Методическая статья

Трансфекцию, Селекция, и колонии-сбор человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Тален ориентированные с GFP гена в AAVS1 Safe Harbor

DOI:

10.3791/52504

⸱

1 февраля 2015 г.

 ,  ,  , 
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TALEN-опосредованное редактирование генов в безопасной гавани локуса AAVS1 обеспечивает высокоэффективное добавление трансгенов в ИПСК человека. В этом протоколе описаны процедуры подготовки иПСК для TALEN и донорской доставки векторов, трансфекции ИПСК и отбора и изоляции клонов ИПСК для достижения целевой интеграции гена GFP для генерации репортерных линий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевое добавление трансгена может обеспечить персистентную экспрессию генов, обходя сайленсинг генов и инсерционный мутагенез, вызванный случайной интеграцией, опосредованной вирусным вектором. Этот протокол описывает универсальную и эффективную платформу целевого добавления трансгенов в ИПСК человека, основанную на использовании валидированных TALEN с открытым исходным кодом и донора, похожего на генную ловушку, для доставки трансгенов в локус «безопасной гавани». Важно отметить, что эффективность редактирования генов ограничена эффективностью доставки векторов для редактирования генов. Поэтому в данном протоколе основное внимание уделяется подготовке ИПСК к трансфекции для достижения высокой эффективности доставки ядерного топлива. Когда иПСК диссоциируют на отдельные клетки с помощью реагента для диссоциации щадящих клеток и трансфицируют с помощью оптимизированной программы, >50% клеток могут быть индуцированы для поглощения больших векторов редактирования генов. Поскольку локус AAVS1 расположен в интроне активного гена (PPP1R12C), для выбора целевых ИПСК использовали ассоциированный акцепторный (SA)-связанный ген устойчивости к пуромицину (PAC), исключая при этом нетрансфицированные клетки, предназначенные только для случайной интеграции. Эта стратегия значительно увеличивает шансы получения целевых клонов и может быть использована и в других экспериментах по нацеливанию активных генов. Через две недели после отбора пуромицина в дозе, скорректированной для конкретной линии iPSC, клоны готовы к отбору путем ручного препарирования больших изолированных колоний на более мелкие части, которые переносятся в свежую среду в меньшую лунку для дальнейшего расширения и генетического и функционального скрининга. Следуя этому протоколу, можно легко получить несколько репортеров GFP iPSC, которые полезны для визуализации in vivo и in vitro и выделения клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность перепрограммирования соматических клеток человека в клеточных как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эмбриональных стволовых (ИПСК) был впервые обнаружен Такахаши и др. В 2007 1. Фибробласты человека кожные трансдуцированные ретровирусы выражения четыре фактора транскрипции (так окрестили Яманака факторы Oct3 / 4, Sox2, с-Мус и Klf4) было показано, что очень похожи на человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на основе морфологии, пролиферации, экспрессии генов и эпигенетическом статуса; важно, иПСК также способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков 1. Пролиферативный потенциал и дифференциация мощность ИПСК делает их очень привлекательными инструментами; перепрограммирования клетки от пациентов, страдающих от конкретных заболеваний, иПСК могут быть использованы как в качестве ин витро модели болезни систем и в качестве потенциальных терапевтических.

Для последней цели, некоторые вопросы должны быть решены до полного потенциала ИПСКв клинической практике может быть реализован; онкогенными потенциал в пробирке, культивируемых ЭСК и ИПСК, использование ксеногенным производных во время перепрограммирования и обслуживания клетки, и необходимость отслеживать пересаженных клеток в естественных условиях все важные препятствия для клинического применения плюрипотентных стволовых клеток (обзор Hentze соавторами. 2). Идеальное решение о необходимости отслеживания дифференцированных клеток после трансплантации будет включать визуально обнаруживаемый маркер, который устойчив к звукоизоляции, а также пестрота, независимо от приложения. Прочная и устойчивая выражение интегрированных генов являются наиболее легко достижимо, когда экзогенная ДНК вводят в безопасной гавани локусов; то есть, геномные сайты, которые позволяют достаточно транскрипцию интегрированного вектора и в то же время, смягчающего возмущения выражения в соседних генов 3. Один из таких сайтов, который был очень хорошо характеризует с момента его открытия в том, аденоассоциированный вирус Integrвания сайт 1 (AAVS1), в первом интроне белка фосфатазы 1 регуляторная субъединица 12С (PPP1R12C) гена. Этот локус, как было показано не только позволяют поддерживать и надежный выражение комплексных трансгенов с помощью расширенного времени в культуре и в пробирке дифференциации 3, но также и для защиты окружающей гены транскрипции возмущения 4; обе функции, как считается, из-за присутствия эндогенных хроматина элементов диэлектрик, фланкирующих AAVS1 сайт 5.

Достижения в геном технических средств Только за последнее десятилетие значительно облегчило легкость и эффективность, с которой генетические манипуляции в любой тип клеток может быть достигнута. В то время как ранние успешные эксперименты опиралась на чрезвычайно низкие уровни эндогенного гомологичной рекомбинации (HR) с введенной донора для достижения ген ориентации в ESCs 6,7, использование конкретных участков нуклеаз, таких как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), которые СИГВВПficantly вызвать гомологичной рекомбинации через поколения перерыва двухцепочечной ДНК значительно повысило эффективность таких экспериментов 8,9. Повторное использование обоих транскрипционных активаторов, как эффекторов (сказок) растительного патогенного Ксанфомонас родов и прокариотических кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторов (CRISPR) / Cas9 система в эффективные дизайнерские нуклеаз сайт-специфических сделал генного таргетинга в плюрипотентных стволовых клеток доступны и практически методология 10-13.

Недавняя статья описано эффективный способ для стабильной интеграции зеленого флуоресцентного репортера кассеты в AAVS1 безопасной гавани локуса человека ИПСК с помощью Сказка нуклеазы (Таленс) 14. Эти целевые иПСК сохранили свою флуоресценцию даже после направленной дифференцировки в кардиомиоциты и трансплантации в мышиной модели инфаркта миокарда (ИМ), обеспечивая убедительные доказательства полезности такихстабильно люминесцентные плюрипотентные стволовые клетки 14. Чтобы получить целевые колонии, метод гена-ловушка была использована в котором сплайсинга-акцептор (SA), 2А саморасщепляющиеся пептидную последовательность помещает пуромицин N-ацетил-трансферазы (PAC), ген под контролем эндогенного промотора PPP1R12C; Таким образом, только иПСК, которые включили донора ДНК в локусе AAVS1 выразить PAC, делая их доступными для на основе пуромицину сопротивления; (Рисунок 1, 15). Подробнее Этот протокол процедуры генерации AAVS1-GFP иПСК сообщили в недавней работе 14, в том числе процесс трансфекции ИПСК с Talens и 9,8 кб донора интеграции фрагмент 4.2kb ДНК в AAVS1 безопасной гавани локуса, выбрав ИПСК на основе пуромицину сопротивление, и сбор колонии для клональной экспансии. Методики, описанные в данном документе, могут быть применены ко многим генома инженерных экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка базальной мембраны Матрицы и покрытие Пластик

  1. Поместите замороженные базальной мембраны матрицу запас от -20 & deg; С на лед и оттаивают в течение ночи при 4 ° С.
  2. После оттаивания, пипетки 2 мг аликвоты базальной мембраны матрицы в предварительно охлажденные пробирки Эппендорфа. Храните их на -20 ° C до необходимости.
  3. Чтобы подготовить матричные покрытием пластин базальной мембраны, не таять одну аликвоту на льду до последнего куска льда в пробирку Эппендорф исчезает (обычно в течение ~ 2 ч).
  4. После оттаивания, добавить базальной мембраны матрицу 12 мл холодного (4 ° С) DMEM / F12, чтобы базальной мембраны раствора матрицы покрытия.
  5. Добавить матричного раствора, базальной мембраны в соответствующей культуральной судна. Для 6-луночный планшет с, обойтись 1 мл на лунку. Вихревой пластину, чтобы убедиться, матрица решений базальная мембрана полностью покрывает каждую лунку.
  6. Парафильмом запечатать базальной мембраны матрицы покрытием пластин / блюдо, и инкубировать при Роом температуре в течение 1 часа перед использованием. Кроме того, матричные пластинок, покрытых магазин базальной мембраны / блюда в 4 ° С и использовать в течение 2 недель покрытием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте экстра DMEM / F12 с базальной мембраной матрицы покрытием пластины / блюдо, чтобы предотвратить высыхание. Перед использованием 4 ° C хранить базальной мембраны матрицы покрытием пластин / блюдо, поместите его в кабинете биологической безопасности и дать ему нагреться до комнатной температуры в течение по крайней мере 30 мин.
  7. Аспирируйте базальной мембраны матрица полностью перед добавлением среды и клеток.

2. Подготовка E8 среды

  1. Подготовка E8 культуральной среды путем оттаивания E8 добавки в течение ночи при 4 ° С.
  2. Удалить 10 мл E8 базальной среде со склада 500 мл и выбросить.
  3. Внесите всю 10 мл флакон E8 дополнения непосредственно в 490 мл E8 базальной среде. Не теплый полный E8 среду на водяной бане 37 ° C, а повторные колебания температуры могут ухудшить bFGF в КомплексыTE E8 средой.
  4. Используйте полный E8 среды в течение 2 недель добавлением добавки.

3. Таяние ИПСК

  1. Снимите флакон замороженных ИПСК из жидкого азота и место на сухом льду.
  2. Быстро разморозить флакона в водяную баню при 37 ° С; не взболтать флакон в водяной бане, пока только небольшой фрагмент льда останков.
  3. Спрей флакон с 70% этанола и трансфер в кабинете биологической безопасности.
  4. Добавить 1 мл каплям при комнатной температуре E8 среднего непосредственно в ампулу.
  5. Использование 2 мл пипетки, передавать по каплям клеточной суспензии в 9 мл среды E8 в 15 мл коническую трубку. Вихревой трубки часто, чтобы гарантировать, что клетки и среду хорошо перемешать быстро.
  6. Центрифуга клетки при 200 х г в течение 5 мин.
  7. Аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632.
  8. Добавить клеток с соответствующим числом подвале MEMBRANе матрица-лунок, и место в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение ночи. Рекомендуется к пластине по меньшей мере 0,2 х 10 6 IPSC на лунку 6-луночный планшет для того, чтобы в быстром восстановлении после оттаивания.

4. Техническое обслуживание и текущий пассажи из ИПСК

  1. Обновить E8 среды ежедневно.
  2. Следить за морфологию и слияния клеток с помощью инвертированного микроскопа. иПСК высокого качества растут в плоских колоний с различными границ; отдельные колонии обладают "булыжника" вида.
  3. Прохождение клетки ИПСК когда они достигают ~ 70% слияния.
  4. Подготовка решения ЭДТА пассажи, добавив 0,9 г NaCl и 500 мкл 0,5 М ЭДТА до 500 мл DPBS. Все хорошо перемешать, чтобы растворить NaCl, и вакуумный фильтр для стерилизации. Теплый аликвоту пассирования раствора в 37 ° С водяной бане до пассажей.
  5. Для прохода, аспирации провел культуральной среды и промыть клетки один раз равным объемом теплой парованных решение. Аспирируйте и пипетки достаточно ЭДТА пассирования раствор для покрытия ячейки (1 мл на лунку 6-луночного планшета).
  6. Поместите клетки под инвертированным микроскопом и наблюдать колонии IPSC. Появление отверстия в колониях и привлеченных границ должно стать очевидным, в 2 до 5 мин.
  7. Тщательно аспирата ЭДТА пассажи решение.
  8. Использование 10 мл пипетки, обойтись 4 мл среды E8 (при использовании 6-луночный планшет) под высоким давлением непосредственно в каждую лунку, чтобы быть пассировать.
  9. Соберите сгустки IPSC, и группа распалась на соответствующее число скважин в зависимости от соотношения отколовшихся от 1: 8 до 1:12. Не слишком пипетки, а разбивка скопления клеток может привести к ухудшению жизнеспособности.
  10. Поместите пластину в инкубаторе, и рок пластину обратно и вперед и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки.

5. Подготовка MEFs и ИПСК для Tansfection

  1. 48 ч до transfectioN, прохождение иПСК при ~ 1: 6 в четырех или более лунки базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночного планшета, так, что они будут 70% сливной два дня, следовательно.
  2. На следующий день, оттаивают DR4 MEFs в MEF среды, состоящей из DMEM с высоким содержанием глюкозы () с добавлением 10% FBS и 1x-MEM NEAA.
  3. Пластина DR4 MEFs на две 10-см чашки при ~ 2 х 10 4 клеток / см 2 и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
  4. В день трансфекции MEF изменить среду Е8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 30 минут, прежде чем выполнять трансфекцию на ИПСК.
  5. Необязательно: Если проточной цитометрии анализ ИПСК после трансфекции желательно, удалить базальной мембраны матрицы покрытием плиту от 4 ° C и место при комнатной температуре.
  6. Дополнительно: 4 ч до трансфекции, в дополнение предварительно трансфекции Ipsc культуру с Y-27632 в конечной концентрации 10 мкМ.

6. нежно-клеточной диссоциации реагента Леченией Трансфекцию ИПСК с помощью электропорации системы

  1. Удалить P3 первичной решение трансфекции клеток от 4 ° C и дайте ему нагреться до комнатной температуре в течение ~ 30 мин. Добавить весь 100 мкл дополнение к трансфекции раствора перед применением.
  2. Теплый нежно-диссоциации клеток реагент в C на водяной бане 37 °.
  3. Получить AAVS1 Talens (ЦТС-AAVS1-L1 и ЦТС-AAVS1-R1) и AAVS1-CAG-EGFP донора от -20 ° C.
  4. Удалить ИПСК из инкубатора и промыть один раз DPBS.
  5. Добавить 1 мл нежно-клеточной диссоциации реагента в каждую лунку, и инкубировали ИПСК при 37 ° С в течение 5 мин, или до более чем 50% клеток не отделены от культурального сосуда.
  6. Пипетки клетки вверх и вниз несколько раз с использованием пипетки P1000, чтобы отделить все оставшиеся клетки из культурального сосуда, и чтобы разбить комки Ipsc.
  7. Добавить 2 мл E8 среды в каждую лунку, и пипеток вверх и вниз несколько раз с помощью 10 мл пипетки Фюртэ разбить скопления клеток в одиночных камерах
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансфекции значительно снижается, если скопления клеток не являются достаточно разбивки.
  8. Сбор ИПСК в 15 мл коническую трубку, и центрифуге при 100 мкг в течение 3 мин.
  9. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в минимальном количестве E8 среды.
  10. Граф клеток с использованием гемоцитометра после применения витальной окраски, например, 0,4% трипановым синим. Убедитесь, что клетки достаточно диссоциируют при подсчете (1-3 клеток в "комок").
  11. Не включать 3 × 10 6 клеток в каждую из двух 15 мл конические пробирки и снова вращаться при 100 х г в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая скорость центрифугирования уменьшает стресс клеток и позволяет легко ресуспензию ИПСК до электропорации.
  12. Установите систему электропорации в конкретной программе камерного типа для эмбриона человека линии стволовых клеток H9 (Программа CB-150).
  13. После центрифугирования супернатант аспирата из CELл гранулы. С одной таблеткой, добавить 10 мкг HR донора в контрольном образце. Для другой гранулы добавляют 10 мкг HR донора, а также 5 мкг каждого Тален (PZT-AAVS1-L1 и PZT-AAVS1-R1) в экспериментальном образце.
  14. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 100 мкл Р3 первичной трансфекции клеток раствором и передачи в кювету.
  15. Выполните трансфекции и сразу же добавить 500 мкл комнатной температуры E8 среды в каждую кювету.
  16. Передача по каплям трансфицированную ИПСК к одному 10-см блюдо с DR4 MEFs, полученного на стадии 5.4.
  17. Дополнительно: Добавить несколько капель из каждого эксперимента в одну лунку в базальной мембраны матрицы покрытием 6-луночный планшет, если проточной цитометрии Анализ на эффективность трансфекции желательно.
  18. Повторите шаги 6.15-6.17 закончить как образцы. На следующий день, мыть клетки с DPBS в два раза и перейти культуральной среды NutriStem, который, кажется, поддерживает IPSC культуру на фидерах лучше, чем E8.
  19. Трansient пики экспрессии EGFP в 48 до 72 ч после трансфекции; оценить эффективность трансфекции по желанию.

7. Пуромицин Выбор целевых ИПСК

  1. Начните выделение на Пуромицин 72 ч после трансфекции, когда иПСК до 70% слияния.
  2. Для NCRM5 ИПСК, начинают отбор пуромицин на 0,5 мкг / мл пуромицин (1/2 полной дозы) разведенной в NutriStem культуральной среде. Оптимальная концентрация пуромицин может варьироваться от 0,25 до 1 мкг / MLL для некоторых линий ИПСК.
  3. Культура иПСК в NutriStem + 0,5 мкг / мл пуромицин в течение 3 дней, ежедневно прохладительные среды.
  4. После 3-х дней, увеличивают концентрацию пуромицин до 1 мкг / мл.
  5. Культура иПСК до 1 мкг / мл пуромицин отбора еще 7 до 8 дней, или до тех пор, отдельные колонии не оказаться достаточно большой для колонии сбора.

8. колонии Выбор и расширение целевых ИПСК

  1. Использование базальной мембраныМатрица, чтобы покрыть 96-луночный планшет с дозирования 50 мкл раствора базальной мембраны матрицы покрытия (2 мг базальной мембраны разбавляют в матрице 12 мл DMEM / F12) в каждую лунку. Хранить пластины при 4 ° С в течение ночи перед использованием.
  2. После того матрица покрытием пластины базальной мембраны до комнатной температуры, аспирация базальной мембраны матрицу и внесите 100 мкл E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 в каждую лунку.
  3. Разместить инвертированного микроскопа в кабинете биологической безопасности, и брызги слегка с 70% этанола для стерилизации.
  4. Вытяните стекло пипетки Пастера над горелкой Бунзена, чтобы получить идеальный инструмент колонии-сбор, который имеет крошечный "крюк" на кончике. Стерилизовать 70% этанола, и поместите в капюшоне, чтобы высохнуть.
  5. Снимите блюдо, содержащее целевые колонии IPSC из инкубатора, и поместите в капот под микроскопом.
  6. Выберите ИПСК, прослеживая круг вокруг колонии границы с колонии-сбор инструмента.
  7. Используйте "крюк" инструмента колонии-сбор мягко очистить и удалить колонию IPSC от поверхности пластины. Для больших колоний, проводя X с колонии-сбор инструмента в квартале колония будет способствовать росту клеток после повторного посева.
  8. После того, как скопления клеток отделяются и свободно плавающий, использовать P200 пипеткой установить на ~ 30 мкл для сбора ИПСК. Пластина клеток непосредственно в 96-луночного планшета.
  9. Дополнительно: использовать P20 пипетки установлен на ~ 5 мкл для сбора ИПСК в пробирку Эппендорфа, затем добавить 50 мкл нежно-клеточной диссоциации реагента усваивается в течение 5 мин при 37 ° С. После расщепления, добавить 500 мкл E8 среды в пробирку Эппендорфа, чтобы разбавить диссоциации реагента нежно-клеток и замедления вращения клеток при 200 мкг в стандартной настольной микроцентрифуге в течение 5 мин. Тогда аспирации большую часть среды и оставить ~ 30 мкл для ресуспендирования и передачи клеток в 96-луночный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭтоПодход будет способствовать диссоциацию клеток скопления и быстрого расширения подобрали колонии.
  10. Продолжить колонии комплектование до достаточное количество колоний ИПСК не были собраны (примерно 20-30 колоний на эксперимента рекомендуется).
  11. После колонии сбора, поместите 96-луночного планшета в инкубаторе в течение ночи. Обновить с полной E8 среде следующий день, и культуры до ~ 70% сливной.
  12. Прохождение клетки от 96-луночного в 24-и, а затем в 6-ну, как описано в шагах 4.5-4.10.
    Примечание: объемы раствора ЭДТА и E8 среды должна быть пропорционально уменьшена при использовании скважин меньше, чем 6-луночный планшет с.
  13. Оценка адресности слиянием ПЦР и Южной блот-анализа для подтверждения направленной интеграции кассету и отсутствию случайно вставленными векторов 16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация протокола, представленный на рис 2, с периодами, в течение которого иПСК культивируют в другую среду, выделенную либо зеленый E8 или синий для NutriStem. Важно трансфекции только высококачественные ИПСК; изучить культуру кухни в течение планового технического обслуживания и убедитесь, что IPSC культуры содержат в основном отдельные колонии, несущие булыжной морфологию (рис 3а); дифференцированные клетки не должны занимать более 10% от культуры. Transfectability из ИПСК оцен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важные шаги для успешного поколения AAVS1 безопасной гавани нацелены человека иПСК являются: (1) эффективной доставки Тален и донорские плазмиды в ИПСК с помощью трансфекции; (2) оптимизация диссоциации ИПСК в одиночные клетки до трансфекции и покрытия плотностью после трансфекции; (3) оптимизация дозы и время лекарственной выбор, основанный на росте IPSC линии; (4) тщательно анализируя и выбирая целевых колонии и передачи новой пластинкой / лунку. По сравнению с аналогичными методами, используемыми в работе Ho...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Общим фондом NIH и Программой внутренних исследований Национального института артрита, опорно-двигательного аппарата и кожных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Матрица базальной мембраны Matrigel Growth Factor Reduced (GFR), *LDEV-Free, 10 млCorning354230Хранить при -20 °C.
DMEM/F-12Life Technologies11320-033Магазин в 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-обработанные многолуночные планшетыCorning3506
Essential 8 MediumLife TechnologiesA1517001Храните базальную среду при 4 °C. Храните добавку при -20 °C. Храните добавку при -20 °C.
Y-27632 дигидрохлоридTocris1254Хранить при комнатной температуре. После растворения в H2O, хранить при температуре -20 °C.
Хлорид натрияSigmaS5886-500G
UltraPure 0,5 М ЭДТА, pH 8,0Life Technologies15575-020
DPBS, без кальция, без магнияLife Technologies14190-250
100 мм TC-обработанная культуральная чашкаCorning430167
DR4 MEF 2M IRR - AcademicGlobalStemGSC-6204GХранить в жидком азоте.
DMEM, высокий уровень глюкозы, пируватLife Technologies11995-040Хранить при 4 °C.
Определенная фетальная бычья сыворотка, американского происхожденияHyCloneSH30070,03хранить при -20 °C. Размораживать при 4 ° ° C; C на ночь и аликвота. Хранить аликвоты при -20°С; C до тех пор, пока не понадобится.
Раствор заменимых аминокислот MEM (100X)Life Technologies11140-050Хранить при 4°C.
Блок ядра 4D-нуклеофэктора LonzaAAF-1001Bвходит в состав электропорационной системы
4D-Nucleofector X unit LonzaAAF-1001Xвходит в состав системы электропорации
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)LonzaV4XP-3024По прибытии удалите раствор первичной клетки, добавьте и храните при температуре 4 °C.
Реагент для диссоциации клеток StemPro AccutaseLife TechnologiesA1110501хранить при температуре -20°C. Разморозить на ночь при температуре 4°°C; C и прогреть аликвоту в 37° C водяной баней перед использованием.
NutriStem XF/FF Culture MediumStemgent01-0005Хранить при -20 °C. Разморозить на ночь при 4° ° C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 и pZT-AAVS1-R1)Addgene52637 and 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP Гомологичный рекомбинационный донорAddgene22212
Puromycin dihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03Хранить при -20 °C. Приготовьте рабочие аликвоты 1 мг/мл в ddH2O.
Одноразовый боросиликатный стекло Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-20A
Sorvall Legend XTR (охлаждаемый), 120 В 60 ГцThermo Scientific75-004-521
TX-750 4 × 750 мл качающееся ведро роторThermo Scientific75003607
Trypan Blue Solution, 0,4%Life Technologies15250-061

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
  3. Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
  4. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  5. Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
  6. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  7. Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
  8. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  9. Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
  10. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
  11. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
  12. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  13. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  14. Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
  15. Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
  16. Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
  17. Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TALENGFPE8

Похожие статьи