Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52460

⸱

17 февраля 2015 г.

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается метод создания механической травмы сосуда у эмбрионов данио-рерио. Эта модель травмы обеспечивает платформу для изучения гемостаза, воспаления, связанного с травмой, и заживления ран в организме, идеально подходящем для микроскопии в реальном времени.

Аннотация

Эмбрионы

данио-рерио (Danio rerio) оказались мощной моделью для изучения различных процессов развития и заболеваний. Внешнее развитие и оптическая прозрачность делают эти эмбрионы особенно поддающимися микроскопии, а также доступны многочисленные трансгенные линии, которые маркируют определенные типы клеток флуоресцентными белками, что делает эмбрион данио-рерио идеальной системой для визуализации взаимодействия сосудистых, гемопоэтических и других типов клеток во время травмы и восстановления in vivo. Прямая и обратная генетика у рыбок данио хорошо развита, и возможны фармакологические манипуляции. Мы описываем модель механического повреждения сосудов с использованием методов микроманипуляций, которая использует некоторые из этих особенностей для изучения реакции на повреждение сосудов, включая гемостаз и восстановление кровеносных сосудов. Используя комбинацию видео и покадровой микроскопии, мы демонстрируем, что этот метод повреждения сосудов приводит к измеримым и воспроизводимым реакциям во время гемостаза и заживления раны. Этот метод обеспечивает систему детального изучения повреждения и восстановления сосудов на всей животной модели.

Введение

Рыбки данио-рерио широко использовались для изучения различных тем в сосудистой биологии, включая развитие сосудов, ангиогенез, развитие кроветворения и патологию1-3. Эмбрионы развивают функциональную циркуляцию крови, а также лейкоциты и другие компоненты врожденной иммунной системы к 1 дню после оплодотворения (dpf) 1,4,5. Сохранение воспалительной и лейкоцитарной реакции на повреждение сделало эмбрион данио-рерио информативной моделью для таких разнообразных воспалительных процессов, как туберкулезная инфекция, энтероколит и регенерация тканей6-9. Эмбрионы рыбок данио были использованы для изучения воспаления, связанного с травмой, особенно в контексте повреждения эпителия и ответа нейтрофилов10,11. Повреждение эмбриона приводит к высококонсервативному клеточному ответу клеток в месте повреждения и клеток врожденного иммунитета, задействованных для ответа на повреждение и регуляции его разрешения11,12. В других моделях травм использовались сфокусированные лазерные импульсы для пространственной локализации повреждения на конкретных типах клеток, включая нейроны, мышечные клетки и кардиомиоциты13-15.

Эмбрионы рыбок данио-рерио были использованы в качестве модели для изучения гемостаза и тромбоза в условиях фармакологических и генетических манипуляций, используя как механическое, так и лазерно-индуцированное образование тромбов16-19. Компоненты каскада свертывания, по-видимому, хорошо консервативны, а трансгенные препараты позволили детально изучить отложение тромбоцитов и фибрина в месте коагуляции17,20,21. Процедура, представленная в данной статье, дополняет эти методы, предоставляя систему для изучения механических повреждений сосудов, приводящих к разрыву сосуда, образованию и устранению тромбов, а также ремонту сосудов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры с использованием данио были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета UCSF-х годов.

1. Подготовка инструментов

  1. Вставьте мелочах штифт в держатель контактный и зажмите палец.
  2. Использование тонких наконечников щипцов, осторожно отогните кончиком пальца, чтобы создать небольшое крючок.
  3. Для манипуляции и стабилизации эмбриона во время травмы, согните конец 28 ЯЗЫК ½ дюйма иглы, установленной на инсулиновый шприц с использованием остроносые плоскогубцы.

2. Подготовка эмбрионов данио рерио за травмы

  1. Настройка гнездящихся пар данио и собирать яйца в яйца водой (60ug / аквариум солей мл), как было показано ранее 22.
  2. Добавить 0,003% N-фенилтиомочевины (ПТУ) к яичной водой, когда эмбрионы примерно 8 ч после оплодотворения (ФВЧ), чтобы предотвратить меланизации.
  3. Dechorionate два дня после оплодотворения (DPF) эмбрионы до эксперимента с использованием тонких наконечников щипцов.
    Примечание: Эмбрионы могут быть повреждены в любое время после начала циркуляции. Представленные здесь данные для 2 DPF эмбрионов, но техника была успешно применена в эмбрионах до 5 DPF.
  4. Обезболить эмбрионов с 0,02% буферном 3-аминобензойной кислоты (Tricaine) примерно 10 минут до манипуляции.

3. Механическая судно Травмы эмбрионов

  1. Трансфер наркотизированных эмбрионов к депрессии слайда на вскрытии стереомикроскопом с помощью передачи пипетки.
  2. Использование короткого плоскую сторону иглы шприца манипулировать эмбриона с доминирующей стороны, положение эмбриона на бок с вентральной поверхности, обращенной в сторону от иглы.
  3. Установите мелочах контактный с наконечником направлен непосредственно против вентральной поверхности рыбы кзади от открытия мочеполовой. Установите мелочах штифт под небольшим углом, так что изогнутая наконечник может пробить перидермы непосредственно в хвостовую вену (рис 1 </ STRONG>).
  4. Использование иглу шприца, чтобы манипулировать эмбриона, проколоть хвостовую вену с мелочах штифта, нажав на эмбрион в булавку, чтобы немного зацепить штифт в вену.
  5. Использование иглу шприца, потяните эмбрион от мелочах булавку, чтобы создать небольшой разрыв в сосуде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: успешное что приведет к травмам в непосредственной кровотечения из вены.

4. Анализ гемостаза

  1. Выбирайте только эмбрионы с явно циркулирующих в крови клеток для этой процедуры.
  2. Подготовьте, чтобы начать таймер, как только мелочах контактный вытягивается из сосуда.
  3. Запустите таймер, как только потеря крови могут быть визуализированы из раны. При потере крови из раны прекращается, остановить таймер и записывать общее время в время кровотечения. Если свертывания тормозится, записывать время, когда к уже не заметно циркулирующих клеток крови.

5. Анализ заживления ран

  1. Передача позT-травмы животных на стеклянное дно блюд изображений для микроскопии.
  2. Удалить большинство яиц водой.
  3. Обложка эмбрионов в 0,3-1,2% низкой температурой плавления агарозы растворенные в яичном воды, нагревают до температуры 42 и 45 ° С и с добавкой 0,02% Tricaine.
  4. Эмбрионы Позиция на боку с помощью щипцов.
  5. После агарозном охлаждает, заполните блюдо с 0,02% Tricaine в яйце воды.
  6. Получение изображений с помощью светлого поля, эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
  7. Удалить эмбрион из агарозы с помощью щипцов и передать обратно в яйцо воду.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Механические травмы сосуда проводили на 2 денье эмбрионов (фиг.2А - С). Результаты травм при быстрой и надежной связи коагуляции измеряется время прекращения кровотечения (рис 2d). Чтобы определить, может ли или нет быть измерена различия в ответ коагуляции, антикоагулянта гирудина вводили эмбрионов путем инъекции в канал Кювье непосредственно перед ранение (5-10 нл на 1 единицу в мкл гирудина, растворенного в воде) (для демонстрация инъекций в канал Кювье, см предыдущу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Данио рерио были успешно использованы в качестве модели для разных типов ран, включая лазерную травму 13-15, лазерно-индуцированной тромбоз 16 и эпителиальные ранив 10. Мы сообщаем метод механического ранения, которое является простым для выполнения и производит контролируемое повреждение в модели в естественных условиях, что является наиболее подходящей для реального времени микроскопии. Результаты травм при быстрой и измеримых гемостаза ответ и воспроизводимым программы заживл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить докторов Стивена Уилсона и Лизу Вилсбахер за полезные обсуждения. Эта работа была частично поддержана NIH HL054737.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Минутиевые булавкиFine Science Tools26002-10Диаметр наконечника 0,0125 мм, диаметр стержня 0,1 мм
Держатель штифтаFine Science Tools26016-12
Dumont #5 Щипцы с тонким наконечникомFine Science Tools11254-20
Стекло Депрессионное горлоAquatic Eco-SystemsM30
Низкоплавкая агарозаLonza 50081Предварительно нагретый до 42 &m; C
N-фенилтиомочевина (ПТУ)Sigma AldrichP7629
3-аминобензойная кислота (трикаин)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Стеклянные донные чашки для визуализацииMattekP35G-1.5-14-C
Препарирующий микроскопOlympusSZH10
Флуоресцентный микроскопZeissAxio Observer
Aquarium SaltsInstant Ocean
Инсулин шприц с иглой 28,5 гBecton Dickinson 
329461

Ссылки

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351(2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682(2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48(2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.