Представлен протокол для связывания большого разнообразия одиночных молекул ковалентно на зонде АСМ. Приведены методики и примеры для определения силы адгезии и свободной энергии этих молекул на твердых носителях и биограницах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследуя одну молекулу адгезии методом атомно-силовой микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Атомно-силовая спектроскопия является идеальным инструментом для изучения молекул на поверхностях и границах. Экспериментальный протокол для соединения большой выбор одиночных молекул ковалентно на иглой АСМ представлена. В то же время наконечник АСМ пассивируются для предотвращения неспецифических взаимодействий между зондом и подложкой, которая является необходимым условием для изучения одиночных молекул, прикрепленного к кончику АФМ. Анализы для определения силу адгезии, длина адгезию, и свободной энергии этих молекул на поверхности твердых тел и био-интерфейсов в ближайшее время представлены и внешние ссылки для дальнейшего чтения предусмотрены. Пример молекулы поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипид POPE (1-пальмитоил-2-oleoyl- SN глицеро-3-фосфоэтаноламин). Эти молекулы десорбируются с различных поверхностей, таких как CH 3 -SAMs, водорода прекращается алмаза и поддерживается бислоев при различных условиях растворителя. И, наконец,Преимущества силовых спектроскопических отдельных экспериментов молекулы рассматриваются в том числе средства, чтобы решить, если действительно одна молекула была изучена в эксперименте.
Введение
За последние 30 лет, атомно-силовая микроскопия (АСМ) оказалась ценным методом визуализации для изучения биологических 1,2 и синтетические 3 материалов и поверхностей, так как он обеспечивает молекулярную пространственное разрешение во всех трех измерениях и может эксплуатироваться в различных растворителя окружающая среда. Кроме того, АСМ-сингл сила молекула спектроскопии (ОВС) позволяет измерять силы, начиная от ПШ Мп режим и дал беспрецедентный понимание например в сворачивания белка 4,5, физике полимеров 6 - 8, и одного взаимодействия молекула-поверхность 9 - 12 .The обоснование изучения отдельными молекулами....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлены для обзора технологического потока, включающего подготовку, шаги сбора данных и анализа данных.
1. Настройка реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все химикаты должны быть обработаны с осторожностью, и, таким образом, лабораторный халат, следует использовать перчатки и защитные очки. Все операции должны быть выполнены в лабораторном шкафу. В частности, специальные перчатками в случае использования хлороформа.
- Используйте химических веществ с низким содержанием воды, такие как сухого хлороформа быстро и магазина сухой, но не дольше, чем на неделю. Хранить как хи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В дальнейшем, результаты описанных выше примеров молекул, а именно полимеры поли (аминокислоты) polytyrosine, привитой полимер PI-г -PS и фосфолипидов папы, представлены. Во-первых для каждого, например, опыт конкретные детали для сбора данных и подготовки данных предоставляются. Тогда, примерные результаты экспериментов, в которых эти молекулы были десорбированных с различных поверхностей (CH 3 -SAMs, водородные прекращается алмазные и липидного бислоя) показаны. Определение силы адгезии, длина сцеп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В течение последних десятилетий, одиночные эксперименты молекулы обеспечили беспрецедентный понимание молекулярных механизмов и оказалось бесценным подход в области наук о жизни и за ее пределами. Для достижения хороших и значимой статистики из ОВС экспериментов, в идеале один и тот же молекула используется в течение всего курса эксперимента. В отличие от экспериментов с ансамблями молекул, SMF, эксперименты могут обнаружить редкие события и скрытые молекулярных состояний. Еще одно преимущество отдельных экспериментах м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы благодарят DFG (Hu 997/2-2) за финансовую поддержку. FS признает Фонд Ганнса Зайделя (HSS). SKr был поддержан Elitenetzwerk Bayern в рамках докторской программы «Материаловедение сложных интерфейсов». SKi благодарит SFB 863 за финансовую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Equipment
td colspan="4">
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Hellmanex III щелочной жидкий концентрат (раствор моющего средства) | Hellma | ||
| RCA (сверхчистая вода, перекись водорода (35%), аммиак (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond реагент / APTES (3-аминопропил)триэтоксисилан | Vectorlabs | ||
| Сухой ацетон (< 50 ppm H< sub>2O) | Sigma | ||
| Сухой хлороформ (> 99,9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Германия | ||
| Ди-натрия тетраборат (> 99.5%)Биохром | , Германия | ||
| Борная кислота | Биохром, Германия | ||
| Монофункциональная &альфа;-метокси-&омега;-NHS ПЭГ, 5 кДа, " метил-ПЭГ-NHS" | Рапп, Германия | ||
| Гетеробифункциональные α,ω-bis-NHS PEG, 6 кДа, " NHS-PEG-NHS" | Рапп, Германия | ||
| Гетеробифункциональная &альфа;-малеимидогексановая- &омега;-NHS ПЭГ, 5 кДа, " Mal-PEG-NHS» | Рапп, Германия | ||
| Молекула зонда (полимер, липид, и т.д.)< | |||
| Достаточное количество стеклянных кристаллизующихся чашек с носиком (10 мл), стеклянные чашки Петри (500 & микро; l) и стеклянные крышки | VWR International GmbH, Германия | ||
| [header] | |||
| Лабораторная модель печи UF30 | Memmert, Германия | ||
| Термостат | VWR International GmbH, Германия | ||
| Плазменная система "Femto", 100 Вт | Diener, Германия | ||
| Один отдельный стеклянный шприц для каждого органического растворителя | VWR International GmbH, Германия | ||
| Vortex миксер | VWR International GmbH, Германия | ||
| Микроцентрифужные пробирки (0,5 мл или 1,5 мл) | Дозаторы Eppendorf | ||
| : 10-100 & микро; л, 50-200 и микро; л и 100-1,000 &микро; l | Eppendorf | ||
| AFM с жидкостной ячейкой с регулируемой температурой (например MFP-3D с BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Мягкие кантилеверы SiN, обычно изготовленные из нитрида кремния (SiN) (постоянная пружины менее 100 пН/нм, например MLCT) | Bruker AXS, Санта-Барбара | ||
Ссылки
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
