Method Article

Использование высокой пропускной In Vitro Микрожидкостных систему для разработки Устные биопленки Многовидовые

DOI:

10.3791/52467

⸱

December 1st, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого методы работы является описать использование микрофлюидном системы для развития биопленок многовидовых, которые содержат виды, как правило, выявленных в человеческой наддесневого зубного налета. Методы описания биопленки архитектуры, биопленки жизнеспособность, и подход к уборочной биопленки для культурно-зависимой или культурно-независимые анализы будут выделены.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько высокой пропускной в пробирке систем, которые способствуют развитию биопленки многовидовых, которые содержат многочисленные виды обычно обнаруженные в в естественных условиях устных биопленок. Кроме того, система, которая использует природный человеческой слюны в качестве питательной источника, вместо искусственных средах, особенно желательно, чтобы поддержать экспрессию клеточных и биопленки конкретных свойств, которые имитируют в естественных сообществ. Мы опишем метод для развития многопрофильных видов устных биопленок, которые сопоставимы по отношению к видовому составу, в наддесневые зубной налет, в условиях, аналогичных полости рта человека. В частности, это методы статья будет описывать, как в продаже Микрожидкостных система может быть адаптирована для облегчения разработки многовидовых устных биопленок, полученных из и вырос в объединенной слюны. Кроме того, описание того, как система может быть использована в сочетании с confocaл лазерный сканирующий микроскоп для получения 3-D биопленки реконструкции для архитектурных и жизнеспособности анализа будут представлены. Учитывая широкое разнообразие микроорганизмов, которые растут в пределах биопленки в микрожидкостных системы (в том числе стрептококков, Neisseria, Veillonella, Gemella и Porphyromonas), протокол также будут представлены описания того, как собрать биопленки клеток для дальнейшего субкультуры или экстракции ДНК и анализа. Пределы как микрожидкостных системы биопленки и текущее состояние в самых современных анализов данных будут устранены. В конечном счете, предполагается, что эта статья даст базовый метод, который позволит улучшить изучение устных биопленок и помочь в разработке дополнительных технологий, которые могут быть интегрированы с микрожидкостных платформы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биопленки архитектурно сложные сообщества бактерий, которые агрегируются на поверхности 1. Эти общины, как правило, содержат многочисленные виды, которые взаимодействуют друг с другом в рамках биопленки 2. Устные биопленки, наиболее визуально заметным является зубной налет, являются постоянной проблемой в людях и их бесконтрольное результаты развития в поколение таксономически различных общин многовидовых 3. Компонент бактерии этих различных групп может быть до 1000 раз более устойчивы к противомикробным препаратам, чем их свободно плавающих (планктонных) экземплярах 4-6. Отказ от лечения эти устные биопленки сообщества, которые могут вызвать кариес и пародонтоз, привело к значительному бремени государственного медицинского: более 500 миллионов посещений в офисе дантиста годовых в США, и примерно 108 000 000 000 $ для лечения или профилактики пародонта болезни и кариес 7.

Содержание ">" В то время как многие микробиологи выступают изучения микробного поведения в естественных условиях, лишь немногие из них сделать. Это потому, что их боевой дух для преодоления трудностей постоянно подрывается в привлекательной простоты работы с лабораторными культурами ». -Smith 8.

В настоящее время, оральный исследования биопленки проводится с использованием различных, в естественных условиях и в пробирке подходов, каждый со своими преимуществами и недостатками 9,10. В пробирке подходы часто используют модельные системы биопленки, которые являются относительно легко создать, но может не хватать клинические / в реальном мире актуальность 10,11. В естественных условиях подходы, как правило, полагаются на животных моделях, которые могут воспроизводить определенные аспекты среды полости рта человека, но опять же страдают от ограничений в связи с различиями в анатомии, физиологии, микробиологии и иммунологии между людьми и животными 12, 13. Следует отметить, что оральные биопленкитакже могут быть разработаны на поверхности эмали, проводимых в стента в устьях добровольцах, но этот подход в настоящее время относительно дорогостоящим и трудоемким 14,15. В конечном счете, новые препараты или технологии, чтобы улучшить полостью рта являются испытания на людях в контролируемых клинических условиях судебного разбирательства 11. В настоящее время часто используются методы работы по выявлению и оценке новых пероральных препаратов Здравоохранение сначала выполнить лабораторные исследования, чтобы выявить потенциальную эффективность, а затем выполните исследований на животных и "полевые испытания", которые используют врачам оценить успешность технологии 9, 16,17. К сожалению, лабораторные исследования, как правило, зависят от модельных систем, которые занимают большой след, технологически сложным в использовании, и часто содержат упрощена сообщества один или самое большее несколько видов, чтобы получить потенциальную реального мира означает 10,18. Учитывая, что зубной налет биопленки содержать несколько видов и формы в комплэкс течет слюны среду, развитие биопленки, которые содержат один или несколько видов в искусственных средах вряд ли генерировать общин, которые ведут себя подобным образом, как и в реальной ситуации 10,19. Для решения время, стоимость, требования к профессиональной подготовке, а бедные представительный характер лаборатория модельных систем биопленки по сравнению с реальной среде, мы недавно разработали высокую пропускную способность и экологически уместны систему биопленки 20 (рисунок 1). Система выгоды от использования бесклеточной объединенной человеческой слюны (КПБ) как средний и лечить объединяются человек бактериальная клетка, содержащие слюны (CCS) в качестве посевного материала. Уникально, система также объединяет микрофлюидальный технологии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и культуры независимой технологии анализа бактериальной разнообразия. Таким образом, модель системы является экологически уместны (с помощью слюны, как посевной расти биопленки Многовидовые на 37 ° С в фильтр-стерилизовать течетслюна) и устные биопленки содержат виды (включая Streptococcus, Neisseria, Veillonella и видов Porphyromonas) в численности, представитель те, что в начале наддесневого налета 20.

Если учесть, что эта работа описывает использование недавно разработанной модельной системы, особое внимание должно быть уделено объединения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) микрофлюидики и технологий анализа разнообразие культурно-независимыми. Объединение этих технологий нашей исследовательской группы было преднамеренным, а не только добавляет возможность с высокой пропускной во вновь разработанной модельной системы, но также позволяет задаваемых вопросов, которые не могут быть легко решены до с другими системами. Во-первых, CLSM имеет явные преимущества по сравнению с традиционными микроскопии, так как позволяет для трехмерного анализа биопленок. Часто недооценивают, это очень важно, так как биопленки являются гетерогенными остроумиеч относительно видового состава и пространственного положения, а также физиологические условия быть введены в различных пространственных местах в пределах биопленки 6,21. В концерте с трехмерной программного обеспечения визуализации и программного обеспечения для анализа изображений, архитектуры биопленки, пространственных отношений между составляющих его видов и степени антибактериальной убийства могут быть проанализированы 22-24. Такие способности невозможно с использованием стандартного проходящего света или эпифлуоресцентной микроскопии. Далее, микрофлюидики собрал особое внимание в области микробиологии, так как позволяет изучение биопленок в тщательно контролируемых условиях (расход, температура, рН и т.д.) и требует только небольших объемов жидкости 25-27. В качестве отправной точки для сравнения, рост устный биопленки в слюне человека в рамках модели проточной ячейки системы (система, которая, возможно, считается основой образцом для многих оральных исследований биопленки) в течение 20 ч при аналогичной скорости потока и сдвига, как достичьв микрожидкостных системы требует, по крайней мере, 200 мл, в противоположность 800 мкл в микрожидкостных устройств 28-31. Таким образом, Микрожидкостных модель системы биопленки позволяет исследовать количество ограниченных материала при определенных условиях. Наконец, пиросеквенирования технология была оптимизирована в последнее десятилетие требуют лишь небольшое количество материала для выполнения анализа сообщество и достаточно универсален, чтобы контролировать глубину последовательности, чтобы получить идентичность даже редких видов биопленки. Использование этой технологии, такие как бактериальный тегом в кодировке FLX ампликон пиросеквенирования (bTEFAP), позволило актуальных вопросов, касающихся экологии биопленок решать 32,33. Такие вопросы проникнуты трудности в прошлом, когда пиросеквенирования не были доступны из-за времени и затрат, необходимых для создания плазмиды библиотеки и сложные технологические и аналитические шаги, необходимые для получения данных 33,34. Конечно, большое преимущество с культурно-независимый APжается, такие как Пиросеквенирование, является то, что виды бактерий, которые не могут быть выращены в изоляции в обычных лабораторных средах (т.е. жизнеспособные, но не культивируемой видов) могут быть выращены и определены в модельной системе, и их относительное содержание в сообществе количественно 35, 36 , Чтобы добавить перспективу, а уже в 1963 году, в конце Зигмунд Socransky, что приблизительно 50% бактерий в материале, выделенных из полости рта человека десны щель не может быть культивировать, используя условия роста лаборатория 37.

Цель этого методы работы является описать подход для разработки устные биопленки Многовидовые в коммерчески доступных микрожидкостных (Bioflux) системы: (I) условий представителя полости рта человека и (II) с видового состава и численности, что сравнима с наддесневого налета. Кроме того, как с помощью бесплатных и коммерческих программ мы выделяем как основной биопленкиархитектура меры могут быть получены из данных CLSM, с акцентом на подходы к количественной оценке биопленки биомассы, шероховатости и жизнеспособность (на основе Live / Dead окрашивания). Наконец, шаги, необходимые для сбора биопленки материал для анализа разнообразии bTEFAP описаны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол коллекция слюна описано здесь был рассмотрен Мичиганского университета, ведомственного комитета по исследованию человеческого субъекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отношении институциональных мнений человеческого субъекта работ на эту тему, предварительные договоренности и разрешения должны быть получил от принимающей организации. В частности, в зависимости от учреждения, IRB или утверждение этики, возможно, необходимо искать и утверждены до слюна коллекция из добровольцев может продолжиться. В помощь готовит заявку, полезно NIH алгоритм / график можно найти здесь: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Подготовка объединенных слюне для использования в качестве экологически уместны ростовой среде

  1. Набирать> 5 лиц за слюны пожертвования. Не принимать какие-либо идентифицирующую информацию, убедиться в отсутствии individuALS будет пожертвовать слюну, если они больны или принимали пероральные антибиотики в течение последних 3 месяцев, или потребляли пищу или жидкости, за исключением воды, в предыдущем 2 ч до процедуры изъятия.
  2. Сбор слюны в 50 мл пластиковые пробирки. Бассейн собранную слюну в пластиковом стакане, сохраняя его на льду. Не используйте стакан полимеры в слюне будет придерживаться внутренних стеклянных поверхностей.
  3. Добавить дитиотреитола (DTT) до конечной концентрации 2,5 мМ с 100x наличии. (Фото заморожен в одноразовых аликвоты при -20 ° С). Перемешивают в течение 10 мин в пластиковом стакане на льду.
  4. Для того чтобы удалить твердые частицы, центрифуги объединены слюны в течение 30 мин при 17500 х г.
  5. Развести слюну с 3-х томах ЦТ 2 O, чтобы дать одной четвертой сосредоточены слюну.
  6. Фильтр-стерилизовать слюны, используя 0,22 мкм полиэфирсульфон (PES), низкий Связывание с белками фильтр. Используйте фильтр с большой площадью поверхности, или использовать несколько небольших фильтров по зоне. Держите слюны впластиковый контейнер на льду при фильтрации.
  7. Замораживание ходе исследований слюны при -80   ° С в 50 мл пластиковые пробирки, пока это необходимо выращивать бактерии. Каждый пластиковая трубка является одной только для использования и не должны содержать не более 35 мл в каждый Микрожидкостных хорошо держит максимум 1,2 мл (1,2 мл х 24 лунок = 28,8 мл) и пространство необходимо в каждой пробирке, как слюна расширяет процессе замораживания.
  8. Для использования, оттепель ходе исследований слюны при комнатной температуре. После оттаивания, фильтр-стерилизовать еще раз (0,22 мкм полиэфирсульфоновой, низкая степень связывания с белками фильтр для удаления любых осадков).

2. Подготовка объединенных слюне для использования в качестве инокулята

  1. Набирать> 5 лиц за слюны пожертвования. Не принимать какие-либо идентифицирующую информацию, убедиться в отсутствии лица, не пожертвует слюну, если они больны, взяли антибиотики в течение последних 3 месяцев, или потребляли пищу или жидкости, за исключением воды, в предыдущем 2 ч до процедуры изъятия. Сбор SAmples более 30 мин.
  2. Сбор слюны в 50 мл пластиковые пробирки при комнатной температуре и объединить собранную слюны в пластиковом химическом стакане при комнатной температуре.
  3. Развести объединенного слюны с автоклавного целом химически чистой глицерина с получением состава с конечной соотношении 25% глицерина, 75% клеток, содержащих слюны [CCS].
  4. Замораживание слюну при -80 ° С в 3 мл одноразовых аликвоты пока нет необходимости.
  5. При необходимости сделать прививку микрожидкостных систему аликвоты, оттаивают при комнатной температуре и осторожно перемешивают на вихревом смесителе в течение 5 сек, прежде чем пипеткой в ​​микрожидкостных системы, как описано в шаге 3 протокола, ниже.

3. Рост Устные биопленки Многовидовые

  1. CFS предварительной обработки
    1. Первый слой микрожидкостных каналы Bioflux с CFS. Добавить 100 мкл CFS к каждому выходу также. Использование программного обеспечения управления Bioflux, выберите "ручной" и установить поток от каналов "B1-B24" Thaт должны быть использованы.
    2. Далее, набор сдвига до 1,0 дин / см и начать подачу в течение 2 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей CFS канала. Убедитесь в наличии жидкости в каждой впускной канал, чтобы убедиться, что CFS текла через все каналы равномерно.
    3. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 20 мин.
    4. Снимите CFS / Обрабатывайте решение, которое остается в выпускных скважин и передать впускных скважин. Это общий объем 100 мкл будет служить, чтобы сбалансировать в отношении используемого давления для инокулята из розетки также.
  2. Прививка
    1. Для каждой торговой точке, добавьте 100 мкл CCS посева. Поместите микрожидкостных пластину на нагревательной пластине (температуры, установленной на 37 ° C), выберите инструкцию в программном обеспечении управления, а также настроить поток от розетки скважин на впускных скважин (т.е. назад) на 1,0 дин / см ровно 6 сек.
    2. Инкубируйте микрожидкостных пластину при 37 ° С в течение 40 мин, чтобы позволитьдля начального присоединения и роста бактерий в инокулята.
  3. Ночь роста
    1. Для используемого инокулированные каналов, аспирации посевной отходов от каждого из выпускных скважин. Добавить до 1 мл общего объема CFS в каждый из впускных скважин (может быть сделано в верхней части существующей CFS).
    2. Выдержите микрожидкостных пластину на 37 ° C, выберите Вручную и установить программу, чтобы работать на 0,2 дин / см в течение 20 часов.
  4. Пятно предварительная стирка
    1. Аспирируйте все жидкости из впускных и выпускных скважин и добавить 100 мкл PBS (рН 7,4), к каждому из входных скважин. Поток в течение 20 мин в 0,2 дин / см.
  5. Пятно смесь дополнение
    1. Для окрашивания жизнеспособность клеток составляют 100 мкл пятен смеси для каждого канала, быть окрашены. В частности, добавить 3 мкл SYTO 9 и 3 мкл пропидийиодидом на мл PBS с использованием коммерческой жизнеспособности клеток окрашиванием набора, такого как LIVE / DEAD. Это создаетОкрашивание смесь, содержащую 10 мкМ SYTO 9 и 60 мкМ пропидийиодидом.
    2. Аспирируйте оставшегося PBS из впускных скважин, а затем добавить 100 мкл жизнеспособности клеток пятен смеси к каждому входе также. Набор течь в 0,2 дин / см 2 и запустить решение от входа к выходу в течение 45 мин при комнатной температуре.
  6. После окрашивания мыть
    1. Аспирируйте оставшееся пятно в каждом из впускных скважин и добавить 100 мкл PBS к каждой входе также. Набор течь в 0,2 дин / см и запустить решение PBS от входа к выходу в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы удалить любой избыток пятно.

4. Сбор Image, 3D-рендеринг и анализ изображений

  1. Используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) для сбора данных биопленки изображения из микрожидкостных системы. Убедитесь, что CLSM способен выдержать вес Bioflux пластины, которая может достигать 150 г.
    Примечание: данное копейкиnsions микрожидкостных каналов, потребность в чувствительности различать структуру биопленки, а также требования для обнаружения сигнала флуоресценции различной интенсивности, установите CLSM с 40X 1,25 NA объектива или один с аналогичным оптического качества, увеличении и числовой апертурой.
  2. Стандартизировать захвата выбросов ворота с усиления и смещения причем измерения постоянной. Убедитесь, что мощность лазера не превышает 25%, так как это может привести к фото-отбеливание.
  3. Преобразование CLSM файлы из L EICA я маг F типа Иль (LIF), чтобы OME (O ручка M icroscopy E nvironment) Тип файла. Это обеспечивает большую простоту доступа и совместимости программного обеспечения. Используйте имеющийся в продаже программного обеспечения, таких как, Imaris конвертировать файлы этого типа.

3D-рендеринг для изображений / фигуры

  1. После преобразования в формат OME, использовать имеющиеся в продаже программного обеспечения, таких как Imaris чтобы сделать изображенияв 3D. Выполните это, используя комбинацию "Easy3D" и "превзойти" вариантов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимание фонового сигнала и порога должно быть сделано. Гистограмма в Imaris может быть использован для получения спектра сбора и это должно быть постоянным между изображениями анализируются.
  2. Сохранение изображений с помощью функции «моментальный снимок» и сделать тщательного рассмотрения в разрешении изображения перед сохранением типов файлов.
  3. Соберите изображений в цифры, используя программное обеспечение для редактирования изображений, такие как CorelDraw или Adobe Illustrator.

3D Анализ изображений для графики и таблицы

  1. Используйте свободно доступны ImageJ 23 и КОМСТАТ / COMSTAT2 38 для анализа изображений. Скачать пакеты с http://rsb.info.nih.gov/ij/ и http://comstat.dk/, соответственно. У самых последнее обновление Java установлена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: программная платформа JAVA будет необходимо установить Prioг с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
    1. Используйте программное обеспечение ImageJ с COMSTAT2 плагин для импорта файлов OME для каждого биопленки изображения в режиме "HyperStack" и видом с «расколом каналов".
    2. Индивидуально анализа двух каналов (красный / пропидий-йодид / мертвых существо канал 0, зеленый / SYTO-9 / живое существо 1 канал) с помощью функции «Гистограмма» в ImageJ. Эта функция перечисляет общее количество пикселей 8-битных файлов OME (показана как "кол") на каждой интенсивности цвета от 0 до 255 (показана как "ценность"), где 0 пикселей при отсутствии сигнала (фон) и 255 существа пикселей с полным насыщением сигнала.
    3. Экспорт данных в программу электронной таблицы и стандартизации всех значений сигнала, путем взвешивания каждого пикселя на соответствующий интенсивности сигнала. Это выполняется путем умножения на общее количество данной интенсивности сигнала путем численного 8-битное значение (0-255) этой интенсивности сигнала.
    4. Сложите все взвешенные ценности, 0-255, для обоих каналов для каждого биопленки изображения, захваченного. Возьмем сумма взвешенных значений для обоих каналов, чтобы определить процентное общее сигнал от каждой канала. Сделайте это, чтобы определить относительную соотношение или процент красный и процентов зеленого сигнала (т.е. процент "мертвых" и процентов "живого" для каждой обработки).
    5. Выполнить статистический анализ, например, с помощью Стьюдента-тест Стьюдента модифицированный неравного дисперсии. Значения р <0,05 считаются существенными и те значения р <0,01 считаются весьма значительными.

5. Сбор биопленки Клетки для культурно-независимый анализ

  1. Удалить все отработанное и неиспользуемые слюны впускных и выпускных скважин. Вымойте скважин с 1 мл стерильной дистиллированной воды три раза.
  2. Добавить 100 мкл стерильной дистиллированной воды к впускным скважин и, используя интерфейс управления программное обеспечение, пройтистерильной дистиллированной воды вперед через каналы в> 8,0 дин / см 2 (скорость потока> 745 мкл / час, сдвига 800 сек -1), по меньшей мере, 5 мин. Повторите в обратном направлении в течение по меньшей мере 5 мин, а затем повторить в прямом и обратном стадии промывки процесс.
  3. Проверьте светом или эпифлуоресцентной микроскопии (если клетки окрашивали / помечены) для тщательного удаления биопленки (рис 2). Соберите 100 мкл клеток-подвески и хранить при температуре -80 ° С в течение культурно-независимого анализа. Экономически эффективный анализ составе сообществ может быть достигнуто за счет использования бактерий тегов в кодировке FLX ампликона пиросеквенирования (bTEFAP), используя подход, описанный в Нэнса и др. 20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-рендеринг биопленок

Представитель результаты показаны на рисунке 3. Полезный инструмент в Imaris программного обеспечения является возможность исследовать каждый кусочек собранного пакета биопленки и объединить их, чтобы создать трехмерные реконструкции. Кроме того, искусственные эффекты затенения могут быть добавлены, чтобы помочь визуально интерпретировать трехмерных структур. Оказанных биопленки могут быть ориентированы в любом направлении с р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это методы документе освещаются основные шаги, необходимые для установки и запуска микрофлюидальный систему таким образом, чтобы обеспечить развитие устного биопленки многовидовых, полученных из пула человеческой слюны и выращенных в фильтр-стерилизовать 25% объединенной человеческой слюны. Подходы к характеризуют биопленки приведены, но следует помнить, что эти описанные подходы модифицируемые и дополнительные технологии, такие как, например, пятна или метки могут быть введены. В самом Например, можно предположительно ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.H.R. и N.S.J. получили награды за исследования от различных источников, таких как Национальные институты здравоохранения (NIDCR), Colgate-Palmolive (Пискатауэй, Нью-Джерси) и Общество прикладной микробиологии, для финансирования научных исследований в их лаборатории в течение последних пяти лет. Все остальные авторы: заявить не приходится.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Уильям ОБСЛУЖИВАНИЕ (Университет Мичигана) за помощью в разработке протоколов роста биопленки и Джон Баттиста (Прибоя, Сан-Франциско, Калифорния) за советом по поводу технологических вопросов, связанных с системой Bioflux. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH: R21DE018820 в AHR) и Мичиганского университета первоначальных средств на AHR

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Software

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Falcon 50 мл конические центрифужные пробиркиFisher Scientific14-432-22
Falcon 15 мл конические центрифужные пробиркиFisher Scientific14-959-49D
Дитиотреитол (белые кристаллы или порошок/электрофорез), биореактивы FisherScientificBP172-5
ультрацентрифуга Sorval  (Совместимо с SS-34)Тепловизионныйагрегатно-зависимый
Thermo Scientific SS-34 Rotor Thermoscientific28-020
Thermo Scientific Тип 1 Реагент класса деионизированной водыТермо  Scientific Inc23-290-065
Nalgene Быстроточные фильтрующие установки и фильтры для бутылочных крышек, мембрана PES, стерильная.ВВР73520-986 
ГлицеринThermo Fisher Scientific IncNC0542269
микрофлюидная системаBioFlux СистемаBioflux 200 Bioflux
24-канальная пластинаFluxion910-0004
PBS (Gibco)Thermo Fisher Scientific Inc10010023
ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ морилка (Invitrogen) InvitrogenL7012
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопLeciaSPE или экивалентная система
Эпифлуоресцентный микроскопМногоразличный выборМногоразличный выбор
ПиросеквенированиеМногоразличный выборМногоразличный выбор
Decon SaniHol 70 Раствор этанолаFisher Scientific04-355-122
Морозильная камера для ультранизких температур -80  ° CНесколько вариантовНесколько вариантов
Советы (20, 200 и 1,000  μ l)Многоканальные
дозаторы переменного объема (20, 200, 1,000 μ l)Множественный выборМножественный выбор<
Bioflux специализированное программное обеспечениеBioflux
ImarisBitplane
Leica SPELeica
ImageJFreeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2Бесплатное программное обеспечение (http://www.comstat.dk/)
td colspan="4">

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
  2. Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
  3. Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
  4. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  5. Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
  6. Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
  7. Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
  8. Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
  9. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
  10. McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
  11. Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
  12. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
  13. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101(2010).
  14. Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
  15. Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
  16. Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
  17. Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
  18. Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
  19. Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
  20. Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
  21. Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  22. Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
  23. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  24. Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
  25. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
  26. Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  27. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  28. Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
  29. Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
  30. Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
  31. Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
  32. Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
  33. Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
  34. Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
  35. Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
  36. Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
  37. Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
  38. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  39. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
  40. Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
  41. Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
  42. Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oral BiofilmsMicrofluidic SystemHigh throughput In VitroMulti species BiofilmsConfocal MicroscopyBiofilm ArchitectureSaliva based MediaStreptococcus VeillonellaDNA Extraction AnalysisLive Dead Staining

Related Articles