Методическая статья

Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52469

⸱

2 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол совместного культивирования в трех измерениях, который полезен для исследования многоклеточных взаимодействий и внеклеточной матрикс-зависимой модуляции поведения раковых клеток. В этой экспериментальной модели раковые клетки культивируются на коллагеновых гелях, встроенных в фибробласты, ассоциированные с раком человека.

Аннотация

Прогрессирование рака (инициация, рост, инвазия и метастазирование) происходит в результате взаимодействия между злокачественными клетками и окружающими опухолевыми стромальными клетками. Микроокружение опухоли состоит из различных типов клеток, таких как фибробласты, иммунные клетки, эндотелиальные клетки сосудов, перициты и клетки, полученные из костного мозга, встроенные во внеклеточный матрикс (ВКМ). Ассоциированные с раком фибробласты (КАФ) играют проопухолевую роль за счет секреции растворимых факторов, ангиогенеза и ремоделирования ВКМ. Экспериментальные модели выживания, пролиферации, миграции и инвазии раковых клеток в основном опирались на двумерные одноклеточные и монослойные культуры тканей или анализы в камере Бойдена. Однако эти эксперименты не точно отражают физиологические или патологические условия в больном органе. Чтобы лучше понять стромальные взаимодействия опухоли или опухолевого матрикса, многоклеточные и трехмерные культуры предоставляют более мощные инструменты для исследования межклеточной коммуникации и ЭКМ-зависимой модуляции поведения раковых клеток. В качестве платформы для такого рода исследований мы представляем экспериментальную модель, в которой раковые клетки культивируются на коллагеновых гелях со встроенными первичными культурами CAF.

Введение

Раковая ткань может восприниматься как тип органа, который развивается в результате тесного взаимодействия между раком и микроокружением стромы опухоли, состоящим из ассоциированных с раком фибробластов (CAF), иммунных клеток, опухолевых сосудов и внеклеточного матрикса (ECM). CAF являются основным источником растворимых факторов (цитокинов, факторов роста и хемокинов), которые оказывают митогенное, промиграционное и проинвазивное действие на раковые клетки. Они также стимулируют образование опухолевых сосудов и рекрутируют клетки-предшественники, такие как клетки, полученные из костного мозга (BMDC). Активированные CAF участвуют в производстве и ремоделировании ВКМ, тем самым способствуя росту и распространению раковых клеток1. CAF также обеспечивают нишу, которая способствует колонизации опухолевых клеток и метастазированию и способны придавать фенотипы стволовых клеток соседним раковым клеткам. Патологоанатомические наблюдения позволяют предположить, что стромальные реакции или фиброзные изменения в раковых тканях свидетельствуют о плохом прогнозе. Недавние исследования также показали, что особенности стромы опухоли, такие как сигнатура гена, могут предсказывать прогноз для пациента. Кроме того, факторы, полученные из CAF, могут модулировать чувствительность к химиотерапии, подчеркивая роль CAF в определении чувствительности к препаратам и резистентности2.

Поскольку CAF играют многогранную роль в продвижении опухолевой прогрессии через сигнальные пути, которые опосредуют взаимодействия между CAF и различными типами клеток в опухолевом микроокружении, они привлекают все большее внимание как новые мишени для лечения рака. Гетерогенность клеточных популяций в раковом микроокружении представляет собой препятствие для нацеливания на CAF. Было предложено несколько маркеров для CAF, таких как α-гладкомышечный актин (α-SMA), белок активации фибробластов (FAP) и специфический для фибробластов протен-1 (FSP-1: также называемый S100A4); однако эти молекулярные маркеры не специфичны для отличия CAF от других клеток, присутствующих в нераковых тканях3. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы получить больше знаний о специфических свойствах CAF. С этой целью информативно охарактеризовать первичные культивируемые КАФ в сравнении с нормальными фибробластами, соответствующими пациенту.

Недавно были проведены анализы CAF, полученных от пациентов, для нескольких типов рака, что выявило уникальные паттерны экспрессии генов и поведение клеток по сравнению с фибробластами, полученными из нераковых тканей. Используя выделенные CAF из тканей рака легкого человека, мы разработали метод трехмерного совместного культивирования, позволяющий оценить свойства CAF легких. В этой модели мы исследовали влияние CAF на инвазию клеток рака легкого, пролиферацию и сокращение коллагенового геля, что экспериментально повторило роль CAF легких в продвижении опухолей4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было одобрено соответствующими комитетами по этике.

1. Первичная культура легких человека фибробластов

  1. Коллекция легочной ткани:
    1. Получить образцы легочной ткани человека из хирургической операционной напрямую. Сбор около 1 см 3 кварталах от раковой и не раковая легочной ткани, с нераковая собранных образцов так далеко от опухоли, как это возможно.
    2. Приостановка образцы в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл амфотерицина В (бессывороточной среде). Поддержание взвешенные образцы в стерильных 50 мл пробирки и передать в лабораторию.
      Примечание: Фибробласты мигрирующих и пролиферативной по сравнению с другими типами клеток, таких как эпителиальные, эндотелиальные и клетки гладкой мускулатуры. Метод следствием использует эти особенности фибробластов и outgroКрыло клетки из срезов тканей, имеются в изобилии в фибробласты. После нескольких пассажей клеток, и другие типы клеток не выживают и распространяются в среде DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в результате чего очищенных культур клеток фибробластов. Клетки могут быть использованы следующие 3-7 пассажей первичной культуре.
  2. Эксплант и кондиционирование для мобильного вырост:
    1. Выполните первичной культуры фибробластов с использованием ранее сообщалось протокол с изменениями 5.
    2. В лаборатории, разместить образец ткани на 10 см чашки для культивирования тканей без культуральной среды и разрезали на небольшие секции ~ 2-3 мм с использованием стерильного пинцета и скальпель. Во время этого процесса, избежать раздел сухой, в противном случае эффективность клеточной выроста ухудшается.
  3. Разделение эпителиальный слой клеток и соединительной ткани:
    1. Замачивание секции Упрощенный ткани в культуральной среде, содержащей 2000 PU / мл диспаза I и культуры в течение 16 часов при 4 ° С.
    2. Передача срезах тканей к блюду, и отделить эпителиальный слой клеток из соседней соединительной ткани. Процесс разделы в чистом столе, чтобы избежать загрязнения микроорганизмами.
      Примечание: Если первичные культуры эпителиальных клеток необходимо, выполнить шаг 1,3. Если только фибробласты могут быть изолированы, опустить шаг 1,3, так как последующие Эксплант и клеточные фрагменты являются неблагоприятными для эпителиальных клеток, которые дают очищенные популяции фибробластов.
  4. Приложение срезов ткани:
    1. Фарш ткани в 1 мм части, используя два скальпели. Если части не достаточно мал, что они более легко отделить от тарелки, и клетки не сможет вырасти на поверхности посуды.
    2. Поместите небольшие участки легочной ткани друг от друга, чтобы поддерживать пустой области, окружающей каждую часть. Сделать царапин на поверхности тканевой культуральной чашке скальпелем лезвие, чтобы облегчить прикрепление срезах тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Царапинытакже появляется, чтобы облегчить клеток вырост, обеспечивая треки, по которым клетки могут мигрировать.
      1. Кроме того, место фарш кусочки ткани по отдельности в каждую лунку 6-луночного планшета, и покрыть их с покровным. Прикрепите крышку скольжения на поверхности пластины, используя силиконовую смазку.
      2. Поместите силиконовую смазку в двух точках 1,5 см друг от друга в каждой лунке с помощью стерильного штифт. Охват кусочки ткани повышает эффективность клеточной вырост и распространения клеток после нескольких пассажей.
  5. После Эксплант:
    1. Осторожно добавляют культуральную среду в чашке до того, как срезы ткани высохнуть, а эффективность вырост клеток теряется по большей части, если образцы высохнуть. Не лейте среду слишком быстро, как срезы тканей будет снять.
    2. Культура клеток в среде DMEM с 10% FBS. Используйте достаточно среду просто покрыть ткань, но не слишком много, что позволяет плавающий, как дополнительную плавучесть способствует отрыв отблюдо.
  6. Сотовый пассаж:
    1. Ручка культуральной среды с осторожностью во все времена, как повторяющиеся движения культуры блюдо может привести к отрыву срезах тканей.
    2. Поместите чашки для культивирования в термостате при 37 ° С в течение 5-7 дней. Обновление среды через день, и обрабатывать чашки для культивирования в течение минимально изменений средних. Фибробласты перерастают от края срезах тканей в течение ближайших нескольких недель.
      Примечание: После ~ 2-3 недель, перерастает фибробласты практически достичь слияния, в зависимости от количества площади поверхности.
    3. Вымойте клеток с 1x PBS и добавьте 1 мл трипсина я к плите.
    4. После обработки трипсином, открепления клеток с использованием 9 мл DMEM с добавлением 10% FBS. Собирают клетки, суспендированные в среде в 10 мл пробирку вместе с тканевых срезов. После центрифугирования с образованием клеточных гранул, ресуспендируют Полученные гранулы в новой среде.
    5. Семенной клеток и срезов ткани на новую культуры блюдо, после чего ткани не придают блюду в то время как клетки придерживаться и расти. На следующий день, удалить плавающие куски ткани путем аспирации и изменить среду. Прикрепленные фибробласты распространяться с последующими культурами.

2. Трехмерная Co-культуре человеческих легочных фибробластов и клеток рака

  1. Получение клеток и реагентов:
    1. Примерно использовать 2 х 10 5 клеток эпителия и 2,5 х 10 5 фибробластов на лунку. Подготовка коллаген типа Ia (3 мг / мл, рН 3), ФБС (100%), восстанавливающий буфер (50 мМ NaOH, 260 мМ NaHCO 3, 200 мМ HEPES), 5x DMEM, среде DMEM с добавлением 10% FBS для культуры фибробластов, и 3D совместно культуральную среду (1: 1 смесь фибробластов культуральной среды и питательной среды для раковых клеток).
    2. Культура А549 легких клетки аденокарциномы, фибробласты и А549 3D совместное культивирование в среде DMEM с добавлением 10% FBS.
  2. Коллаген гель Formation:
    1. Вымойте фибробласты, культивируемые на 10 см блюдо с 1x PBS и добавьте 1 мл трипсина я к плите. После обработки трипсином в течение ~ 5 мин при 37 ° С, открепления клеток с использованием 9 мл DMEM с добавлением 10% FBS. Собирают клетки, суспендированные в среде в 10 мл пробирку и центрифугировать их при 200-300 мкг с образованием клеточных гранул.
    2. Ресуспендируют Полученные гранулы в 100% FBS при плотности 5 × 10 5 / мл.
    3. Подготовка геля коллагена на льду. Охлаждают реагентов, пипетки и трубки в холодильнике до следующей процедуры. Даже на льду, смесь затвердевает в некоторой степени, и общий объем меньше, чем сумма всех компонентов.
    4. В каждую лунку, подготовить геля коллагена путем смешивания 0,5 мл фибробластов суспензии (2,5 х 10 5 клеток) в FBS, 2,3 мл типа Ia коллаген, 670 мкл 5x DMEM и 330 мкл буфера восстановление. Разрешить гели легко установить при комнатной температуре.
      1. Энергично пипетки, чтобы обеспечить однородную миxture. Избегайте создания пузырей в процессе пипетки.
    5. Добавьте смесь (3 мл) в каждую лунку 6-луночного планшета и позволяют желатинизации в инкубаторе при 37 ° С без нарушения в течение 30-60 мин.
  3. Культуры клеток рака на коллагеновый гель:
    1. Выполнять трехмерные Сотрудничество культуры с использованием ранее сообщалось протокол с изменениями 6.
    2. Ресуспендируют раковые клетки в 3D-со-культуральной среде (или в среде DMEM с 10% FBS, в случае клеток А549) при плотности 1 х 10 5 / мл.
    3. Налейте 2 мл раствора ресуспендированные клетки (2 х 10 5 клеток) на поверхности каждой геле. Изменить количество клеток раковых клеток или фибробластов в совместной культуре в зависимости от условий эксперимента.
  4. Гель сокращений:
    1. Инкубируйте гели в течение ночи при 37 ° C, так что раковые клетки могут прилипать к коллагеновым гелем. Снять каждый гель, и создать "плавающий культура» в каждую лунку оF пластины 6-а.
      Примечание: При использовании плавающего культуры, различные изменения в размере гель индуцированы механического напряжения и деградации коллагена, которые опосредованы взаимодействием клеточного ко-культивируют раковых клеток и фибробластов.
    2. Используйте углом 21 G иглы или небольшой шпатель для разделения гель от края ямы. Каждые 2-3 дней, обновить скважин с 2 мл 3D совместно культуральной среде. Измерить размер каждого гель каждый день в течение 5 дней.
  5. Анализ коллагена гелей:
    1. Измерить содержание коллагена каждого геля с использованием коллагена методы количественного, таких как анализ Sircol. Выполнение транскриптомных анализа или количественной ОТ-ПЦР после сбора РНК из гелей 5.

3. Воздух-жидкость Культура и Вторжение Пробирной

  1. После культивирования гели коллагена при 37 ° С в течение 5 дней, подвергать контракту гели в атмосферу, поместив их на сетке (70 мкм размер пор) в новом 6-луночных планшетах. Сделать сетку из коммерчески доступных фильтров клеток, используемых для проточной цитометрии.
  2. Аккуратно заполните каждую лунку с 11 мл 3D совместно культуральной среде.
  3. Расположите гели на сетку, используя стерильный ложку, и удалить все оставшиеся среды из гелей. При этом условии, погрузить гели в среде, а подвергать верхнюю поверхность геля на воздухе. Определить эту культуру состояние как воздух-жидкость.
    Примечание: После 5-7 дней сохранении культуры радиоинтерфейса-жидкость при 37 ° С в инкубаторе, инвазивные раковые клетки мигрируют в геле. В зависимости от типа клеток и в результате клеточных взаимодействий, переменной степени морфологических изменений клеток в раковые клетки индуцированы культуры радиоинтерфейса-жидкость.
  4. Для гистологического исследования, зафиксировать гель в растворе формалина в течение ночи при комнатной температуре и вставлять в парафин. Пятно вертикальные секции (4 мкм) гематоксилином и эозином (H & E). Выполните иммуногистохимического анализа ON разделы 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот метод совместного культивирования, подражая микросреды опухоли, является полезным инструментом для изучения взаимодействия между раковыми клетками и фибробластами встроенные в коллагена гелей. В предыдущем исследовании, три параметра были оценены в этой экспериментальной модели: сокращение коллагеновый гель, вторжение раковых клеток и морфологических изменений. Распространение раковых клеток оценивалась также с помощью Ki67 иммуноокрашивания 4. Образцы ткани легкого были собраны из раковых и не раковых р...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CAFS образуют основной компонент ECM окружающей раковые клетки и не только обеспечивают каркас для опухоли, но и активно участвовать в развитии опухоли 7. Накопленные данные распутывает влияние CAFS или их родственных молекул на конечную прогноза, подчеркнув критическое значение роли CAF-опосредованной опухолевой прогрессии 8.

В предыдущем исследовании мы использовали нарост метод, чтобы изолировать CAFS легких 4. В этом эксперименте содержание раздела тканей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 и 25460137).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Коллаген типа IANitta желатин Inc.CELL-1A
Восстанавливающий буферNitta желатин Inc.
Защитное стеклоNUNC174934
Силиконовая смазкаDow Corning TorayВысоковакуумная смазка
Dispase IWAKO386-02271
6-луночная пластинаBD Falcon353046
Фильтр для ячеек (70 μ m)BD Falcon352350

Ссылки

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62(2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747(2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи