Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни

Ophélie Vacca; Brahim El Mathari; Marie Darche; José-Alain Sahel; Alvaro Rendon; Deniz Dalkara

doi:10.3791/52451

Методическая статья

Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни

DOI:

10.3791/52451

⸱

19 апреля 2015 г.

Ophélie Vacca¹^,²^,³ , Brahim El Mathari¹^,²^,³ , Marie Darche¹^,²^,³ , José-Alain Sahel¹^,²^,³ , Alvaro Rendon¹^,²^,³ , Deniz Dalkara¹^,²^,³

¹Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, ²INSERM, U968, ³CNRS, UMR_7210

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для исследования проницаемости гемато-ретинального барьера и целостности внутренней ограничивающей мембраны в животных моделях заболеваний сетчатки мы использовали несколько вариантов аденоассоциированного вируса (AAV) в качестве инструментов для маркировки нейронов сетчатки и глии. Опосредованная вирусом экспрессия репортерных генов затем используется в качестве индикатора проницаемости барьера сетчатки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Müller клетки являются основными глиальные клетки сетчатки. Их конечные ноги образуют границы сетчатки на наружной и внутренней мембран, ограничивающих (ILM), так и в сочетании с астроцитов, перицитов и эндотелиальных клеток, они устанавливают крови сетчатки барьер (BRB). BRB ограничивает перемещение материала между кровоток и сетчатке, а ILM выступает в качестве базальной мембраны, которая определяет гистологически границу между сетчаткой и полость стекловидного тела. Маркировка Мюллера клетки особенно актуальным изучение физического состояния сетчатки барьеров, так как эти клетки являются неотъемлемой частью BRB и ILM. Оба белорусских рублей и ILM часто изменяется в болезни сетчатки и отвечают за симптомов заболевания.

Есть несколько хорошо зарекомендовавших себя методов исследования целостности BRB, такие как Эванс голубой анализа или флуоресцентной ангиографии. Однако эти методы не дают информации о степени BRB проницаемости тО более крупных молекул, в нанометровом диапазоне. Кроме того, они не предоставляют информацию о состоянии других сетчатки барьерами, такими как ILM. Для изучения Brb проницаемость наряду сетчатки ILM, мы использовали метод, основанный AAV, который предоставляет информацию о проницаемости BRB к более крупных молекул, указывая при этом на состояние ILM и белков внеклеточного матрикса в болезненных состояний. Два варианта AAV полезны для такого исследования: AAV5 и ShH10. AAV5 имеет естественную тропизм к фоторецепторов, но он не может донести до внешней сетчатки при введении в стекловидное тело, когда ILM нетронутыми (т.е. в сетчатке дикого типа). ShH10 имеет сильную тропизм к глиальных клеток и выборочно пометить Клетки Мюллера как у здоровых и больных сетчатки. ShH10 обеспечивает более эффективную доставку генов в сетчатке, где ILM находится под угрозой. Эти вирусные инструменты в сочетании с иммуногистохимии и крови Анализ ДНК пролить свет на состояние сетчатки барьеров в болезни.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Müller клетки являются основным компонентом глиальных сетчатки. Морфологически они охватывают сетчатки радиально и их endfeet, в контакте с стекловидное тело, сталкиваются с ILM и секретные компоненты последнего. ILM является базальная мембрана состоит из около десяти различных белков внеклеточного матрикса (ламинином, агрин, перлекан, нидоген, коллагеновых и несколько гепарин сульфат протеогликаны). Во время разработки, ее присутствие является необходимым условием для сетчатки гистогенеза, навигации оптических аксонов, и выживание клеток ганглиев ^1-3. Тем не менее, ILM необязательно во взрослой сетчатке и может быть удалена хирургическим путем в некоторых....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все животные, используемые в данном исследовании, уход и обрабатывается в соответствии с Заявлением ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research.

1. Получение рекомбинантного AAV (Раав) по временной трансфекции из клеток НЕК-293 ^17,18

ПРИМЕЧАНИЕ: См МакКлюр C, Юпитер (2011) ^19.

Очищают масштабную подготовку плазмиды (по крайней мере 1 мг / мл) из AAV вектор плазмид. Используйте 3 плазмид. AAV хелпер плазмидой, несущей гены репликации и капсида без AAV перевернутой концевые повторы РМЭ, кассету экспрессии трансгена, несущий AAV ITR называют передаточной....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы приведет к росту сетчатки трансдукцию Мюллера глиальных клеток с использованием ShH10 если модель животного показывает возмущения в структуре ILM (фиг.2А - B). Например, мы показали, что в отсутствие Dp71, цели ShH10 специально, но более эффективно Мюллер глиальных клеток по инъекции в стекловидное тело, что свидетельствует о повышении проницаемости ILM в этом мыши линии по сравнению с мышами дикого типа ¹⁶ (рис 2С - F).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BRB регулирует обмен молекулами между кровью и сетчаткой. Его пробой, связанный с различными заболеваниями, такими как диабетическая ретинопатия или возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Мы недавно показали, что в дистрофина нокаут-мыши, который отображает проницаемой BRB, сетчатка становится более снисходительными к доставке гена, опосредованного аденосателлитные вирусных векторов (AAV). Тем не менее, несмотря на BRB частиц проницаемость AAV впрыском внутриглазным оставаться ограничивается глазного отделения в этой .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим платформу визуализации Institut de la Vision. Мы выражаем признательность Французской ассоциации мышечной дистрофии (AFM) за докторскую стипендию в O.V. и Allergan INC. Эта работа, выполненная в рамках LABEX LIFESENSES [артикул ANR-10-LABX-65], была поддержана французскими государственными фондами, управляемыми ANR. Мы благодарим Пегги Барб и Мелиссу Дерозье за техническую помощь в подготовке AAV. Мы благодарны Стефану Фуке за отличную техническую помощь в области конфокальной микроскопии и его экспертный вклад в интерпретацию результатов.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мышиный штамм C57BL6J	JANVIER LABS
Кетамин 500	Вирбак Французский		анестетик
Ксилазин Ромпун 2%	Анестетик	Bayer Healthcare
Неосинефрин 5% Faure	Europhta		дилатант
Mydriaticum 0,5%	Теа		дилатант
Sterdex	Novartis		противовоспалительная
смола для встраивания криоматрикса	Thermo Scientific	6769006
Superfrost Plus Адгезионные слайды	Thermo Scientific	10143352	слайды
антиламинин	Sigma	L9393	антитело
против родопсина клон 4D2	Millipore	MABN15	антитело
антиглутаминсинтетазы клон GS-6	Millipore	MAB302	антитело
Anti-glial Fibrillary Acidic Protein Dako		334	антитело
PNA Lectin	Invitrogen	L32459	зонд
Alexa фторконъюгированные вторичные антитела	Invitrogen		антитела
Fluorsave реагент	Calbiochem	345789	монтажная среда
QIAmp DNA Micro Kit	QIAGEN	56304
GoTaq ДНК-полимераза	Promega	M3001
Эванс Синий краситель	Sigma	E2129	краситель
5 & микро; m фильтр	Millipore
Цитрат натрия	Sigma	S1804
Лимонная кислота	Sigma	C1909-2,5KG
Формамид спектрофотометрический	Sigma	295876-2L
Флуоресцеин	Sigma	F2456	краситель
Micron III	Phoenix Research Labs		Система микроскопии на основе цветной 3-ПЗС-камеры, фреймграббера и готового программного обеспечения позволяет исследователям визуализировать сетчатку мыши.
Инсулиновые шприцы	Terumo	SS30M3109
Шприц 10 & микро; l Hamilton	Dutscher	74487	Seringue 1701
Игла RN G33, 25 мм, PST 2	Научный	11530332	Интравитреальный инъекционный насос
UltraMicroPump UMP3	World Precision Instruments	UMP3	Универсальный инъектор использует микрошприцы для подачи объемов пиколитера
UltraMicroPump (UMP3) (один) с контроллером SYS-Micro4 Цифровой	контроллер		UMP3-1
Бинокулярная лупа SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x светодиодов с подставкой epi и dia / Диссекция сетчатки
Пружинные ножницы прямые - 8,5 см	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Диссекция сетчатки
изогнутая ножницы Vanna ножницы	15004-08
Pince Dumont 5	11254-20
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Life technologies	4375786	Термоамплификатор
Ультразвуковой очиститель	Лабораторные принадлежности	G1125P1T
Nanosep 30k омега пробирки	VWR
Speedvac	Fisher Scientific	SC 110 A
Спектрофлуориметр	TECAN	infinite M1000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Использование аденоассоциированные Касперского как инструмент для изучения сетчатки барьеров при болезни

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи