Методическая статья

Отслеживание костного мозга мышей моноцитов В Vivo

DOI:

10.3791/52476

⸱

27 февраля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Моноциты являются ключевыми регуляторами врожденного иммунитета и играют решающую роль в обновлении периферической мононуклеарной фагоцитарной системы и в случае воспаления. В данной рукописи описана процедура визуализации костного мозга кальварии мышей в режиме реального времени для изучения механизма мобилизации моноцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультифотонная визуализация в реальном времени предоставляет прекрасную возможность для изучения переноса клеток и межклеточных взаимодействий в их физиологической трехмерной среде. Биологическая активность иммунных клеток в основном зависит от их подвижности. Моноциты крови имеют короткий период полураспада в кровотоке; Они берут начало в костном мозге и конститутивно высвобождаются из него. При воспалительном состоянии этот процесс усиливается, что приводит к моноцитозу крови и последующей инфильтрации периферических воспалительных тканей. Идентификация биомеханических событий, контролирующих транспорт моноцитов из костного мозга в сосудистую сеть, является важным шагом для понимания физиопатологической значимости моноцитов. Мы выполнили покадровую съемку in vivo с помощью двухфотонной микроскопии костного мозга черепа мыши Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). Мышь MacBlue экспрессирует флуоресцентные репортеры усиленный голубым флуоресцентным белком (ECFP) под контролем миелоидного специфического промотора 1 в сочетании с мечением сосудистой сетью. Мы описываем, как этот подход позволяет отслеживать отдельные медуллярные моноциты в режиме реального времени для дальнейшей количественной оценки миграционного поведения в паренхиме костного мозга и сосудистой сети, а также межклеточных взаимодействий. Этот подход позволяет по-новому взглянуть на биологию субпопуляций моноцитов костного мозга и дополнительно изучить, как эти клетки могут подвергаться влиянию при конкретных патологических состояниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Костный мозг играет центральную роль в кроветворении и представляет собой основной резервуар моноцитов, которые конститутивно рециркулируют между кровью и медуллярной паренхимой, обновляют пул циркулирующих моноцитов с короткой продолжительностью жизни 2,3 и участвуют в восстановлении равновесных тканевых макрофагов и дендритных клеток 4. Во время воспаления или после транзиторной аплазии моноциты активно мобилизуются либо из костного мозга, либо из селезенки 5, 6, 7 и колонизируют воспаленные органы. Несколько осей хемоаттрактанта были вовлечены в процесс мобилизации миелоидных клеток из костного мозга 8, 5, 6,9....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы эксперимента были утверждены французской экспериментов на животных и этике комитетом и утверждены на "Службы по защите и др Санте Animales, Environnement" с номером А-75-2065. Примеры размеры выбраны так, чтобы обеспечить воспроизводимость экспериментов, и в соответствии с 3R регулирования животных этической.

1. Подготовка мыши

  1. Анестезия
    1. За короткий период томографии (менее 1 ч), анестезию мыши путем внутрибрюшинной инъекции 200 мкл физиологического раствора, содержащего кетамином (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
    2. Кроме того, в течение более длительного периода визуализа....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Структура черепа мыши предоставляет хорошую возможность для изучения физиологии костного мозга прижизненной визуализации. Костный быть тонким вокруг передней теменной области, можно получить доступ к продолговатого мозга ниши без истиранию кости. Рисунок 1 представляет широкий 2D поле черепа MacBlue трансгенной мыши. Костный матрикс состоит в основном из коллагена I можно было легко обнаружить с помощью ГСП 19. Введение родамина-декстрана пятна сосудистую сеть костного мозга и позволяет для о.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические точки естественных методологии формирования изображения в том, чтобы обеспечить стабильность фокуса для того, чтобы максимизировать продолжительность визуализации и свести к минимуму риск бактериального загрязнения и воспаления, которые могут повлиять на динамику воспалительных клеток. Визуализация черепа костного мозга следующим этих целей, как операция, чтобы получить доступ к костного мозга минимальна. Использование стерильного материала и антисептиков важно ограничить риск инфекц.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Анну Дарон и Пьер Луи Loyher за помощь в редактировании, Plateforme Imagerie Питье-Сальпетриер (PICPS) за помощь в двухфотонного микроскопа и животных фонда "НАК" и Камилла Baudesson для мышей животноводства помощь. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил финансирование от Седьмой Рамочной Программы Европейского Сообщества (FP7 / 2007-2013) по договору безвозмездной N ° 304810 - RAID-массива, и N ° 241440-Endostem, от Inserm, из Университета Пьера и Марии Кюри "Появление ", из Лос-Анджелеса" Ligue CONTRE ле рака ", от" Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рак "от и до" Agence Nationale-де-ла-Recherche "Программа Появлени....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КетаминМериал100 мг/мл, анестетик
КсилазинБайер ХелсКер10 мг/мл, анестетик
ИзофлуранБакстер2,5%, анестетик
О<суб>2/NO<суб>270/30 смесь, анестетик
Родамин-ДекстранИнвитроген2 МДа, 10 мг/мл, Окрашивание сосудов
Ly6G-PEBecton-Dickinson1A8, окрашивание нейтрофилов
Стереотаксический держательДомашняяхирургия
Этанол 70%
операция Стерильные ножницы и кусачкихирургия
Резиновое кольцодиаметром 18 мм, хирургия
Glubran 2Queryo Медицинскийхирургический клей, фиксация резинового кольца иглы
малого калибраTerumosurgery
Zeiss LSM 710 NLO многофотонный микроскоп Микроскоп Carl Zeiss
Ti:Лазер с сапфировым стеклом Когерентный хамелеон Ultra140 фсек импульсов ближнего ИК-диапазона света
Zen 2010Carl ZeissAcquistion Software
Imaris Bitplane битовых плоскостей, 3D автоматическое слежение
PBS 1XХирургияДутчера
Термостатированная камераCarl Zeissприжизненная визуализация
Клон Программное обеспечение для анализа D.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
  2. Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CSF1R

Похожие статьи