Методическая статья

Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

13.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52475

⸱

19 февраля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Причины дегенерации дофаминергических нейронов среднего мозга при болезни Паркинсона до конца не изучены. Системы клеточных культур являются важным инструментом для изучения нейрофизиологических свойств этих нейронов. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, который может быть использован для моделирования нейродегенерации in vitro.

Аннотация

Дегенерация мезенцефальных дофаминергических нейронов (mesDA) является патологическим признаком болезни Паркинсона. Изучение биологических процессов, участвующих в физиологических функциях, а также уязвимости и гибели этих нейронов, имеет важное значение для понимания основных причин и разгадки лекарства от этого распространенного нейродегенеративного расстройства. Первичные культуры нейронов mesDA обеспечивают инструмент для исследования молекулярных, биохимических и электрофизиологических свойств, чтобы понять развитие, долгосрочную выживаемость и дегенерацию этих нейронов в течение заболевания. В данной работе мы подробно описываем метод выделения, культивирования и поддержания дофаминергических нейронов среднего мозга из эмбрионов мышей (или крыс E14.5) класса E12.5. Оптимизированные условия культивирования клеток в этом протоколе приводят к наличию аксональных и дендритных проекций, синаптических связей и других морфологических свойств нейронов, которые делают культуры пригодными для изучения физиологических, биологических и молекулярных характеристик этой нейрональной популяции.

Введение

Потеря дофаминергических нейронов из черного вещества Парс компактов приводит к симптомам кардинал моторных болезни Паркинсона (БП), второй наиболее распространенной нейродегенеративное заболевание. Основная причина гибели этого мезенцефалической нейронов населения, не известно. Для изучения биохимических путей, ответственных за разработку и модуляции нейрофизиологические свойства и выживание Mesda нейронов, несколько клеточной культуры и животных модельных систем были использованы. Иммортализованные клеточные линии, в том числе линии клеток 1RB крыса дофаминергической 3 Н. 27 (N27), в человеческий дофаминергической линии клеток нейробластомы SH-SY5Y, мыши дофаминергической линии гибридных клеток MN9D и человек теменной LUHMES клетки были использованы для биохимических и ограниченных механистических исследований 1 -5. Для изучения конкретной потери Mesda нейронов, несколько нейротоксин основе и генетические модели были разработаны 6-8. Основные брюшной среднего мозга культур, Является необходимым инструментом для изучения нейронов и синапсов свойства дофаминергических нейронов и путей, вовлеченных в патогенез этого общего беспорядка.

Здесь мы представляем подробный протокол для выделения среднего мозга дофаминергических нейронов, которая содержит изменения, приводящие к высокой живучести и увеличению выхода покровные в зачаточном состоянии. Использование преждевременного среднего мозга E12.5 мыши (E14.5 у крыс) повышает живучесть. В этом возрасте нейроны не разработали аксоны еще, что покидает клетки, неповрежденные во время вскрытия и сводит к минимуму стресс, тем самым, значительно повышая жизнеспособность. Кроме того, тщательное вскрытие брюшной мозга, как описано в разделе 2 настоящего Протокола, еще больше повышает живучесть. Для увеличения числа покровные в зародыше, альтернативный способ покрытия представлены в разделе 4 настоящего Протокола. Это приводит к выходу до 10 покровные в эмбрионе, по сравнению с 4 по покровныеСтандартные условия металлизации, таким образом, уменьшая количество животных в эксперименте.

Нейроны в культуре выставочная вырост аксонов и dentrites, образуют синаптические соединения и выявить наличие нейронов и синапсов маркеров делает эти культуры подходит для живого изображения клеток, иммуноцитохимических и электрофизиологических исследований. Кроме того, использование нейронных культур способствует генетической и фармакологической манипуляции. Вырост нейритов от 2 дня в пробирке позволяет исследованиях развития. Кроме того, долгосрочное выживание культур (до шести недель) делает их пригодными для исследования медленной, прогрессирующей дегенерацией этих нейронов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Животных содержали и обрабатываются в соответствии с ведомственным руководящим принципам и всех процедур животных были утверждены благосостояния животных в Имперском колледже и Этическая экспертиза тела (AWERB) и Home Office и Гарвардский университет Уходу за животными и использованию комитета (IACUC), в соответствии с федеральными и местными нормами.

1. Реагент и настройка оборудования

  1. Оттепель, аликвоту и магазин 1 решение мг / мл Ламинин при -80 ° С. Растворить 2 мкл в 1 мл DMEM / F12, в результате чего концентрации покрытия 1-2 мкг / см 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель Ламинин медленно на льду и растворить в холодной DMEM / F12 и сразу же добавить его в пластинами / покровные.
  2. Развести 75 мл 0,01% поли-L-орнитина в 425 мл PBS и хранить при температуре 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности рабочего раствора до одного месяца.
  3. Растворите 25% (вес / объем) BSA в PBS, рН 7,4, и хранят при температуре 4 ° С на срок до одного уеAR.
  4. Подготовка 50% FBS (в HBSS) деактивации СМИ.
  5. Подготовка полной среды путем добавления 50 ед / мл пенициллина и стрептомицина, 1 N2 добавки, 5% (об / об) ФБС, 0,36% D - (+) - глюкозы (вес / объем), 0,25% БСА (вес / объем), чтобы DMEM / F12 и хранить при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности до 10 дней.
  6. Место покровные в кипящей 70% (об / об) этанола в течение по крайней мере 30 минут, чтобы удалить все следы жира и автоклав.
  7. Место покровные в 24-луночных планшетах и ​​добавить 500 мкл поли-L-орнитин раствор ли в каждую лунку. Инкубируют 1 час под капот культуры ткани при комнатной температуре, а затем, промыть 3 раза 500 мкл воды. Добавить 500 мкл раствора ламинин к каждой пластине и инкубировать O / N в увлажненной инкубаторе для тканевых культур при 37 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пока никаких моет не нужны после лечения ламининовым, мыть поли-L-орнитин менее чем в три раза приводит к смерти клеток через 24 ч после культивирования.
  8. Польский советы стеклянных пипеток более природного газа горелки или Fхромой.
    Примечание: После этой стадии диаметр наконечника должен быть около половины своего нормального размера.
  9. Вырезать колпачки 1,5 мл микропробирок, используя в автоклаве ножницы и автоклав.

2. Препарирование эмбрионального Брюшной мозга

  1. Наркотизировать приурочен беременных (E12.5), сооружаемых CO 2 ингаляции, а затем усыпить путем смещения шейных позвонков.
  2. Спрей живота с 70% этанола и сделать брюшной разрез до тех пор, маточные мешки не все подвержены. Использование щипцов сократить влагалища привязанность и удаления матки. Поместите матки в ледяной HBSS, в 100 мм чашки Петри.
  3. Удалить эмбрионов из матки и амниотической, с помощью пинцета (рис 1в). Место эмбрионов в пресной ледяной HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: прямоугольник на рисунке 1D показывает местоположение эмбрионального брюшной мозга.
  4. Поместите эмбрионы Под микроскопом рассечение (10x) и анализировать среднего мозгаарки, сокращая мозг на перешейке и теменной-диэнцефальных граничной области, используя bioscissor и щипцы (рис 1E, пожалуйста, обратитесь к рисунку 1А для линий разреза).
  5. После изъятия весь средний мозг, сделать разрез в mediodorsal мозга (рис 1F).
  6. Удалить мозговые оболочки, с использованием двух щипцов (рис 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: Этот шаг необходим для оптимального нейронов урожайности и выживания. Поскольку условия культивирования являются оптимальными для клеток головного мозга, большинство клеток от окружающей ткани умирают после посева и апоптоза сигнал от этой ткани может привести к повреждению целостности культур.
  7. Свести мозга ткани на чашку Петри наблюдать форму бабочки и сократить примерно половину каждого крыла, используя стерилизованный нож для бритья (рис 1Н, I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1J изображает изолированный вентральной средний мозг.
  8. Перевестичасть вентральной мозга в ледяную HBSS в 15 мл коническую трубку и перейти к следующему эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1-2.8 не должна занимать более 1 ч. Хранение эмбрионов за этот период времени на льду значительно снижает жизнеспособность клеток.

3. Диссоциация Брюшной мозга клеток

  1. Передача части брюшной мозга под капотом ламинарного потока. Снимите HBSS и добавить 1 мл подогретого (37 ° C) 0,05% трипсин-ЭДТА в конической трубе (объемы достаточно до 12 штук брюшной мозга). Инкубируйте ткани на 37 ° С в течение 5-10 мин.
  2. Удалить трипсин-ЭДТА под капотом и добавить 1 мл среды де-активации (сыворотка будет отключить трипсин) в ткани.
  3. Снимите деактивации среды и промыть ткань в 1 мл полной среды в два раза.
    Примечание: Не все удаления среды из трубки и пипетки ткани, чтобы предотвратить отбрасывание диссоциированных клеток.
  4. Добавить 1 мл полной среды и Тритуратов ткани с огневой полировкой стеклянной пипетки. Избегайте образования пузырьков и продолжить растирания до суспензии отдельных клеток не достигается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, 8-10 проходит через ограниченное наконечника требуются для полной диссоциации.
  5. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить носитель.
  6. Повторное приостановить осадок в 1 мл полной среды, медленно пипетки вверх и вниз на срок до четырех раз.

4. Покрытие Брюшной мозга Клетки

  1. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 90 мкл раствора трипанового синего и подсчитывают число клеток с помощью гемоцитометра.
    Примечание: Жизнеспособность клеток может быть также проверена на данном этапе.
  2. Поместите стерилизовать крышки трубки микроцентрифужных в 100 мм чашки Петри и передачи / покровные Ламинин покрытые поли-L-орнитин, с помощью пинцета, по одному на верхней части крышки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте покровные и избежать высушивания ламинином, так как это может привести к uneveп культур и снижение выживаемости клеток.
  3. Настройка громкости в 1500 клеток на 1 мкл добавлением полной среды и добавить 100 мкл (всего 150000 клеток) клеточной суспензии в верхней части каждого покровное (объем является оптимальным, чтобы покрыть поверхность покровного стекла без утечки). Закройте чашки Петри и инкубируют их в течение 1 часа в увлажненной инкубаторе тканевых культур (37 ° C, 5% CO 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: Этот шаг необходим для повышения привязанность и жизнеспособности клеток и увеличение количества покровных в зачаточном состоянии. С другой стороны, клетки могут быть перенесены непосредственно в лунки, содержащие (покровные), но количество клеток должно быть увеличено до 350000 на лунку (вместо 150000). Другими словами, с помощью этого метода, 8-10 покровные могут быть приобретены, в то время как прямая передача дает около 3-4 покровные из-за клеток, которые прикрепляются к пластинам (рядом или под покровные). Средняя viabiliти культур, используя этот метод был около 90%.

5. Культура роста и поддержания

  1. После 1 ч инкубации, тщательно передачи покровные в том числе среды в 24-луночных планшетах, содержащий 400 мкл предварительно нагретой (до 37 ° С) в полной среде (общий объем: 500 мкл). Инкубируйте клетки O / N на 37 ° C.
  2. В 24 ч после инкубации в лунки осторожно добавить 500 мкл полной среды в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые несколько часов является наиболее важным этапом для выживания дофаминергических нейронов и количества выживших клеток существенно не изменится после этой точки.
  3. Не следует добавлять дополнительное СМИ к культурам в течение первых двух недель или до среда становится желтым. Если культивирования в течение более чем двух недель или средних цвет меняется на желтый, обмен половина средств массовой информации (500 мкл) со свежими полных подогретого СМИ (как правило, каждые две недели).
    ПРИМЕЧАНИЕ: дофаминергических нейронов в пределахкультуры были бы выжить в течение более чем 6 недель в этих условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иммуногистохимическое против тирозин гидроксилазы (TH) показывает, что между 0,5-1% клеток в культуре дофаминергических. Нервные прогнозы появляются в течение 2 ч после посева и в первый день, аксоны и дендриты различимы (рис 2), используя Тирозингидроксилаза (TH) и ассоциированный с микротрубочками белка 2 (map2) антитела (рисунок 3). Нейроны выжить в течение более шести недель, и показать огромный нарост. Отношение нейрон-глиальных культур в напрямую связана с концентрацией сыворотки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дофаминергических нейронов в мозге, являются основным источником допамина в центральной нервной системе. Они делятся на три группы, черного вещества Парс компактов (SNPC), вентральной области покрышки (VTA) и retrorubral поле (СБР) 10, 11. Нейроны в SNPC и ВТА привести к основными путями дофаминергических, мезокортикальных, мезолимбических и Nigro-полосатой, участвующих в таких функциях, как контроль над эмоциями, мотивацией и поведением двигателя. Гибель нейронов в SNPC и функционального нарушения нигростриа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Эта работа была выполнена с использованием стартовых фондов Отделения наук о мозге, Департамента медицины, Имперского колледжа Лондона для K.N.A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированная смесь питательных веществ Eagle от Dulbecco F-12Invitrogen11330
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS) (1X), жидкийInvitrogen24020-117
Фетальная бычья сыворотка, термоинактивированная (FBS)Invitrogen16140
N2 Supplement (100X), жидкийInvitrogen17502-048
D-(+)-глюкоза раствор (45% (масс./об.) в водеSigmaG8769
Бычий сывороточный альбумин BSASigmaA9430
Ламинин из базальной мембраны мышиной саркомы Engelbreth-Holm-Swarm SigmaL2020
Пенициллин/стрептомицинInvitrogen15070
Трипсин (0,05% (масс./об.)Invitrogen25300
Бычья сыворотка Культура клеток альбумина (БСА) протестированаSigma A9418
Фосфатно-солевой буфер (PBS)SigmaP3813
Антитела к антитирозингидроксилазе (Th)Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
Поли-L-орнитин, 0,01% растворSigmaP4957
Anti-Map2 (микротрубочки, ассоциированные белки-2A и -2B) антителоMilliporeMAB3418
Anti-Synapsin-1 антителоMilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 ослик против кролика IgG    антителаМолекулярные зондыA-21206
Alexa Fluor 594 ослик против кролика IgG    антителаМолекулярные зондыA-21207
Alexa Fluor 488 ослик против овец IgG    антителаМолекулярные зондыA-11015
Alexa Fluor 594 ослик против овец IgG    антителаМолекулярные зондыA-11016
Alexa Fluor 594 ослик антимышиный IgG    антителаМолекулярные зондыA-21203
Трипановый синий раствор (0,4% (масс./об.)Биоуиттакер17-942E
СтереомикроскопCarl ZeissStemi 2000-C
Инвертированный фазово-контрастный микроскопCarl ZeissAxiovert 40 C
Щипцы DumontFine Scientific ToolsMay-45
Cover Slip Щипцы – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
Два щипца Dumont #45 – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Держатель лезвия / Breaker плоская рукоятка - 11 смFine Scientific Tools10052-11
Студенческие ножницы с ирисом - прямые 11,5 смFine Scientific Tools91460-11
Волоконно-оптический галогенный осветительNikonMKII
Одноразовый боросиликатный стекло Пипетки ПастераFisherbrand13-678-20С
ГемоцитометрProscitechSVZ2NIOU
0,2; m стерильные фильтрующие блокиNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 мм чашкиПетри BD Biosciences351005
Круглая крышка Slip #1 Толщина Немецкое стекло 12 ммBellco Glass1943-10012 

Ссылки

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11(2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27(2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи