD047R
НожницыAesculapBC374R
Парафиновая основа формаSAKURA4166
Оптимальная температура резки (OCT) CryomatrixThermoscientific6769006
пенициллин/стрептомицин Life Technologies15070-063
Антибиотик/АнтимикотикLife Technologies15240-062
DMEM F/12Life Technologies11039-021Предтеплый (37 ° C)
КоллагеназаРош11 088 793 001Предтеплый (37 &dg; C)
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies10270может быть заменена
на буфер для лизиса кровиSigmaR7757
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD2650
Трипсин-ЭДТАLife Technologies15400-054
Агарозныйинвитроген16500-500
ФормальдегидSigmaF1635
ПараформальдегидRoth335
ИзопентанSigmaM32631
ЭтанолMerck1009831000
Криогенные флаконы (5,0 мл)VWR, International479-0820
Чашка для культуры со сверхнизкой степенью прикрепленияCorning, NY 148313471
инкубатор эмбриональных телячьих клеток

Ссылки

  1. Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
  2. MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
  3. Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. 'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
  4. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178(2011).
  5. Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
  6. Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210(2012).
  7. Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
  8. Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
  9. Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
  10. Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214(2013).
  11. Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
  12. Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
  13. Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155(2013).
  14. Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
  15. Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 2/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

Теги

ткань молочной железы человекамикроструктуры тканейферментативное перевариваниесортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортерагормональная чувствительностьстромально-васкулярная фракцияпроточная цитометрияэкстракция РНКгистологический анализ
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.