Методическая статья

Манипуляция и

24.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52496

⸱

9 февраля 2015 г.

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем методы манипулирования незрелыми ооцитами Xenopus laevis, созревание яйцеклеток in vitro до яйцеклеток и интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоида. Этот протокол допускает деградацию некоторых материнских белков и сверхэкспрессию генов, представляющих интерес при оплодотворении, и, следовательно, является ценным для изучения роли специфических факторов в раннем эмбриональном развитии.

Аннотация

Яйца амфибий широко использовались для изучения эмбрионального развития. Раннее эмбриональное развитие обусловлено факторами, накопленными матерью во время оогенеза. Для того чтобы изучить роль таких материнских факторов в раннем эмбриональном развитии, желательно манипулировать их функциями с самого начала эмбрионального развития. Традиционные способы генной интерференции достигаются путем инъекции антисмысловых олигонуклеотидов (олигонуклеотидов) или мРНК в оплодотворенные яйцеклетки, что позволяет осуществлять недостаточную или избыточную экспрессию определенных белков соответственно. Тем не менее, эти методы обычно требуют более нескольких часов, прежде чем экспрессия белка будет нарушена, и, следовательно, вмешательство функций генов не является эффективным на ранних эмбриональных стадиях. Здесь мы представляем экспериментальную систему, в которой уровни экспрессии материнских белков могут быть изменены до оплодотворения. Ооциты Xenopus laevis, полученные из яичников, дефолликулируют путем инкубации с ферментами. Антисмысловые олигоциты или мРНК вводятся в дефолликулированные ооциты на стадии зародышевых пузырьков (ГВ). Эти ооциты in vitro созревают до яйцеклеток на стадии метафазы II (MII) с последующей интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида (ИКСИ). Таким образом, до 10% эмбрионов ИКСИ могут достичь стадии плавающего головастика, что позволяет проводить функциональные тесты на нокдаун или сверхэкспрессию специфических генов. Этот подход может быть полезным способом изучения роли материнских факторов в раннем эмбриональном развитии.

Введение

Xenopus Laevis является широко используется, мощный модельный организм для изучения развития 1. Это потому, что Xenopus яйца необычно большое (около 1,2-1,4 мм, по сравнению с аналогами у млекопитающих быть около 0,1 мм) и в изобилии. Яйца содержат по материнской линии, синтезированных и сохраненные компоненты, которые являются достаточно для того чтобы управлять эмбрионального развития до середины бластулы перехода (MBT, происходящих на стадии 8-8,5 с 4,000-8,000 клеток). MBT сопровождается зиготического активации генома, которая затем производит эмбриональные генных продуктов, которые направляют дальнейшее развитие.

Многочисленные исследования, направленные на выявления случаев материнской факторов, важных для развития. Многие исследования основаны на введении антисмысловых олигонуклеотидов (олиго), включая морфолино олигонуклеотидов в оплодотворенных эмбрионов, в которых деградация случай материнской белков можно наблюдать на стадии гаструлы 2-4. Кроме того, мРНК вводят в оплодотворенную EMbryos беспокоить функции гена или проследить судьбы экспрессия белков. Тем не менее, инъекции в эмбрионов на стадии одной клетки обычно не влияет на уровень экспрессии материнской белков на самых ранних эмбриональных стадиях, до MBT.

Heasman и Уайли создан способ передачи хост, чтобы преодолеть эту проблему 5. В их метода, вручную defolliculated ооциты вводят антисмысловыми олигонуклеотидами и переносят в самок хозяина 6. Белки подавляется до оплодотворения, так что роль подавляется белков в раннем эмбриональном развитии может быть рассмотрено. Это материнской метод истощения привели к выявлению нескольких уникальных ролей в развитии материнской белков, которые были рассмотрены в 7.

В этом отчете мы подробно наш недавно разработанный метод, в котором материнская истощение или избыточная экспрессия мРНК до оплодотворения достигается без ручной defolliculation и передачи принимающей8. Руководство defolliculation требуется много времени и передачи принимающей часто требуется умелые методы и специальную лицензию для животных хирургии, тем самым, препятствуя частое использование материнского методом истощения. Defolliculation и передача хозяин замещены ферментативной defolliculation 9,10 и интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) 11-13, соответственно. ИКСИ на яйца изначально использовался для получения трансгенных лягушек 12. Сперматозоиды и эмбриональные ядра были также пересажены в в пробирке зрелых амфибий ооцитов 11,14,15. Здесь мы показываем нашу шаг за шагом метод придать сперму в пробирке зрелых ооцитов, которые были предварительно вводили антисмысловых олигонуклеотидов или РНК.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты с лягушками проводилась в соответствии требованиям внутренних дел Великобритании.

1. Подготовка Xenopus Laevis ооцитов

  1. Примерно за неделю до сбора яйцеклеток, вводят женщин лягушек с 150 U беременных Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG) для предварительного грунтования с помощью 1 мл стерильного шприца с иглой 27 G. Инъекции делается подкожно в спинной лимфатический мешок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: оптимальным является использование лягушек, которые не откладывают яйца в течение длительного времени (по крайней мере, более чем полтора года), или что никогда не откладывали яйца раньше.
  2. Хранения предварительно загрунтовать лягушек в резервуар с водой, установленной на 18 ° С в легкой комнате с управляемой (7 утра-7 вечера: на, 7 вечера-7 утра: выключено).
  3. В день сбора ооцитов, подготовка 1 л 1x модифицированных Барта раствор (MBS) от 10x MBS наличии разбавлением дважды дистиллированной воде (DDH 2 O), и добавить пенициллин и стрептомицин в конечной концентрации 10 мкг / млкаждый (MBS + PS). 10x MBS фонд состоит из 880 мм NaCl, 10 мМ KCl, 24 мМ NaHCO 3, 8,2 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, 3,3 мм Ca (NO 3) 2 · 4H 2 O, 4,1 мм CaCl 2 · 6H 2 O, 100 мМ HEPES, рН 7,5.
  4. Обезболить предварительно загрунтованных лягушки путем подкожной инъекции 120 мг (в 400 мкл) Tricaine метансульфоната (MS222). Держите вводят лягушку в небольшой емкости с водой.
  5. После 10 мин, проверьте наркозом лягушку, повернув его на так успешно анестезию лягушки не реагируют на это. Если анестезия является неполным, добавить лед в бак и подождать еще 10 минут.
  6. Возьмите лягушку из небольшой емкости и места в спинной лежачее положение на влажной салфеткой.
  7. Использование щипцов и небольшие хирургические ножницы, ущипнуть кожу и сделать небольшой разрез (2 см) в нижней части живота, сбоку от средней линии. Сделайте еще один разрез на другой стороне.
  8. После разреза кожи, поднять мышечный слой Wiго щипцы и сделать надрез в мышечный слой.
  9. Обратите внимание на яичник после мышечный слой разрезают и тянуть яичник из разрезов с помощью щипцов.
  10. Передача экстрагируют яичника в 50 мл пробирку с раствором МБС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте собрать как можно больше яичник, как это возможно с обеих разрезов.
  11. Убоя женский лягушку обескровливания, а затем путем замораживания для последующего надлежащей утилизации.
  12. Промойте извлеченные яичника несколько раз с MBS + PS пока кровь не смывается. Затем перенесите яичник в 9 см чашки Петри, содержащей MBS + PS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте качество ооцитов при вскрытии микроскопом в этой точке. Если ооциты, по-видимому плохое качество, такие как ооциты с неравномерной пигментацией у животного половины (рис 1а), не обрабатывают дальше и вместо получения нового яичника. В идеале, ооциты должны иметь не менее пигментированные полушария животных и примерно равных по размеру.
  13. Дразнить яичник на мелкие кусочки(1-2 см 2), и собирают 5 мл ооцитов в новую пробирку на 50 мл.
  14. Промыть 5 мл разорванной яичника несколько раз с MBS + PS и добавить MBS + PS 15 мл.
  15. Добавить 7 единиц фермента для defolliculation яичника суспензии (см список материалов).
    Примечание: Восстановить лиофилизированного фермента с 10 мл DDH 2 O (28 ед / мл). Помещают пробирку в течение 30 мин на льду при периодическом осторожном закрученной. Аликвоты 250 мкл и хранить при -80 ° С до использования.
  16. Инкубируйте яичников часть с ферментом в течение 1 ч при осторожном встряхивании на качалке (скоростью 15 об / мин, что эквивалентно примерно 0,014 мкг).
    Примечание: Для практически полного удаления фолликулярных клеток, 2 ч до 2 ч 15 мин инкубации с ферментом, как правило, необходимы. Более инкубации необходимо для ооцитов переноса ядра эксперимента 16.
  17. После 1 ч инкубации, забрать небольшое количество обработанных яйцеклеток (10-20 ооцитов) и передачу в 6 см чашку Петри, содержащую МБС + PS Проверьте EXTEнт defolliculation при вскрытии микроскопом. Если ооциты отделены друг от друга, и, по меньшей мере, частично defolliculated (фиг.1В), сразу же перейти к следующей реакции останова (шаг 18). Если ооциты все еще сильно в окружении фолликулярных клеток, инкубировать в течение дополнительных 15 мин при максимуме.
  18. Добавить много MBS + PS, чтобы остановить реакцию, и отбросить супернатант. Повторите промывку в 10 раз.
    Примечание: Добавить MBS + PS путем заливки в стенке 50 мл пробирку, но не непосредственно на ооцитах. После суспензии в MBS + PS, небольшие ооциты незрелые может плавать в верхней части промывочного буфера и отбросить такие малые плавающие ооцитов.
  19. После мытья, трансфер в 9 см чашки Петри, содержащей MBS + PS
    Примечание: на этой стадии и далее, сохранить ооцитов при 16-18 ° С в максимально возможной степени. Это может быть сделано путем поддержания ооцитов, содержащих блюдо на стадии контролируемой температурой.
  20. Выберите этапа VI ооцитов в соответствии с классификацией Думонтадля последующего использования и переход к новой 9 см чашки Петри, содержащей MBS + PS ооцитов может осуществляться передача с помощью стеклянной пипетки с подходящего размера наконечника (больше, чем размер яйцеклетки).
    Примечание: Качественное ооциты должны иметь равномерно пигментированные животных полушарие с четким контрастом между полушарии животных и вегетативного полушария, и быть примерно одинакового размера (рис 1в). Сценическое VI ооциты представляют окреп ооцитов, которые могут реагировать на прогестерон (диаметр ооцитов о 1,2-1,4 мм).

2. Введение антисмысловых олигонуклеотидов или мРНК в ооциты

ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные в этом разделе должно быть сделано на 16-18 ° С на столике микроскопа, оснащенного контролируемой температурой циркулирующей воде или на пластиковой коробке со льдом.

  1. Передача 200-300 выбранных ооцитов в новый 9 см чашки Петри, заполненной MBS + Ps, в которой будет выполнена микроинъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ВАСч состояние, 200-300 яйцеклеток обычно используется. В общей сложности примерно 1000 ооциты используются в одном эксперименте.
  2. Для приготовления инъекции антисмысловых олигонуклеотидов или мРНК, извлеките металлический поршень в microinjector.
  3. Заполните стеклянного капилляра с минеральным маслом с помощью шприца и вставить стеклянный капилляр, заполненный маслом с металлическим плунжером microinjector.
    ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянный капилляр тянет микропипетки съемник. Эти иглы хранятся в коробку, не повреждая советы.
  4. Отрежьте кончик иглы, используя небольшие хирургические ножницы под микроскопом с целью как наконечник малого диаметра для инъекций, как это возможно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: кончик иглы можно уточнить с помощью микро кузницы или микропипетки beveler. Для скос иглы под углом 25 ° повышает способность проникать ооцита стенку.
  5. Поместите небольшую полоску парафильмом на этапе вскрытии микроскопом и выдачи капли 3 мкл антисмысловой олиго или раствора мРНК.
  6. Перемещение Tiр инъекционной иглы в небольшой капли раствора и заполнения иглы с раствором для инъекций.
    Примечание: Если кончик иглы для инъекций слишком мал, пузырьки воздуха должны отображаться на кончике металлического плунжера. Затем, сделать больше чаевых на инъекционной иглы, пока это не произойдет.
  7. Отметить инъекционной иглы приблизительно 0,5 мм от кончика. Эта метка используется в качестве индикатора глубины инъекции.
  8. Вставьте кончик иглы в ооцит по экваториальной границы, направляя к центральной точке яйцеклетки (под зародышевого пузырька), мягко удерживая противоположную сторону яйцеклетки к точке ввода щипцами для предотвращения нежелательного движения яйцеклетки во время инъекции ,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Найти зоны, свободной от фолликулярных клеток (рис 1б) и вставить иглу с этого места, так как даже тонкая игла часто не могут проникнуть в слой фолликулярных клеток.
  9. Извлеките 4,6 нг / 4,6 NL или 9,2 нг / 9,2 нл AntisEnse олигонуклеотиды, или соответствующий объем мРНК (250 мкг до 13,8 нг) с помощью ножной переключатель. Информация о подготовке антисмысловой олиго описаны в 7.
  10. Передача инъекционные ооциты в чашку 6 см Петри заполнены MBS + PS с добавлением 0,1% BSA (ооцитов в среду инкубации; стерилизации раствор, используя фильтр 0,45 мкм пор).
  11. Инкубируйте ооцитов на 16 ° C или 18 ° C в течение 1-2 дней.
    Примечание: Вводимый ооциты могут быть подвергнуты пробирке созревания в течение нескольких часов после инъекции, и в этом случае инъекции 4,6 нг антисмысловых олигонуклеотидов является предпочтительным. Общее правило заключается в том, что короче инкубационный период, тем лучше последующее развитие эмбриона.

3. In Vitro созревания (IVM) ооцитов

  1. Вечером созревания эксперимента ооцитов, принеси прогестерон маточного раствора (30 мм в этаноле) от -80 ° C морозильника и растворить осадок при комнатной мепературе с редкими вихря.
    Примечание: прогестерон складе, как правило, оставляют при комнатной температуре в течение 30 мин до 1 ч.
  2. Добавить 5 мкл прогестерона наличии в 50 мл MBS + PS (Созревание среды; конечной концентрации прогестерона в 3 мкм) и встряхивают на шейкере в течение 30 мин, чтобы распределить прогестерон в растворе в равной степени.
  3. Подготовка агарозном покрытием 6 см блюда на экстракорпорального созревания лечения.
    1. Добавить 1 г агарозы с 50 мл 1x MBS без магний и кальций.
    2. Растворить агарозы путем нагревания в микроволновой печи.
    3. Налейте небольшой объем раствора агарозы до 6 см чашки, чтобы покрыть дно посуды.
    4. Подождите, по крайней мере, в течение 30 минут до затвердевания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агароза покрытие предотвращает налипание ооциты блюд. После того, как в пробирке созрел ооцитов плотно прикреплена к блюдам, наиболее вероятно, что ооциты будут активированы с помощью стимулов, которые они получают во время отрыва от DISГЭС.
  4. Залить 5-8 мл Созревание среды в агарозном покрытием блюда и передать 200-300 яйцеклеток в каждые 6 см блюд.
    Примечание: старайтесь, чтобы передать ооциты с минимальным количеством яйцеклеток среде инкубации.
  5. Инкубируют в течение 16 часов при 16 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, начать лечение в 5 часов вечера и закончится в 9 утра на следующий день.

4. Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ)

  1. Замороженной спермы Массоподготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: следующие подготовительные спермы должно быть сделано до начала созревания эксперимент ооцитов, и замороженные запасы спермы хранятся при температуре -80 ° С в течение ИКСИ.
    1. Соберите яички от мужчины лягушки, выполнив действия 1,4 до 1,11, для буксировки жира, кроме и яички из разрезов с помощью щипцов и удаления яичек из жира.
    2. Промыть яички в 1x Марк модифицированной Рингера (MMR, 100 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES, рН 7,4).
    3. Удалить жира А.Н.D кровеносные сосуды, прокат промытый яички на чистую папиросной бумаги, а затем, удалив оставшиеся кровеносные сосуды, используя пинцет.
    4. Место каждого яичка в блюдо 3,5 см Петри, содержащую 1 мл 1x MMR.
    5. Разрезанные продольно с мелкими ножницы, и разорвать на мелкие кусочки с помощью хирургического пинцета, пока не большие куски остаются.
    6. Пипетка вверх и вниз с помощью 1 мл пластиковый наконечник конец которой разрезают и нагрузки 1 мл дробленого семенников раствора в стакан гомогенизатора.
    7. Однородный их на 2-3 ударов, а затем заливают раствор на пор фильтра 50 мкм, прикрепленной к верхней части 15 мл центрифужную пробирку. Разрешить решение, чтобы пройти через фильтр.
    8. Повторите шаг 4.1.7 ресуспендированием оставшиеся вырезать яичка в 1 мл 1x MMR. Наконец, мыть Гомогенизатор пару раз 1х MMR и передать его через фильтр.
    9. Повторите шаги 4.1.5 4.1.8 для другого яичка и бассейн два яичек в одну 15 мл центрифужную пробирку.
    10. Спин клетки при 800 мкг при 46; С в течение 20 мин.
    11. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют осажденные клетки в 2 мл 1x MMR. Затем передать в новую пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что никаких видимых кровяных клеток нет.
    12. Подготовка ступенчатый градиент в 14 мл ультра-ясный центрифужную пробирку. Нижний слой: 4 мл 30% иодиксанола. Второй нижний слой: 1 мл 20% иодиксанола. В-третьих нижний слой: 5 мл 12% иодиксанола. Верхний слой: яичка клетки в 2 мл 1x MMR. Перекрытие градиентов очень осторожно пипетки 1 мл (наложения медленно, чтобы не нарушить нижнюю фазу).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только один слой 30% иодиксанола также должны работать для выделения только сперму.
    13. Спин в роторе SW40, используя ультрацентрифугу на 10000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин (замедление без перерыва).
    14. Аккуратно снимите трубку от ультрацентрифуге. Подтверждение интерфейс между каждым слоем градиента и осадок на дне.
    15. Соберите часть спермы от осадка.
    16. Ресуспендируют PEL спермыпусть в 1x MMR для вымывания иодиксанол. Спин при 800 х г при 4 ° С в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если много спермы все еще остаются в суспензии после вращения, повторного спина супернатант в 3220 мкг при 4 ° С в течение 20 мин и бассейн на гранулированный сперму.
    17. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку спермы в 1 мл 1х ядерной подготовки буфера (НПБ; 250 мМ сахарозы, 0,5 мМ спермидина тригидрохлорид, 0,2 мМ спермин тетрагидрохлорид, 1 мМ ЭДТА, 15 мМ HEPES, рН 7,7) 13. Затем перенесите в пробирку Эппендорфа.
    18. Добавить 50 мкл 10 мг / мл раствора дигитониновых в 1x НПБ (Ресуспендируют дигитониновых порошка в ДМСО при 50 мг / мл и замораживают аликвот при -80 ° С. Перед использованием разбавить 50 мг / мл аликвоты с 10 мг / мл с 1x НПБ. Неиспользованный 10 мг / мл дигитонинового можно заморозить и хранить при -20 ° С и повторно использовать), чтобы 1 мл раствора сперматозоидов.
    19. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
    20. Проверить скорость проницаемости по DAPI окрашивания (0,3 мкг / мл DAPI в FINAКонцентрация л). Если меньше, чем 95% клеток проницаемыми, инкубировать немного дольше.
      Примечание: Иногда, если слишком много сперматозоиды инкубируют в то же время (особенно, когда сперма, собранной из нескольких семенников), трудно проницаемыми, и в этом случае может быть необходимо добавить дополнительный небольшое количество дигитониновых; Например, если 20% спермы не проницаемыми, дополнительно 20 мкл дигитониновых добавлен.
    21. Остановка пермеабилизации добавлением 10% BSA до 3% конечной концентрации.
    22. Спин клеток при 4 ° С.
      Примечание: старайтесь как можно меньше скорость центрифугирования, как можно, начиная с 100 мкг в течение 5 мин. Если не достаточно, увеличить скорость и / или времени.
    23. Промыть клетки с 0,3% BSA в 1X НПБ и центрифуги с той же скоростью, как на стадии 4.1.22. Между тем, подготовить спермы буферной памяти (SSB; 2 мл 2 раза в НПБ, 120 мкл 10% BSA, 1,2 мл автоклавного глицерин, 680 мкл H 2 O).
    24. Добавить 500 мкл SSB в спермеПелле. Пипеток несколько раз вверх и вниз для ресуспендирования с разрезом наконечник для того, чтобы не повредить клетки.
    25. Разрешить уравновешиваться в течение ночи при 4 ° С.
    26. Внесите клетки вверх и вниз несколько раз с разрезом наконечник.
    27. Развести пару мкл 10 раз в 1x MMR или в 1X PBS рассчитывать клеток с использованием гемоцитометра.
    28. Замораживание в виде аликвот в 30 000 сперматозоидов / мкл (или выше) непосредственно при -80 ° С и хранят при -80 ° С в одном аликвоты использования.
  2. ИКСИ в пробирке созрел ооцитов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процессы, связанные с ооциты должно быть сделано на 16-18 ° С.
    1. Подготовьте стеклянную пипетку для переноса созрели ооцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянную пипетку должен быть достаточно широким, чтобы вместить ооцитов без сжатия.
    2. Шестнадцать часов после перемещения ооциты с прогестероном среде, содержащей, передача зрелости ооцитов в 6 см агарозном покрытием блюдо, заполненной MBS + PS для стирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, мatured ооциты должны рассматриваться исключительно тщательно. Грубое обращение ооцитов может вызвать самопроизвольное включение до инъекции сперматозоидов.
    3. Граф созрели ооцитов, подтвердив появление белых пятен, которая подразумевает зародышевого пузырька срыв (рисунок 2). Если скорость созревания составляет менее 80%, то маловероятно, чтобы получить достаточное количество выживших эмбрионов для дальнейших анализов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные фолликул клетки отслаиваются после созревания яйцеклетки (рис 2).
    4. Передача ооцитов из MBS промывки к новому агарозном покрытием чашку диаметром 6 см, заполненной инъекционной среды (приготовления 500 мл: 30 г Ficoll (6%), 20 мл 10-кратного MMR и 500 мкл 1,000x PS наличии).
    5. Выдержите по меньшей мере, в течение 30 минут перед началом ИКСИ.
    6. Настройте microinjector как описано в шагах 2.2-2.4.
      Примечание: Размер кончик иглы для инъекций хранится как можно меньше в соответствии с методикой, описанной на стадии 2.6. Диаметриглы 20-40 мкм. Для скос кончик иглы, как описано в стадии 2,4 могло бы позволить эффективно инъекции.
    7. Выборка аликвоту спермы и разбавления суспензии сперматозоидов в сперме Буфер для разведения (SDB; 250 мМ сахарозы, 75 мМ KCl, 0,5 мМ Спермидин, 0,2 мМ спермина, 200 мкМ HEPES рН 7,5).
      Примечание: Разбавление может изменяться в зависимости от размера иглы и так далее. Развести 120 раз на 30 000 сперматозоидов / мкл складе в качестве первоначального попытки и настроить далее, если это необходимо.
    8. Поместите небольшую полоску парафильмом на сцене вскрытии микроскопом. Смешайте спермы раствора для инъекций с помощью пипетки и обойтись несколько мкл каплю раствора сперматозоидов.
    9. Сосать разбавленной суспензии сперматозоидов в иглу, вводят 4,6 NL в 10 последовательных капель, содержащих 0,3 мкг / мл DAPI на предметное стекло микроскопа, и быстро подсчитать количество сперматозоидов поставленного на инъекцию на флуоресцентного микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель 1-2 сперму на инъекцию. При необходимости, разбавить раствор для инъекций сперму болееи не проверить количество сперматозоидов в инъекции раз до получения нужной концентрации.
    10. Извлеките решение тест впрыска и заполнить новый инъекция сперматозоида решение с должной концентрации.
    11. Внедрить 4,6 нл спермы раствора до 100 зрелых ооцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы постоянно вводить раствор. Первый определить время, необходимое для выталкивания 4,6 NL (обычно 1-2 сек). Повторите следующую процедуру; вводить в яйцеклетки, подождите несколько секунд, снимите иглу и макет инъекции в раствор для инъекций, подождите несколько секунд, вводят в ооцит. Этот непрерывный впрыск также предотвращает блокирование кончике иглы. Альтернативно, способ с использованием насоса может быть использован 13.
    12. После примерно 100 инъекции, извлеките оставшийся раствор спермы и пополнение решение спермы (используйте один и тот же раствор спермы, но пипетки вверх и вниз перед нанесением).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла не сосать решение спермы и, вырезать верхушку необходимостиле. Если это не улучшит ситуацию, подготовить новую иглу.
    13. Повторите процесс впрыска, пока все ооциты не вводится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если качество ооцитов хорошо и инъекции успешно, сокращение вводимых ооцитов рассматривается в течение 20 мин времени впрыска.
    14. Перемещение инъекционные блюда до 16 ° С или 18   ° C инкубатор.
    15. 4-5 ч после инъекции, проверьте скорость расщепления эмбрионов ИКСИ.
      Примечание: расщепления борозды этих эмбрионов может быть не столь очевидно, как у нормальных оплодотворенных эмбрионов. Некоторые эмбрионы также показывают неправильные раскол, что может быть вызвано многократным инъекции сперматозоидов.
    16. Передача расщепляется эмбрионов в том числе аномально расщепленных эмбрионов в среде инкубации (Подготовка 500 мл: 20 г фиколлом (4%), 5 мл 10х MMR и 500 мкл 1,000x PS складе).
    17. Выдержите эмбрионов либо в 16   ° C или 18 ° C инкубатор в течение ночи.
    18. На следующее утро, передача ЭмбриОС 0.1x MMR и рассчитывать выжить эмбрионов.
    19. В среднем, около 10% спермы-инъекции ооцитов могут развиваться до стадии головастика бассейн (фиг.3А).

Результаты

Эмбриональное развитие эмбрионов ИКСИ с использованием в пробирке созрел ооцитов была рассмотрена (рис 3а). Созревание ставки GV ооцитов в стадии MII являются переменными и во многом зависит от качества ооцитов. В хороших экспериментов, почти 100% Г.В. ооцитов реагировать на прогестерон и появляются признаки созревания яйцеклетки, наконец, становится яйца на стадии MII. Все созревшие ооциты были подвергнуты ICSI и около 25% введенных яиц расщепленных (фиг.3А, N = 13 для управления омлет олиго-инъекции ооцитов и п = 7 для каких-либо олиго-инъекции ооцитов). Примерно 60% или 80% расщепленного эмбрионов, полученных из контрольных олиго-инъекции ооцитов или неинъекционные яйцеклетки, соответственно, достигли стадии бластулы / гаструлы. Среди эмбрионов бластула / гаструлы, примерно половина эмбрионов в образцах олиго-инъекции были хорошего качества (почти без признаков аномального расщепления и апоптоза), тогда как 82% эмбрионов бластула / гаструлы были хорошего качества в пна впрыском пробы (фиг.3А). И, наконец, 41% и 11% расщепленных эмбрионов в образцах олиго-инъекции достигли мышечную реакцию и этапы бассейн головастика, соответственно, в то время как 60% и 29% расщепленных эмбрионов в не вводили образцов сделал (фиг.3А). Эти эмбрионы ICSI представляют собой смесь нормальных и ненормальных эмбрионов (фиг.3В). Некоторые из них претерпевают метаморфоз и развивать, чтобы созреть лягушек 8. Эти результаты показывают, что введение антисмысловых олигонуклеотидов в Г.В. ооцитов, после чего IVM и ИКСИ, позволяет эффективно раннего эмбрионального развития. Хотя введение антисмысловых олигонуклеотидов сама уменьшается эмбрионального развития, мы все еще в состоянии получить достаточное количество эмбрионов для многих экспериментальных целей, таких как проверка цены развития, RT-PCR, вестерн-блот и так далее.

figure-results-1
Инжир Юр 1: Типичные примеры Xenopus Laevis ооциты хорошего качества или плохого качества непосредственно в пробирке экспериментов созревания. () Пример плохого качества яйцеклеток. Например, ооциты, показывающие пятнистый пигментации не используются для последующих экспериментов. Каждый Xenopus Laevis ооцитов приблизительно 1,2-1,4 мм в диаметре. (B) частично defolliculated ооцитов. Правая половина ооцита покрыта фолликулярных клеток, которые можно различить по наличию кровеносных сосудов. Стрелка показывает зоны, свободной от фолликулярных клеток и в который вводят инъекции иглу. (C) пример хорошего качества ооцитов, которые одинаково размера и показать равномерно пигментированные полушария животных с ясной отличие между полушарии животных и вегетативного полушария.

2496 / 52496fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2:. Xenopus Laevis ооциты до и после созревания После созревания яйцеклетки, четкие белые пятна появляются в верхней части полушарий животных и фолликулярных клеток снимают. Каждый Xenopus Laevis ооцитов примерно 1 мм в диаметре.

figure-results-2
Рисунок 3: Развитие эмбрионов ИКСИ, полученных из в пробирке созрел ооцитов. () Разработка ИКСИ эмбрионов в каждой стадии суммируются. Яйцеклетки были введены с управлением омлет антисмысловые олигонуклеотиды (управление впрыском олиго) или без инъекции (не впрыска), а затем IVM и ИКСИ. Соответствующее количество эмбрионов на каждом этапе показано выше баров. Средняя ± SEM показано. N = 4-13 независимых экспериментов / отличается Females. (B) Примеры выживания эмбрионов ИКСИ. Эти стадии эмбрионов tailbud были произведены в одном эксперименте, в котором около 200 ооциты, используемого в качестве исходного материала.

Обсуждение

Мы здесь подробно новый метод истощить материнские факторы или гиперэкспрессией экзогенные факторы, прежде чем оплодотворения. Эта система требует два микроинъекции, но вместо этого пропускает операцию лягушек, используемого в способе передачи хост 7,17. Она оптимальна для удаления хирургии шаг лягушка в плане ухода за животными. Кроме того, мы не должны принимать во внимание качество хозяин женщин лягушек для опытов по передаче, это означает, что мы можем избавиться от одного биологического фактора, который влияет на успех экспериментов. Поэтому в этой системе является качество ооцитов, полученных из PMSG-загрунтованных лягушки основным биологическим фактором, который является ключевым для успешных экспериментов. Качество ооцитов можно судить после сбора яичников или после defolliculation. Если какие-либо отклонения наблюдается на этих этапах, это оптимально для сбора другой яичник с новой лягушки. Еще один момент, когда вы можете проверить качество ооцитов после созревания яйцеклетки. Если меньше, чем 80% прогестеронае обработанных яйцеклеток признаки созревания, вы не можете быть в состоянии получить достаточное количество эмбрионов для дальнейшего анализа. Использование ферментативного defolliculation вместо ручного defolliculation также еще одно преимущество использования этой системы, чтобы уменьшить трудоемкость defolliculation. Тем не менее, это все еще возможно, что ручной defolliculation может дать лучшее развитие, чем ферментативной обработки.

Как показано на рисунке 3, почти 10% в пробирке созрел ооциты могут достичь стадии бассейн головастика. Эти данные собраны из 13 независимых экспериментов в том числе представлены в 8 и новых экспериментов инъекций. Способ передачи хосту необходимо 75-150 ооцитов в каждой обработки для получения значимых данных, так как 30-60% от переводимой ооцитов может достигать стадии нейрулы 17. Наша методика обычно начинается с 200-300 ооцитов в каждой экспериментальной группе, так как примерно 40-60% расщепленных эмбрионов может достигатьмышечная этап ответа. Эти данные свидетельствуют о том, что оба метода поддерживать приемлемую скорость развития. До сих пор мы получены 10 живых лягушек из-под контроля мРНК-инъекции и контроль антисмысловых олиго-инъекции ооцитов, используя эту технику, указывая, что этот подход содействует развитию через метаморфозы.

Наша ооцитов метод манипуляции, ИКСИ предоставляет возможность проверить роль материнских факторов в очень раннем эмбриональном развитии, вскоре после оплодотворения. Кроме того, избыточная экспрессия факторов хроматина модифицирующих перед оплодотворением может сделать возможным реконструировать материнской хроматина перед оплодотворением для понимания материнской хроматина государства, необходимых для развития. Эта стратегия может также хорошо работать с существующими системами редактирования генов, таких как активатор транскрипции, как эффекторной нуклеазы (Тален) 18,19 и CRISPR / CAS9 20,21 так как они могут быть выражены еще до оплодотворения. Таким образом, наш новый подход имеет Potentiи др быть использованы для многих приложений в будущем.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны сотрудникам лаборатории Гурдона за полезную дискуссию. К.М. является научным сотрудником Колледжа Вольфсона и поддерживается стипендией Герчела Смита и Фондом Сасакавы в Великобритании. Лаборатория Гурдона поддерживается грантами от Wellcome Trust (RG69899) и MRC для J.B.G.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гонадотропин сыворотки крови беременной кобылы (ПМСГ) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu порошок и растворитель для раствора для инъекций
этил3-аминобензоата метансульфоната соли (MS222)SigmaA5040Для анестезии
Liberase TM Research GradeRoche 05 401 127 001Для дефолликуляции ооцитов. Магазин в -20  °С.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206Для микроинъекции
стеклянных капилляров Альфа лаборатории7" Drummond #3-000-203-G/XLдля микровпрыска
микропипетки SUTTER InstrumentModel D-97Для микроинъекций
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500Для созревания in vitro и ИКСИ
14 мл ультра-прозрачной центрифужной пробирки Beckman Coulter United Kingdom Ltd344060Для очистки спермы
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)SigmaD1556Для очистки спермы
DigitoninSigmaD141Реагент для проникновения клеток
ШейкерHybaid HB-SHK-1Для дефолликуляции ооцитов
Препарирующий микроскоп (Стерео зум-микроскоп)ZEISSSemi SV6Для сбора ооцитов и микроинъекций
50 мкм; m фильтр для порCellTrics04-0042-2317Для очистки спермы
УльтрацентрифугаBeckman CoulterOptima L-100XPДля очистки спермы
50 мл центрифуга пробиркаCellstar Greiner Bio-One227261 или 210261Сбор ооцитов и реакция дефолликуляции
15 мл центрифуга пробиркаFALCON352097Для очистки спермы
90 мм Petri Блюдо Thermo Scientific101VR20/C
Удобная чашка для клеточных культур, 60  х  15 ммFALCON353004
удобная чашка для клеточных культур, 35  х  15 ммFALCON351008

Ссылки

  1. Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
  2. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
  3. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
  4. Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
  5. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
  6. Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
  7. Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
  8. Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
  9. Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
  10. Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
  11. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
  12. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
  13. Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
  14. Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
  15. Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
  16. Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
  17. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
  20. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  21. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

II
Манипуляция и
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.