Методическая статья

Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

DOI:

10.3791/52495

⸱

21 февраля 2015 г.

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как нейронные клетки-предшественники могут быть дифференцированы от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, чтобы получить устойчивую и репликативную популяцию нервных клеток, которая может быть использована для идентификации путей развития, способствующих патогенезу заболевания при многих неврологических расстройствах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Посмертные исследования неврологических заболеваний не идеальны для выявления основных причин возникновения заболевания, поскольку многие заболевания включают длительный период прогрессирования заболевания до появления симптомов. Поскольку фибробласты пациентов и здоровых людей из контрольной группы могут быть эффективно перепрограммированы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) и впоследствии дифференцированы в нейральные клетки-предшественники (NPC) и нейроны для изучения этих заболеваний, теперь стало возможным повторить события развития, которые произошли до появления симптомов у пациентов. Мы представляем метод, с помощью которого можно эффективно дифференцировать иПСК в NPC, которые, помимо способности к дальнейшей дифференцировке в функциональные нейроны, также могут быть надежно пропущены, заморожены-разморожены или переведены для роста в виде нейросфер, что позволяет проводить быстрый генетический скрининг для выявления молекулярных факторов, влияющих на клеточные фенотипы, включая репликацию, миграцию, окислительный стресс и/или апоптоз. NPC hiPSC, полученные от пациентов, представляют собой уникальную платформу, идеально подходящую для эмпирического тестирования клеточных или молекулярных последствий манипулирования экспрессией генов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспрессия генов исследований нейронов, дифференцированных в пробирке из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) нами 1 и других 2,3 показывают, что hiPSC нейроны напоминают плода, а не взрослых мозговой ткани. В настоящее время модели hiPSC основе может быть более подходящим для изучения предрасположенности к, а не конца особенностей, неврологические заболевания. Ранее мы уже сообщали, что значительная часть гена подписью шизофренией hiPSC полученных нейронов сохраняется у больных шизофренией hiPSC полученных нервных клеток-предшественников (НПС), указывая, что НПС может быть полезным типом клеток для изуче....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC дифференциация Neural клеток-предшественников

  1. Расти и расширяться hiPSCs в человеческих эмбриональных стволовых клеток (HES) носитель (Таблица 1) совместно культивировали на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерного слоя до больших (но субконфлюентные) колонии не будут готовы для нейронной дифференциации с помощью эмбриоидного тела (EB) промежуточного (рисунок 2). Обычные hiPSC условия культивирования хорошо описаны в других 16,17; Кратко, не растут в hiPSCs HES сред на MEF фидерного слоя до сливной, а затем ферментативно проход с коллагеназы (1 мг / мл в DMEM) и расширить примерно 1: 3 раз в 7....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервные розетки могут быть идентифицированы морфологически, используя светлое микроскопа, по их характерному внешнему виду как круглые кластеров нейроэпителиальных клеток с апикально-базальной полярности (рис 1). Хотя персонажи, как правило, культивируют при очень высокой плотности клеток, сразу же после пассирования, слегка пирамидальной формы сома и биполярное аксонов видна структура (рис 1D). Утвержденные НПС выразить нестин и SOX2 в большинстве клеток, хотя окрашивание III-ТУБУЛИН т.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали методы, с помощью которых дифференцировать hiPSCs в НПС, нейронная тип клеток, в которых значительная часть генов подписью hiPSC, полученных из нейронов сохраняется и может служить в качестве прокси-сервера для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания 8, 11. Кроме того, как мы детально, НПС в энергично репликативной и легко Трансдуцированные нейронной население, которое, как мы считаем, может быть пригодным для молекулярных и биохимических исследований предрасположенности заб.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кристен Бреннанд - исследователь Робертсона из Нью-Йоркского фонда стволовых клеток. Лаборатория Бреннанда поддерживается грантом для молодых исследователей в области мозга и поведения, грантом R01 MH101454 Национального института здравоохранения (NIH) и Нью-Йоркским фондом стволовых клеток.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/F12Life Technologies#11330для сред HES
DMEM/F12Life Technologies#10565для нейронных сред
KO-Serum ReplacementLife Technologies#10828Необходимо провести тщательное тестирование
GlutamaxLife Technologies#35050
NEAALife Technologies #11140
N2Life Technologies #17502-048Необходимо провести партийное тестирование
B27-RALife Technologies #12587-010Необходимо провести партийное тестирование
FGF2Life Technologies#13256-029Ресуспендирование в PBS + 1% BSA
LDN193189Stemgent#04-0074
SB431542Stemgent#04-0010
BDNFPeprotech#450-02Ресуспендия в PBS + 0,1% BSA
GDNF Пепротех #450-10Ресуспендия в PBS + 0,1% БСА
Дибутирилцикл-АМФSigma #D0627Ресуспендия в PBS + 0,1% BSA
L-аскорбиновая кислотаSigma#A0278Ресуспендия в H20
STEMdiff Neural Rosette Selection ReagentStemcell Technologies #05832
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104
Коллагеназа IVLife Technologies#17104019
CF1 mEFsMillipore#PMEF-CF
Poly-L-OrnithineSigmaP3655
Laminin, Natural Mouse 1 мгLife Technologies#23017-015
BD MatrigelBD#354230Ресуспендируйте на льду в холодном DMEM в дозе 10 мг/мл, используйте 1 мг на два эквивалента 6-луночных планшетов
с тканевой культурой Corning3506
Ultra low attachment 6-луночные планшетыCorning3471
козий анти-Sox2 Санта-Крусск и застенчивый; 17320использовать в 1:200
мышиный античеловеческий NestinMilliporeMAB5326использовать в 1:200
кролик анти-&бета; III-тубулинCovancePRB­ Использование 435Pв масштабе 1:500
анти-&бета мыши; III-тубулинCovanceMMS­ 435Pиспользование в масштабе 1:500
мышь Anti-MAP2ABSigmaM1406использование в масштабе 1:200
Пластинчатая центрифугаBeckmanCoulter Beckman Coulter Allegra X-14 (с плитодержателем SX4750)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneuron....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Neural Progenitor CellsDual SMAD InhibitionNeural RosettesLentiviral TransductionNeurosphere FormationCell Migration AssayOxidative Stress AnalysisApoptosis MeasurementNestin SOX2 Expression

Похожие статьи