Методическая статья

Генерация мышиный кардиостимулятор клеточных агрегатов на основе ES-Cell-программирования в комбинации с Myh6-промоутер-Selection

DOI:

10.3791/52465

⸱

17 февраля 2015 г.

 ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy, University of Rostock

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как производить функциональную пазухи узловой ткани из мышиных плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК). T-Box3 (Tbx3) избыточная экспрессия плюс сердца Миозин-тяжелых цепей (Myh6), промотор выбор антибиотика приводит к высокой чистоты кардиостимулятор клеточных агрегатов. Эти "наведенных синусового-тела" ("iSABs") содержат более 80% клеток водителя ритма, обнаруживают сильно повышенные показатели избиение и способны ходить миокарда Экс Vivo.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение "синдром слабости синусового узла" основывается на искусственных кардиостимуляторов. Они несут опасностей, таких как отказ и инфекций батареи. Кроме того, им не хватает гормона реагирования и в целом процедура дорогостоящим. "Биологические водители ритма", полученные от ЧОК может стать альтернативой, но типично содержание клеток водителя ритма в эмбриональные тельца (ЭТ) является крайне низким. Описанный протокол соединяет "вперед программирование" мышиных ЭСК через синусового узла индуктора Tbx3 с Myh6-промоутер основе выбора антибиотиков. Это дает кардиомиоцитов агрегатов в соответствии> 80% физиологически функциональных клеток водителя ритма. Эти "наведенных синусового-органы" ("iSABs") спонтанно сокращается с еще неохваченных частот (400-500 BPM), соответствующих узловых клеток, выделенных из мышиных сердцах и в состоянии ходить мышиный миокарда Экс Vivo. Использование описанного протокола высокой чистоты синусовогоузловые отдельные клетки могут быть получены, которые используются, например, для экстракорпорального тестирования на наркотики. Кроме того, iSABs, полученные в соответствии с настоящим Протоколом, может стать важным шагом на пути сердца тканевой инженерии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Термин "синдром слабости синусового узла" суммирует несколько заболевания, приведшие к ухудшению системы кардиостимулятор. Она включает в себя патологический, симптоматическая синусовая брадикардия, синоатриальной блок, синус арест, а также синдром тахикардия, брадикардия. Таким образом, "больной синдром пазухи" часто сопровождается общими сердечных заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, кардиомиопатии или миокардита. В настоящее время, терапевтические подходы основаны на имплантации кардиостимуляторов электрических. Однако, это идет вместе с рядом рисков, таких как инфекции и неисправности аккумулятора. В целом, частота осложнений прежнему очень высок у пациентов, имеющие имплантированные искусственного водителя ритма. Кроме того, в отличие от эндогенного стимулятора, эти устройства не отвечают на стимуляцию гормонов.

Будущее альтернативой может рассчитывать на наличие "биологических кардиостимуляторов", для которых ЧОК может служитьв качестве подходящего клеточного источника и которые также весьма ценным для экстракорпорального тестирования на наркотики. Тем не менее, основная проблема заключается в очень редких появления пазухи узловых клеток в эмбриональных органов (EBS) - это, как правило, не превышает ~ 0,5% 1.

Ранее было показано, что "вперед программирование" на конкретные кардиомиоцитов подтипов осуществимо с помощью сверхэкспрессии различных ранних сердечно-сосудистых факторов транскрипции, таких как мезодермы конкретных-задней 1 (MesP1) и NK2 транскрипции фактора связаны, локус 5 (Nkx2.5) 2, 3. Для обычного размера и функции синусового узла (SAN), Т-поле транскрипционный фактор Tbx3 имеет решающее значение, которое, как было показано, чтобы инициировать программу гена стимулятором и контролировать дифференциации SAN 4. Хотя это расширение появление функциональных клеток водителя ритма, содержание еще не превышает ~ 40% в течение всей популяции клеток кардиомиоцитов.

Таким образом, дополнительный Myh6-промоутер на основе антибиотиков выбора шага 5 была введена нами. В конечном итоге это приводит к еще незаметно кардиомиоцитов агрегаты ("индуцированные синоатриального органов;" iSABs »), которые обладают существенно увеличена избиение частоты (> 400 ударов в минуту) в пробирке, впервые аппроксимирующей тех, мышиного сердца и сопоставимы в пробирке выращивают синус узловые клетки, выделенные из мышиного сердца 6. Под администрации Изопреналин опередив даже частоты 550 уд будут достигнуты. Примечательно, что iSABs состоят из более чем 80% функциональных узловых клеток Как видно из обширного физиологического анализа 7. В последнее время несколько подходов для создания пазухи узловые клетки с помощью прямого перепрограммирования 19, поверхностных маркеров 14 или медикаментозное лечение с малых молекул 16,17 описанных. Тем не менее, ни один из этих методов не привело к такой высокой чистоты клеток водителя ритма и бить частотах, близких к мышиным онискусство как это наблюдается в iSABs.

Кроме того, в Экс Vivo модели культивируемых взрослых мышей ломтиками желудочковой которые потеряли их самопроизвольное биение деятельности, iSABs способны интегрироваться в ломтик ткани, тем самым оставаясь спонтанно активны и энергично ходить ломтики сердца к сокращений 7. Подробный протокол для генерации этих iSABs описано в этой статье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Рекомендации Перед началом

  1. Не используйте ЭСК загрязненных микоплазмы, потому что они не будут дифференцировать должным образом в синусового узла клеток. Тест на загрязнение микоплазмой перед началом протокола. Делайте это, используя набор ПЦР для быстрого, высокочувствительного обнаружения микоплазм и следуйте изготовления протокола.
  2. Для каждой чашке Петри (этап 2.3.4), флаг один 10 см 2 клеточной культуры блюдо стерильной 7 мл 0,1% желатина от холодной воды рыбьей кожи в течение 1 часа при 37 ° С. Удалить желатин и дайте блюду сухой в стерильных условиях в стерильную скамейке.
  3. Прежде чем вы сможете начать протокол дифференциации вам нужно двойную трансфецировали стабильной мыши ES клеточной линии клон, содержащий следующие функции: I) Учредительный Сверхэкспрессия Tbx3 с помощью вектора экспрессии млекопитающих. II) ген устойчивости к G418 под контролем промотора Myh6-5.
  4. В недифференцированных клеток ЭСК должны быть совместно развиватьd с облученных питающих клеток при стандартных условиях, как описано 1.

2. Дифференциация Процедура

  1. Два дня до разграничения - Удалить ЭСК из фидерных клеток.
    1. Аспирируйте среды, промыть клетки с 10 мл фосфатно-солевом буфере PBS, добавляют 7 мл раствора коллагеназы IV и инкубировать клетки в течение 10 мин при 37 ° С. Поместите стерильную 40 мкм фильтр в 50 мл пробирку.
    2. Тщательно промойте PSC колонии (избегайте, чтобы удалить фидерные клетки) с помощью пипетки раствором коллагеназы вверх и вниз 5 раз.
    3. Передача клеточной суспензии в 40 мкм фильтр, промывки фильтра три раза 8 мл ФБС. Поверните вокруг фильтра и поместите его вверх дном в чашке Петри. Удалить ККП колонии клеток с помощью пипетки 10 мл PBS в нижней части фильтра.
    4. Передача клеточной суспензии в 15 мл пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г.
    5. Снимите PBS, приостановить клеток в 1 мл Accutase и яncubate при 37 ° С в течение 5 мин.
    6. Добавить 10 мл PBS, перемешать раствор клеток с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз, а центрифуги в течение 5 мин при 300 х г.
    7. Снимите PBS, приостановить клеток в 10 мл питательной среды и определить количество клеток.
    8. Семенной 15000 клеток / см 2 на 75 см 2 колбу и фильтровальную обрабатывать их в течение 2 дней при 37 ° С, 5% СО 2. После 2 дней колбу должна быть 50-70% сплошности.
  2. День 0 - начало дифференциации
    1. Удалить среду и промыть клетки с 10 мл PBS.
    2. Аспирируйте PBS, добавляют 2 мл Accutase и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 5 мин. Поместите стерильную 40 мкм фильтр в 50 мл пробирку.
    3. Добавить 10 мл PBS, передавать клеточной суспензии в фильтр 40 мкм, промыть фильтр с помощью добавления 10 мл PBS и центрифугировать проточный течение 5 мин при 300 х г.
    4. Суспендирования клеток в 10 мл среды для дифференцировки и определения количества клеток.
    5. Развести тОн клеточной суспензии с дифференциацией среде до конечной концентрации 20000 клеток / мл.
    6. Внесите 20 мл воды и 5 мл висячей капли (HD) решение в квадратичной чашке Петри, чтобы избежать высыхания ГДС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого 24-луночного планшета, содержащие iSABs (см раздел 2.8.6.4/2.8.7) начинаются с 16 чашках Петри.
    7. Пипетировать до 50 мл клеточной суспензии в лоток.
    8. Повернитесь на крышке чашки Петри. Поместите 180 HDs каждая из которых содержит 20 мкл (400 клеток / HD) суспензии клеток на крышке с помощью пипетки 12 канала.
    9. Осторожно переверните вокруг крышки и поместите его на чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: скорость поворота вокруг крышки является очень важным. Если крышка поворачивается вокруг слишком медленно или слишком быстро, поверхностное натяжение клеточной суспензии недостаточно высока, чтобы сохранить висит падает на крышке. Прежде чем пытаться произвести HDs для первой практики времени поворота вокруг крышки с 20 мкл капли среде.
    10. Культивировать клетки в течение 2 дней при 37 ° C, 5% CO 2, чтобы позволить им сформировать EBS.
      Примечание: место одна чашка Петри заполнены водой в верхней части стопки 5 чашках Петри. В противном случае HD в верхней чашке Петри высохнет.
  3. День 2
    1. Осторожно повернуть крышку квадратичной чашку Петри и передачи ЭТ, полученных из двух чашек Петри (360 EBS) в 50 мл пробирку.
    2. Подождите 10 мин, чтобы позволить ЭТ оседают на дне пробирки (не центрифугировать EBS).
    3. Отберите столько среде, как это возможно, приостановить ЭТ в 10 дифференцировки мл среды и передавать суспензии в 10 см чашки Петри.
  4. День 2-6 суспензионной культуре
    1. Культивировать в суспензии ЭТ в течение 4 дней при 37 ° С, 5% СО 2, изменить среду после 2 дней.
      Примечание: Несмотря на то, Петри не покрыта (в отличие от клеток культуральной чашке) ЭТ часто прикрепить к поверхности. Управление чашки Петри для подключенных ЭТ каждый день, и, при необходимости, отсоединить ЭТот поверхности, осторожно пипеткой. Дополнительно: Встряхните чашку Петри непрерывно в течение периода приостановления культуры. Будьте осторожны со скоростью шейкере. В ЭТ не должны ни накапливаются в середине, ни плавать на границе чашках Петри.
  5. День 6
    1. Передача ЭТ от одной чашке Петри с одним покрытые желатином 10 см блюдо 2 клеточной культуре.
  6. День 7-12
    1. Клетки должны начать бить через 8-12 дней. Проверка для взбивания очаги клеток в день под микроскопом. Клетки начинают образовывать слой.
    2. Изменить среднего ежедневно.
      Примечание: После изменения среды, клетки требуют 3-4 ч, чтобы восстановить и начать бить снова.
  7. День 12-15 Выбор пазухи узловых клеток.
    1. Через три дня после того, как клетки начали избивать (около суток 12-15), аспирация среды и пипеток 10 мл свежего дифференциации среде, содержащей 400 мкг / мл G418 для клеток.
  8. Через четыре дня после начала отбора отделить слой клеток.
    Примечание: Вполне возможно, что слой клеток уже отделена от поверхности.
    1. Осторожно удалите среду без аспирации слой клеток.
    2. Добавить 10 мл PBS и удалить PBS без тщательно аспирационных слой клеток.
    3. Добавить 10 мл раствора коллагеназы IV, передавать клетки к 50 мл пробирку и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 5 мин.
    4. Энергично смешивают суспензию с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 5 мин. Суспензию небольших кластеров должно происходить. Если есть еще огромные части слоя левого, а затем повторите шаг 2.8.4 еще два раза.
    5. Добавить 20 мл PBS и центрифугировать в течение 10 мин при 300 х г.
    6. Тщательно аспирата PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если iSABs должны генерироваться перейдите к шагу 2.8.7. Если ISAB происходит пазухи узловые отдельные клетки должны генерироваться идти с шагом 2,9.
    7. Приостановить клеткив 12 мл среды, содержащей дифференциации 400 мкг / мл G418 и семя их от 6 лунках, покрытых желатином 24 скважин (2 мл / лунку).
  9. Генерация одной узловой ячейки.
    1. Суспендирования клеток из стадии 2.8.6 в 5 мл Accutase и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин.
    2. Энергично смешивают суспензию с помощью пипетки вверх и вниз 10 раз и инкубировать клетки при 37 ° С в течение 5 мин.
    3. Добавить 20 мл PBS и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г.
    4. Суспендирования клеток в 12 мл среды для дифференцировки, содержащей 400 мкг / мл G418 и семя их от 6 лунках, покрытых желатином в 24 лунок (2 мл / лунку).
  10. День 2 после диссоциации, аспирация среды и промыть клетки три раза PBS. Добавить 1 мл дифференциация средних / лунку.
  11. День 4-8 после диссоциации, изменить среду каждые 2-й день. На 10 день после использования диссоциация iSABs или ISAB, полученных пазухи узловой отдельные клетки доступны для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол позволяет генерировать iSABs с бьющимся частотой около 450 ударов в минуту от СРП (показано в фильме), который находится рядом с частотой биений мыши сердца. После диссоциации iSABs (шаг 2.8.8) наблюдаемые отдельные клетки показывают типичную форму клеток синусового узла (шпиндель и пауков клеток), как показано на рисунке 1. Эти клетки очень экспрессии белков, которые, как известно, необходим для функции синусового узла, как гиперполяризации активированный циклических нуклеотидов закр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность производить стволовых клеток, полученных кардиостимулятор клетки может позволить воссоздания надлежащего сердечного ритма в смысле «биологических кардиостимуляторов". Кроме того, тестирование на наркотики в пробирке будет извлечь пользу из их наличия. ЧОК может привести к любому типу клеток организма млекопитающего, включая кардиомиоциты с кардиостимулятором клеток свойств 8,9,10,11,12,13. Однако, как правило клеточных популяций в рамках «эмбриональные тельца» весьма неоднородны, что неизбежн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Жидкая среда Iscove со стабильным глутаминомBiochrom AGFG 0465
DMEM жидкая среда без Na-пирувата, со стабильным глутаминомBiochrom AGFG 0435
CLS тип IV, CLS IVBiochrom AGC4-22
Заменимые аминокислотыBiochrom AGK 0293
FBS SuperiorBiochrom AGS 0615
Пируват натрия (100 мМ)Biochrom AGL 0473
G 418-BC жидкость (готовый к применению раствор), стерильныйБиохром AGA 2912
Резервуар для реагентов PP f.многоканальный пип. 60мл, стерильныйБренд703409
AccutaseeBioscience,Inc.00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, электронный дозаторEppendorf4861000155
Falcon Cell Strainer 40 и микро; mFalcon352340
Пенициллин/Стрептомицин GE HealthcareP11-010
Чашки ПетриGreiner BioOne663102
DPBS без Ca и MgPAN-BiotechP04-36500
Фетальная бычья сывороткаPAN-BiotechP30-3302
Фактор ингибирования лейкемииPhoenix Europe GmbHLIF-250
Квадратичные чашки ПетриRothPX67.1
Желатин из холодноводной рыбьей кожиSigmaAldrichG7765
2-меркаптоэтанолSigmaAldrichM3148 
1-ТиоглицеринSigmaAldrichM6145
Чашки для культуры тканейTPP93100
Колба для культуры тканейTPP90076
Тестовые планшеты для культуры тканей (24 лунки)TPP92424

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
  2. David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
  3. David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
  4. Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
  5. Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
  6. Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
  7. Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
  8. Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
  9. He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
  10. Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
  11. Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
  12. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  13. David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
  14. Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
  15. Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
  16. Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
  17. Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
  18. Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
  19. Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
  20. Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
  21. Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи