Моноциты являются ключевыми регуляторами врожденного иммунитета и играют решающую роль в обновлении периферической мононуклеарной фагоцитарной системы и в случае воспаления. В данной рукописи описана процедура визуализации костного мозга кальварии мышей в режиме реального времени для изучения механизма мобилизации моноцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Отслеживание костного мозга мышей моноцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мультифотонная визуализация в реальном времени предоставляет прекрасную возможность для изучения переноса клеток и межклеточных взаимодействий в их физиологической трехмерной среде. Биологическая активность иммунных клеток в основном зависит от их подвижности. Моноциты крови имеют короткий период полураспада в кровотоке; Они берут начало в костном мозге и конститутивно высвобождаются из него. При воспалительном состоянии этот процесс усиливается, что приводит к моноцитозу крови и последующей инфильтрации периферических воспалительных тканей. Идентификация биомеханических событий, контролирующих транспорт моноцитов из костного мозга в сосудистую сеть, является важным шагом для понимания физиопатологической значимости моноцитов. Мы выполнили покадровую съемку in vivo с помощью двухфотонной микроскопии костного мозга черепа мыши Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). Мышь MacBlue экспрессирует флуоресцентные репортеры усиленный голубым флуоресцентным белком (ECFP) под контролем миелоидного специфического промотора 1 в сочетании с мечением сосудистой сетью. Мы описываем, как этот подход позволяет отслеживать отдельные медуллярные моноциты в режиме реального времени для дальнейшей количественной оценки миграционного поведения в паренхиме костного мозга и сосудистой сети, а также межклеточных взаимодействий. Этот подход позволяет по-новому взглянуть на биологию субпопуляций моноцитов костного мозга и дополнительно изучить, как эти клетки могут подвергаться влиянию при конкретных патологических состояниях.
Введение
Костный мозг играет центральную роль в кроветворении и представляет собой основной резервуар моноцитов, которые конститутивно рециркулируют между кровью и медуллярной паренхимой, обновляют пул циркулирующих моноцитов с короткой продолжительностью жизни 2,3 и участвуют в восстановлении равновесных тканевых макрофагов и дендритных клеток 4. Во время воспаления или после транзиторной аплазии моноциты активно мобилизуются либо из костного мозга, либо из селезенки 5, 6, 7 и колонизируют воспаленные органы. Несколько осей хемоаттрактанта были вовлечены в процесс мобилизации миелоидных клеток из костного мозга 8, 5, 6,9....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы эксперимента были утверждены французской экспериментов на животных и этике комитетом и утверждены на "Службы по защите и др Санте Animales, Environnement" с номером А-75-2065. Примеры размеры выбраны так, чтобы обеспечить воспроизводимость экспериментов, и в соответствии с 3R регулирования животных этической.
1. Подготовка мыши
- Анестезия
- За короткий период томографии (менее 1 ч), анестезию мыши путем внутрибрюшинной инъекции 200 мкл физиологического раствора, содержащего кетамином (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
- Кроме того, в течение более длительного периода визуализа....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Структура черепа мыши предоставляет хорошую возможность для изучения физиологии костного мозга прижизненной визуализации. Костный быть тонким вокруг передней теменной области, можно получить доступ к продолговатого мозга ниши без истиранию кости. Рисунок 1 представляет широкий 2D поле черепа MacBlue трансгенной мыши. Костный матрикс состоит в основном из коллагена I можно было легко обнаружить с помощью ГСП 19. Введение родамина-декстрана пятна сосудистую сеть костного мозга и позволяет для о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические точки естественных методологии формирования изображения в том, чтобы обеспечить стабильность фокуса для того, чтобы максимизировать продолжительность визуализации и свести к минимуму риск бактериального загрязнения и воспаления, которые могут повлиять на динамику воспалительных клеток. Визуализация черепа костного мозга следующим этих целей, как операция, чтобы получить доступ к костного мозга минимальна. Использование стерильного материала и антисептиков важно ограничить риск инфекц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Анну Дарон и Пьер Луи Loyher за помощь в редактировании, Plateforme Imagerie Питье-Сальпетриер (PICPS) за помощь в двухфотонного микроскопа и животных фонда "НАК" и Камилла Baudesson для мышей животноводства помощь. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил финансирование от Седьмой Рамочной Программы Европейского Сообщества (FP7 / 2007-2013) по договору безвозмездной N ° 304810 - RAID-массива, и N ° 241440-Endostem, от Inserm, из Университета Пьера и Марии Кюри "Появление ", из Лос-Анджелеса" Ligue CONTRE ле рака ", от" Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рак "от и до" Agence Nationale-де-ла-Recherche "Программа Появлени....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кетамин | Мериал | 100 мг/мл, анестетик | |
| Ксилазин | Байер ХелсКер | 10 мг/мл, анестетик | |
| Изофлуран | Бакстер | 2,5%, анестетик | |
| О<суб>2/NO<суб>2 | 70/30 смесь, анестетик | ||
| Родамин-Декстран | Инвитроген | 2 МДа, 10 мг/мл, Окрашивание сосудов | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | 1A8, окрашивание нейтрофилов | |
| Стереотаксический держатель | Домашняя | хирургия | |
| Этанол 70% | |||
| операция Стерильные ножницы и кусачки | хирургия | ||
| Резиновое кольцо | диаметром 18 мм, хирургия | ||
| Glubran 2 | Queryo Медицинский | хирургический клей, фиксация резинового кольца иглы | |
| малого калибра | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO многофотонный микроскоп | Микроскоп Carl Zeiss | ||
| Ti:Лазер с сапфировым стеклом | Когерентный хамелеон Ultra | 140 фсек импульсов ближнего ИК-диапазона света | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | битовых плоскостей | , 3D автоматическое слежение | |
| PBS 1X | Хирургия | Дутчера | |
| Термостатированная камера | Carl Zeiss | прижизненная визуализация |
Ссылки
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
