Методы для сравнения питательных веществ в перги сделан африканизированных и европейской медоносных пчел и воздействие на Гемолимфа белка титров

Краткое содержание

Вот методы количественной оценки питательных веществ в пыльце до и после ее преобразования в пчелиный хлеб двумя подвидами медоносных пчел. Мы описываем методы измерения потребления перги и полученных титров белка у обоих подвидов.

Аннотация

Медоносные пчелы получить питательные вещества из пыльцы, которые они собирают и хранят в улье, как перги. Мы разработали методы управления источником пыльцы, что пчелы собирают и конвертировать в перги, помещая колонии в специально построенном закрытом помещении полета. Были разработаны методы для анализа состава кислоты белка и аминокислоты пыльцы и перги. Мы также описать, как потребление перги была измерена и методы, используемые для определения взрослых рабочая пчела кровь и лимфа белка титры после кормления на перги для 4, 7 и 11 дней после появления всходов. Методы были применены, чтобы определить, если генотип влияет на конверсию пыльцы перга и скорость, что пчелы потребляют и приобрести белок из него. Два подвида (европейские и Африканизированные пчелы; EHB и AHB соответственно) были обеспечены того же источника пыльцы. На основании разработанных методов, перга производится как подвид, имели более низкие концентрации белка и значения рН, чем пыльцы. В общем, аминокислоты CONцентрации в перги из любой Ehb или АОБ были похожи, и произошло на более высоких уровнях перги, чем в пыльце. И АОБ и EHB потребляется значительно больше из перги сделанной АОБ, чем Ehb. Хотя EHB и АОБ потребляется одинаковое количество каждого типа перги, концентрации кровь и лимфа белка в ОГВ были выше, чем в Ehb. Различия в приобретении белка от АНВ и Ehb может отражать экологические адаптации, связанные с географическим регионам, где каждый подвид развивались. Эти различия могут способствовать успешному созданию населения AHB в Новом Свете из-за воздействия на расплода и роста колоний.

Введение

Питание играет основополагающую роль в здоровье и бодрость пчелиных колоний, а также в их создании, как населения. Питательные вещества, поступающие с пищей обеспечивают энергию и биохимические компоненты, необходимые для расплода, терморегуляции, питание и иммунный ответ. Для пчелиных колоний, питательные вещества, необходимые для роста населения колоний и поддержания их здоровья приходят из нектара и пыльцы. Сок обеспечивает углеводов и пыльца снабжает оставшиеся диетические требования, такие как белка, липидов, витаминов и минералов ^1.

Подвид медоносных пчел может отличаться в питательном основе параметров колония уровня, таких как работник долголетия, расплода и механизмов социальной иммунитета ^2-6. Эти различия могут быть связаны с тем, как пища, особенно пыльцы обрабатывается колонии и расщепляли у людей. Пыльца хранится в гребенчатых элементов и через микробиологически опосредованного ферментации молочной кислоты, химически изменены ^{7-10. Ферментированный пыльца называется перга. Там может быть генотипических различий между подвидами в их способности приобретать питательные вещества из пыльцы, которые они собирают и хранят, и это может повлиять на рост колоний и выживаемость. Генотипические воздействие на пищевой промышленности и приобретения питательного были зарегистрированы в других организмах в результате чего некоторые люди, чтобы получить больше питательных веществ и калорий, чем другие, потребляя те же продукты 11-14.}

Здесь мы опишем методы, используемые для сравнения состава и потребления перги, сделанное различных подвидов медоносных пчел. Методы измерения в результате ГЕМОЛИМФЫ белка титры в рабочих пчел также описаны. Предыдущие исследования на питательной композиции перги было сделано с европейскими пчелами меда (Ehb) ^10,15,16. Тем не менее, могут быть различия в перги из пчелами различных подвидов, даже когда они питаются той же пыльцы. EHB и АОБ были сравнивать, потому что эти подлодкиpecies имеют различные поведенческие и физиологические различия, которые могут быть связаны с пищевой и питательной приобретения ^17. Некоторые из наиболее заметных различий в том, что АОБ собирать и потреблять больше пыльцы, чем Ehb и, кажется, превратить его легче в выводке ^18. AHB колонии имеют более высокие показатели роения, чем Ehb и скрыться, когда продовольственные ресурсы становятся ограниченными ^19-23. Побега редко встречается в Ehb. АНВ также имеют более высокие скорости метаболизма, чем Ehb ^24. Питательной основой для различий колония уровне между Ehb и АОБ может быть связана со скоростью сбора пыльцы, а также его содержания питательных веществ (например, аминокислот и белка) после преобразования в перги. Перги потребление и в результате приобретения белок также может играть роль в различиях колония уровне между Ehb и АНВ. Использование разработанных методов, EHB и АОБ сделал перги из того же источника пыльцы. Перга затем подается обратно к пчелам ВАСч подвидов и может определить, является ли пчелы получить белок из перги таким образом, отличительной их подвидов или источника перги.

Протокол

1. Получение перги из AHB и Ehb колоний

1. Поместите пыльцы ловушек на пчелиных колоний и собирать пыльцу. Измельчить пыльцу в мелкий порошок (по аналогии с пыльцой, пролитой из пыльников), используя кофемолку.
2. Создание 5 колоний каждый из АОБ и Ehb в закрытом помещении полета (ОДВ), так что пчелы добывают только на пыльцу услуг. Чтобы предотвратить работников от дрейфующих между Ehb и AHB колоний, разделите ОДВ в отдельных разделах, так что пчелы не могут пересекать границу между ними. Место отдельных Ehb или AHB колонии с 3500-4000 рабочих пчел, воск гребень с нектаром, медом, незрелой расплода и пустой гребнем в каждой секции ОДВ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В колонии не были сохранены пыльцу, когда установлено. Скорость, что пыльца хранится может быть увеличена, не включая кладку королеву в колонии.
3. Поток заземления пыльцы колоний путем размещения поднос с пыльцой в каждой секции ОДВ. Распространение около 60 г пыльцы на каждой тарелке, так что foraginг пчелы могут собрать его как corbicular нагрузки и сохранять пыльцу в своих колониях, как перги. Продолжить обеспечивая свежей пыльцой на каждой тарелке в день в течение 3 недель.
4. Обратитесь к перги из европейских колоний Европейского перги (EBB), а из африканизированных колоний, как Африканизированные перги (ABB).

2. Кормление пчел в клетках

1. Место кадры закрытой рабочего расплода от AHB и Ehb колоний в отдельных всходов клеток в экологической комнате установлена ​​в 32-34 ° С и относительной влажности 40% ..
2. Когда рабочие выходят и около 24 ч старый, установить 12 оргстекла биоанализа клеток (размеры = 11,5 х 7,5 х 16,5 см ³⁾ и добавить либо 100 вновь возникших Ehb или 100 вновь возникших AHB рабочие пчелы на каждой клетке. Поставьте раздел гребень с известным числом либо EBB или ABB клеток (24-30 клеток в одной клетке) в каждую клетку, чтобы генерировать следующие комбинации лечения: АОБ ФРС ABB, EHB ФРС ABB, АНВ ФРС приливы и EHB ФРС низком уровне. (4 процедуры; 6Клетки в лечении; 24 клеток в общей сложности).
3. Добавить флаконы с водой и 50% меда и водный раствор, сформулированные по объему каждой клетке. Пополните мед и воду флаконов в день в течение 11-дневного периода исследования.

3. Работник Отбор Пчелы и перги и оценки потребления

1. Пример 10 вновь появившийся Ehb и AHB работников до размещения их в клетках. Обращайтесь к этим, как день 0 пчел и у них служить в качестве основы для концентрации кровь и лимфа белка.
2. Удалить 10 пчел от каждой клетки после того как они подают на ЕВВ или ABB для 4, 7 и 11 дней.
3. Поместите живые пчелы в отдельных микропробирок и установить на пакеты со льдом. Выберите подвыборки из четырех пчел для анализа концентрации кровь и лимфа белка.
4. После отбора проб пчел на день-11, подсчитать количество гребень клеток, которые по-прежнему содержат перги. Это относительное измерение расхода перги.
5. Удалите остатки перги из клеток в каждой клетке и в магазине в SEPARели микроцентрифужных труб по клетке. Хранить образцы перги при -80 ° С до тех пор, пока анализировали на рН, концентрации растворимого белка, и содержание аминокислот.

4. Оценка рН пыльцы и перги

1. Возьмем шесть случайных выборок 0,3 г пыльцы, подаваемого на пчел в ОДВ и растворить его в 300 мкл дистиллированной воды. Измерьте рН с помощью водонепроницаемого двойной копье перехода рН с точностью 0,01.
2. Возьмите 0,3 г образца перги, которая осталась после 11-дневного периода кормления в каждую клетку. Растворить перги в 300 мкл дистиллированной воды и измерения рН, как описано в пыльце (4.1).

5. Белок Анализ

1. Возьмите шесть образцов пыльцы и образец приливы и ABB из каждой клетки. Магазин образцы при -20 ° C до проведения анализа на растворимый концентрации белка.
2. Смешайте 20 мг либо пыльцы или перги с 1000 мкл 0,1 М буферного раствора фосфата (PBS).
3. Воrtex смесь в течение 10 сек и центрифуге при 571,2 мкг в течение 1 мин.
4. Удаление 10 мкл образца супернатанта и место в лунки 96-луночных плоскодонных EIA / RIA полистирола пластины. Репликация каждый образец в трех скважин.
5. Нарисуйте гемолимфу от пчел, собранных из каждой клетки, вставляя 20 мкл капиллярной трубки (которые были с подогревом и вытащил на иглу острием) в правой боковой части грудной клетки вблизи точки крепления крыльев. Сбор дополнительной гемолимфы, если это необходимо, путем вставки одной пробирке в мембрану между брюшной тергитов.
6. Добавить 1 мкл гемолимфы с 9 мкл 0,1 М PBS. Хранить гемолимфе раствора при -20 ° С до анализа на растворимый белок.
7. Определить общую концентрацию растворимого белка в пыльце, перги и образцы ГЕМОЛИМФЫ при помощи промышленного Метод Бредфорда комплект. Следуйте инструкциям производителя.
8. Создание калибровочной кривой для оценки растворимого белка Сoncentration в образцах путем измерения оптической плотности белка с известной концентрацией белка в бычьего сывороточного альбумина (BSA). Измерение белка поглощение при 595 нм с использованием спектрофотометра.

6. Аминокислотный анализ

1. Бассейн отдельные образцы из гребенки клеток каждой колонии, чтобы создать репрезентативную выборку приливы и ABB для анализа.
2. Возьмем 50 мг пыльцы или перги образец взвешивают в автосамплеров флаконах, и добавить 1 мл дистиллированной воды во флакон вместе с 100 мкл 50 нг / мкл раствора внутреннего стандарта, состоящей из D-аланина _4, д ₂₃ -lauric кислоты, ¹³ C ₆ -глюкозы и d ₃₉ -arachidiac кислоты.
3. Закрывают пробу и ультразвук на 5 мин.
4. Условию картридж HLB добавлением 1 мл метанола, уравновешенную добавлением 1 мл дистиллированной воды с последующим добавлением 1 мл перги или пыльцы образца. Вымойте картридж с 1 мл 5,0% MeOH / H ₂ O и ГЛПТе на 1 мл 80% MeOH / H ₂ O.
5. Выпаривают образца до сухости под потоком азота. Развести образца с 50 мкл пиридина и 100 мкл N, O-бис (триметилсилил) трифторацетамида + триметилхлорсилана (БСТФА + ТМС).
6. Крышка и инкубировать образец при 70 ° С в течение 30 мин.
7. Разрешить образец остыть и перенести его на чистую пробирку автоматического пробоотборника.
8. Крышка и поместить образец в масс-селективным детектором сопряжен с помощью газового хроматографа, чтобы проанализировать образцы и для летучих соединений и органических кислот. Отделите сахара и органические кислоты следующие TMS производных с BSTFA + ТМЦ с использованием колонки (30 м 0,25 мм ID) с толщиной 1,0 мкм пленки.
9. Установка печи колонку при 50 ° С в течение 2 мин, затем увеличить температуру линейно до 290 ° С со скоростью 5 ° С / мин. и удерживайте в течение 7 мин. Установка GC инжектор и ГХ / МС интерфейс 250 ° С и 290 ° С соответственно.
   1. Используйте гелия в качестве носителя на танцполW скорость 1,0 мл / мин. Установите источник температуру мс до 230 ° C.
10. Настройка и калибровка масс-спектрометра ежедневно с перфтортрибутиламин (PFTBA). Используйте 1 мкл инъекции PFTBA в полном проверки (35-700 а.е.м.) режиме положительных ионов для получения данных о наличии и концентрации аминокислот.

Результаты

Перга хранилась в -80 ° С в течение менее чем за месяц до того, проанализированы рН и белков концентрации и в течение примерно 4 месяцев до аминокислотного анализа. Перги отличается от цветочной пыльцы рН и концентрации белка (рис 1). Значение рН перги была ниже, чем в пыльце, как было концентрация белка. И EHB и АОБ потребляется больше ABB, чем ЕВВ (рисунок 2).

Уровни растворимого белка в гемолимфе АОБ были значительно выше, чем Ehb независимо от типа перги они потребляли (рисунок 3). Эти различия в уровнях белка гемолимфы произошло несмотря на то, EHB и АОБ потребляется одинаковое количество каждого типа перги. Возраст пчел в момент отбора проб значительное влияние растворимых концентрации белка в гемолимфе. Концентрации белка были значительно ниже в день за 4 пчел по сравнению с днем-7 или 11, которые не отличаются.

_content "> Из аминокислот 10, которые необходимы для медоносных пчел, все, кроме гистидина были обнаружены в пыльце. В большинстве случаев, концентрации аминокислот, измеренные в перги были выше, чем в пыльце (Рисунок 4). Например, концентрации лейцин и треонин были примерно на 60% выше в сравнении с перги пыльцы, а концентрации валина было около 25% выше. аланин, аспарагиновая кислота уровни, глутамин, метионин и также были выше в перги, чем в пыльце. Аминокислоты концентрации не сильно отличаются между АББ и ОТЛИВ за исключением фенилаланина и цистеина. уровень фенилаланина было примерно в два раза выше в сравнении с ABB либо ЕВВ или пыльцы. цистеина концентрации были ниже в сравнении с ЕВВ ABB или пыльцы. триптофан присутствует только аминокислоты в более высоких концентрациях в пыльца, чем в ЕВВ или ABB. Концентрации пролина и пыльцы ABB были выше, чем в низком уровне.

Рисунок 1: Сравнение рН (А) и растворимых концентрации белка (б) в пыльцы и перги из европейских (EHB) или Африканизированная (АОБ) медоносных пчел. Значение рН пыльцы была значительно выше, чем перги, как определено с помощью дисперсионного анализа (F _2,12 = 3725, р <0,0001) с последующим тестом множественного сравнения Tukeys W-. Концентрация белка в пыльце была значительно выше, чем в перги сделанной Ehb (EBB) или ОГВ (ABB) (F _2,27 = 16,49; р <0,0001). Средства затем той же буквой существенно не отличаются на уровне 0,05.

Рисунок 2: средний процент челLs содержащие перги, которые были полностью израсходованы в течение 11 дневного перерыва в клетке пчел. перга была осуществлена ​​посредством либо европейской (EHB) или Африканизированная (АОБ) пчел, используя тот же источник пыльцы. Средства были оценены с пяти клеток каждого лечения; те, с той же буквы, существенно не отличается на уровне 0,05, как определено в одну сторону дисперсионного анализа (F _3,16 = 7,3, р = 0,003) и W теста Тьюки. Этот рисунок был изменен с ^25.

Рисунок 3: Средняя концентрация белка в гемолимфе от европейских (EHB) или африканизированных (AHB) медоносные пчелы кормят перга производится европейских (EBB) или африканизированных (ABB) пчел 4, 7 и 11 дней анализа повторных измерений. Разница указано существенные различия среди 4 очистныеtment группы (F _3,20 = 19,7, р <0,001). Уровни растворимого белка в AHB подаваемого ABB, значительно выше, чем EHB подаваемого ABB (р = 0,008) или отливов (р = 0,018). Возраст пчел в момент отбора проб значительное влияние растворимых концентрации белка в гемолимфе. Уровни были значительно ниже в день-4 пчел по сравнению с дневной 7 (р <0,0001) или 11 (р = 0,001). День 7 и day11 пчелы не отличались (р = 0,149). Эта цифра была изменена с ^25.

Рис. 4: Концентрации аминокислот (мкг на грамм пыльцы или перги) в пыльце или перга сделана из него отлив есть перги сделаны европейских пчел и АББ был сделан африканизированных пчел. Триптофан, цистеин, фенилаланин и пролин были построены отдельно для ясности в предварительномляющих их количество. Эта цифра была изменена с ^25.

Обсуждение

Используя методы, описанные выше, мы обнаружили, что перга производится АОБ было потреблено в больших количествах, так АОБ и Ehb. Хотя EHB и АОБ потребляется одинаковое количество каждого типа перги, AHB имели более высокие титры белка гемолимфы. Результаты, основанные на наших методов были похожи на предыдущие доклады, где уровень гемолимфы белка в ОГВ были выше, чем в Ehb хотя и кормили тем же диеты ^26. Измеряя потребление приливы и ABB, которые были потребляемого при различных скоростях обеими Ehb и AHB, было установлено, что концентрация белка гемолимфы в каждом подвида не может быть увеличена за счет увеличения потребления пищи. Там, кажется, плато для концентрации белка гемолимфы у работников медсестра пчел возраста и что уставка для плато выше в ОГВ, чем Ehb.

Есть несколько важных условий для создания колонии для перги производства, позволит оптимизировать скорость хранения пыльцы. Во-первых, соlonies нужно кадры с открытым расплодом. Без открытым расплодом, чтобы накормить, рабочие не будет собирать много пыльцы. Во-вторых, колония должна быть queenless так что никаких дополнительных выводок не производится. Расплода требует большого количества пыльцы, и только избыток пыльцы сохраняется. В небольших колоний, созданных в области ОДВ, было бы мало пыльцы быть сохранены как перги, если выводок области расширяются так колонии должны быть queenless. Наконец, для перга быть сделаны, пыльца должна быть собрана в corbicular нагрузок и находится в гребенчатых клеток. Если пыльца собирают в пыльцевых ловушек, он должен быть измельчен в мелкий порошок, прежде чем представлять его на пчел, чтобы они могли собрать его в corbicular нагрузок.

Методы измерения потребления перги генерируется скорее качественный, чем абсолютные оценки. Только потребительский, что было подсчитано было, когда клетки были полностью очищены от пчелиного хлеба. Более точная оценка общего потребления пчелиный хлеб может быть получено путем удаления пчелиный брEAD из клеток и превращение его в пирожки, которые могут быть взвешивают до и после периода исследования. Тем не менее, мы хотели сохранить пчелиный хлеб в клетках, чтобы пчелы могли питаться ею, как в колонии и, возможно, продолжить обработку его в течение периода исследования. Разница в массе секций гребенки до и после исследования, не был использован в качестве оценки потребления, потому что вес может быть увеличен, так как пчелы поставить разбавленный мед, подаваемого в них в некоторых клетках.

Рабочие также могли бы добавить некоторые разбавленного меда пчелиного хлеба. По этим причинам, клетки, содержащие примерно равные количества пчелиного хлеба до и после периода кормления подсчитывали и вызвала качественное измерение. Тем не менее, было поразительное различие между двумя типами перги числа пустых ABB подсчитанных клеток по сравнению с ЕВВ после 11 дней.

Определение при хранении пыльцы становится пергой может быть диfficult, потому что пчелы постоянно добавлять пыльцу клеток. Колонии, используемого для получения перги были созданы с кадрами открытым расплодом так пчелы собирают пыльцу. Тем не менее, колонии были queenless так было личинки питаются только около 9 дней после колония была создана. Для остальной части 3-недельного периода, когда колонии были в ОДВ, пыльцы, что пчелы, собранные хранились и были преобразованы в перги. Ведение хранится пыльцу в сотах клеток для дополнительных 11 дней при кормлении его для пчел в клетках может также продолжили обработку пыльцы перга. Превращение пыльцы перга занимает около 7 дней ^8. Перга подается Ehb и АОБ имели более низкий рН и снижение концентрации белка по сравнению с пыльцевой ФРС. Аналогичные выводы об изменениях в пыльце после преобразования перги были зарегистрированы другими ^7,10,27. Наши результаты отличались от предыдущих докладов тем не менее, в том, что существуют различия в концентрации OF некоторые аминокислоты между перги и пыльцы. Изменения в обеих концентрациях белка и аминокислот может быть связано с деятельностью протеолитических ферментов, источником которого может быть сами или микробные сообщества, созданные в перги ^7,8,28,29 пчелы.

Методы, используемые для измерения концентрации белка были похожи на описанные ранее, чтобы определить влияние диетического белка на африканизированных и европейских пчел ^26. В качестве расширения методов, мы смогли оценить растворимого белка в пыльце и перги. Эти методы генерируются подобные выводы предыдущих докладах ^7,10,27. Наши результаты обеспечивают дополнительные доказательства, что АОБ более эффективно усваивать диетического белка, чем Ehb, и что это может быть ключевым фактором в экологическом доминирования АОБ в большинстве регионов, где он иммигрировал и сложившуюся ^30-32.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
водонепроницаемый двухпереходный pH-копье	Термо Фишер
Кофемолка	Mr. Coffee	модель 1DS77
Фосфатный буферный раствор Дульбекко	Emd-millipore	BSS-1005-B
EIA/RIA полистирольная пластина	Sigma-Aldrich-Corning	CLS3590-100EA
микрокапиллярные пипетки	Kimble Glass Inc.
Быстрый старт Bradford Protein Assay Kit 2	Bio-RAD	#500-0202
Спектрофотометр	Biotek Synergy HT
Масс-селективный детектор	Картриджный
HLB
	Agilent	6930
Колонка газовой хроматографии	А J& W Scientific	DB-1701
d4-alanine	Sigma-Aldrich	488917
d23-lauric acid	Sigma-Aldrich	451401
13C6-глюкоза	Sigma-Aldrich	389374
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970
N,O-Bis (триметилсилил)трифторацетамид +
Триметилхлорсилан (BSTFA + TMCS)	Sigma-Aldrich	33148
Перфтортрибутиламин (PFTBA)	Sigma-Aldrich	442747-U
d39-арахидиакальная кислота	Кембриджский изотоп