Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой

14.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52520

⸱

4 марта 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол для употребления инъекционных ультразвуковые микропузырьков контрастных агентов в живую, изолированных поздно созревания эмбрионов на стадии мышиных. Этот метод позволяет изучать параметров перфузии и сосудистых молекулярных маркеров в пределах эмбриона с использованием высокочастотного изображений контрастным усилением УЗИ.

Аннотация

Ультразвуковая визуализация с контрастным усилением может передать важную количественную информацию о васкуляризации и перфузии тканей и, в целевых приложениях, облегчить обнаружение и измерение сосудистых биомаркеров на молекулярном уровне. В эмбрионе мыши этот неинвазивный метод может быть использован для выявления основных механизмов, лежащих в основе развития сосудов в системе кровообращения мышей на ранних стадиях, а также в генетических моделях сердечно-сосудистых заболеваний. Эмбрион мыши также представляет собой прекрасную модель для изучения адгезии микропузырьков к ангиогенным мишеням (включая рецептор фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR2) или αvβ3) и для оценки количественной природы молекулярного ультразвука. Поэтому мы разработали метод введения ультразвуковых контрастных веществ в сосудистую сеть живых, изолированных эмбрионов. Это обеспечивает свободу с точки зрения управления впрыском и позиционирования, воспроизводимость плоскости изображения без препятствий и движения, а также упрощение анализа и количественной оценки изображений. На поздней гестационной стадии (эмбриональный день (Е)16.6 и Е17.5) эмбрионы мышей были выделены из матки, аккуратно выведены наружу из желточного мешка, а микропузырьковые контрастные вещества были введены в вены, доступные на хорионической поверхности плацентарного диска. Затем была использована нелинейная контрастная ультразвуковая визуализация для сбора ряда основных параметров перфузии (усиление пика, скорость вымывания и время до пика) и количественной оценки целевого связывания микропузырьков в модели эндоглиновой мыши. Мы показываем успешную циркуляцию микропузырьков в живых эмбрионах и полезность этого подхода для характеристики сосудистой сети эмбриона и поведения микропузырьков.

Введение

Контрастное ультразвуковое исследование использует микропузырьков контрастных агентов для визуализации и характеризуют сосудистой оболочке. Эти агенты позволяют неинвазивного оценку микроциркуляции, кровеносных сосудов и сердечно-сосудистой системы. Кроме того, модификация поверхности пузырька может привести к целевой микропузырьков связывания с эндотелиальными биомаркеров, как показано в доклинических приложений ангиогенеза, атеросклероза и воспаления 1,2 делая молекулярную ультразвуковой визуализации сосудистых событий возможных. Поэтому Контраст усиливается ультразвук может быть использован для идентификации сложные и разнообразные среды, влияющие на здоровых и больных сосудистые состояния 3-5.

В последние несколько лет интерес к полезности изображений микропузырьков расширилась до универсала модели мышиного эмбриона. В качестве модели развития млекопитающих, введение микропузырьков в эмбриональном сосудистой повышает физиологическиеИсследование развивающихся сердечно-сосудистой системы (например, потока крови, сердечный выброс) и в тех случаях, трансгенных и целевых мутантных мышах болезни сердца 6,7, может дать представление о том, как генетические факторы изменения сердечно-сосудистой системы. В самом деле, количественный и качественный 2D анализ эмбрионального сосудистой мозговой уже достигнуты 8. Кроме того, эмбрион мыши представляет как прекрасным примером для изучения связывания целевых микропузырьков сосудистых маркеров в естественных условиях. Bartelle и др. 9, например, ввели авидин микропузырьков в зачаточном желудочков сердца с целью оценки целенаправленное связывание в Biotag-Бира трансгенных эмбрионов и изучить сосудистую анатомию. Поколение гетерозиготных и гомозиготных мышиных моделях может быть также использован в качестве суррогата модели опухоли исследований, направленных на определение количественного природы молекулярного УЗИ - важный ориентир в переводе эту технику в клинику.

Микропузырьки наиболее часто вводят в эмбриональном обращении через внутри-сердечной вливаний в отдельных эмбрионов, которые открыты в лапаротомии 8-10. В утробе матери инъекций, однако, сталкиваются с целым рядом проблем. Они включают в себя инъекции руководство, необходимость борьбы с движением у матери и экстериоризированного эмбриона, поддержание гемодинамики жизнеспособности у матери и выводили эмбрионов, обращаясь долгосрочные последствия анестезии и осложнения, связанные с кровотечением 11. Таким образом, цель исследования состояла в разработке методики для введения микропузырьков в изолированных жилых поздней стадии эмбрионов 12. Эта опция предлагает больше свободы в плане управления впрыском и позиционирования, воспроизводимости плоскости изображения, без препятствий, и упрощенного анализа изображений и количественной оценки.

В настоящем исследовании мы опишем новый порядок введения микропузырьков в живых эмбрионов мышей FOR целях изучения микропузырьков кинетическое поведение и изучения целевой микропузырьков связывания эндогенных эндотелиальных поверхностных маркеров. Нелинейная конкретных изображений контраст УЗИ используется для измерения ряда основных параметров перфузии в том числе пик повышения (PE), промыть в скорости и времени до пика (ТТП) в изолированных зародышей E17.5. Мы также продемонстрировать справедливость модели эмбриона для оценки количественной природы молекулярной ультразвука в эмбриональной потере эндоглин функции трансгенных мышах, где эндоглин является клинически значимым целевой благодаря своей высокой экспрессии в эндотелиальных клетках сосудов в местах активного ангиогенеза 13 , Адгезия эндоглина ориентированные (MB E), крысы изотипического IgG 2 управления (MB C) и нецелевые (MB U) микропузырьков оценивали в гетерозиготном эндоглина (Eng +/-) и гомозиготной эндоглина (Eng + / +), выражающая эмбрионов. Анализ целевого биндинг показывает, что молекулярная УЗИ способны дифференцироваться между эндоглина генотипов и относящихся плотности рецепторов к количественному уровнях молекулярных ультразвука.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: экспериментальные методики, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в Sunnybrook научно-исследовательского института (Торонто, Онтарио, Канада) на. Процедуры для гуманного обращения с животными должны соблюдаться во все времена. Предполагается, что следователь обучение по основам эксплуатации ультразвуковой системы визуализации. Этот протокол работает лучше всего с двумя людьми.

1. Животные модели

  1. Mate CD-1 самец и самка Mus Musculus получить диких эмбрионов типа для перфузионных исследований.
  2. Для молекулярных методов визуализации, создавать мышей ENG +/- путем гомологичной рекомбинации с использованием эмбриональных стволовых клеток 129 / Ola происхождения, как описано Бурдо и др. 14.
    1. Мышей обратное скрещивание B6- ENG +/-, любезно приобрел у доктора Мишель Letarte, в CD-1 фоновом режиме. Использовать Eng +/- компакт-1 обратному скрещиванию эмбрионов, а также их Eng + / + однопометница соntrols. Mate мышей, чтобы произвести постановочные эмбрионов.

2. Экспериментальная Подготовка

  1. Инициировать спаривания мышей и проверить пробки ежедневно. Эмбриональные день 0,5 определяется как полдень дня наблюдается влагалища плагин.
  2. Подготовка эмбриона носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки, 5 мл 1 М HEPES и 5 мл пенициллина-стрептомицина (10000 единиц пенициллина, 10000 мкг стрептомицина) до 500 мл модифицированного Дульбекко среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг / л). Оберните бутылку в фольге и держать охлажденным при температуре 4 ° С.
  3. Центрифуга ясно, ультразвуковой гель в 50 мл конические пробирки при 140 х г в течение 20 мин. Нарисуйте гель вверх в 30 мл шприцев. Заполните дополнительные (отмечены) 30 мл шприцы с фосфатным буферным раствором (PBS) и отложите в сторону. Один помет эмбрионов, как правило, требуют от 2-3 шприцев ультразвуковой гель и 4 шприцы PBS.
  4. Потяните около 30 стеклянных иглы и аккуратно крепятся к полосе пластилинав 100 х 20 мм клеток культуральной чашке. Это гарантирует, что иглы разделены и безопасно во время обработки. Используя стеклянную съемника использовать следующие параметры на 1 х 90 мм стеклянных капилляров с нитью: автономный отопитель 77, Sub магнита 55, главным магнитом 70.
  5. Подготовка 11:50 рассечение пластины (достаточно, чтобы обеспечить каждого эмбриона в помете получает свой блюдо), используя соотношение 1: 8 громкости отвердителя на базу. Налейте 40 мл базы в 50 мл коническую трубку. Добавить 5-6 мл отвердителя и перемешать деревянной палкой.
    1. Налейте в 60 х 15 мм культуры блюд, заполняя каждый приблизительно на половину. Позвольте стенду O / N, чтобы установить.
  6. Прикрепите женские Luers до 400 мм длинные куски из поливинилхлорида (ПВХ) труб (внутренний диаметр: 0,79 мм). Трубки должны добраться из шприца на сцену ультразвуковой комфортно.

3. Экспериментальная установка

  1. Упорядочить изображений платформу под операционным микроскопом с 3D двигателем и линейкой 21 MHг датчик.
    1. Orient платформа, так что рейку находится слева, со стадией, расположенного непосредственно под микроскопом.
    2. Установите 3D двигатель с шаровым шарниром части, проходящей рычага платформы. Винт быстрого выпуска должность зажима датчика в быстрое освобождение смонтировать на двигателе, лицом вперед, и положение датчика голову в хомут, закрыв защелку.
    3. Закрепите разъем датчика в активном порту на передней панели корзине. Включите машину.
  2. Инициировать ультразвуковой датчик 21 МГц, выбрав установку "кардиология" для молекулярных методов визуализации и «Общие положения» перфузионных исследований. Установить все время усиления компенсации ползунки для точной средней позиции. Для "Контраст Режим" установите следующие параметры: Частота: 18 МГц, мощность передачи: 4%, (0,39 МПа), Контраст усиления: 30 дБ, очаги: 6 & 10 мм, Контраст Режим: нелинейная, взрыв время: 100% в 0,1сек, ширина ширина: Широкий.
  3. Алиготе 40 мл эмбрион СМИ каждый на четыре 50 мл конические пробирки. Поместите на льду.
  4. Тепло 1 л воды в 2 л химический стакан на плитке. Поддержание при 45 ° С. Добавить один шприц ультразвукового геля и PBS в стакан для предварительного нагрева. Поддерживать эту температуру путем мониторинга с термометром во все времена.
  5. Отложите 11:50 1 мл шприцев и 11:50 21 G иглы для инъекции микропузырьков.

4. Хирургические процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Есть помощник подготовить пузыри (стадия 5), а хирург приступает к хирургической процедуры. Протокол, описанный здесь, была заимствована из Уайтли и др. 15

  1. Сбор E16.5 или E17.5 эмбрионов от беременной женской мыши следующие смещения шейных позвонков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: эффекты анестезии на эмбрионах до сих пор не изучены в деталях 16. Дополнительные методы, в том числе декапитации, может быть целесообразным опния в жертву беременных мышей.
    1. Разрежьте брюшко, чтобы выявить матку & эмбрионов. Аккуратно и быстро удалить матку, сокращая на кончиках рогов матки (отделяя яичников и маточных сосудов) и разрыва в влагалище и мочевого пузыря.
    2. Использование Пинцет, трансфер матку трубки 40 мл ледяной эмбриона СМИ как можно быстрее без ущерба для эмбрионов. Откажитесь от туши мыши.
  2. Переезд с микроскопом и на сцене. Депозит матку в 100 х 20 мм для культивирования клеток блюдо. Передача матки в новую тарелки, заполненной 50 мл свежего эмбрионального сред.
  3. Использование стерилизованной (70% этанола спрей) тонких щипцов, осторожно оторвать и оторваться наружные мембраны матки, начиная с одного конца. Expose плацентарный децидуальной, теменной желточного мешка и мембрану REICHERT к отделять и удалять из основного висцерального желточного мешка.
  4. Рассеките из эмбрионов один за другим, сохраняя висцерального уOlk мешки неповрежденные и обработки плаценты как можно осторожнее 17. Будьте осторожны, чтобы избежать разрыва желточного мешка, как эмбрионы выскочить немедленно.
    1. Используйте перфорированный ложку, чтобы переместить эмбрионов другое блюдо держали на льду со свежими СМИ эмбриона. Держите эмбрионов в охлажденном, пока не понадобится. Изменить носитель в зачаточном блюдо каждый 1-1,5 ч. С этих условиях эмбрионы являются жизнеспособными на срок до 4 ч после вскрытия.

5. Микросепаратор Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните молекулярная визуализация при помощи ультразвука с использованием как целевые и нецелевые микропузырьков. Один эксперимент может потребоваться до 3 отдельных ампулах микропузырьков: я) антител направлены микропузырьки, II) контроль изотипа целевых микропузырьков и III) нецелевые микропузырьков. Контрастное вещество приходит в виде сухого порошка, замораживания и должна быть восстановлена ​​с физиологическим раствором перед инъекцией. Есть ~ 2 х 10 9 микропузырьки в каждом нецелевого MicroBubble флакон и ~ 8,8 х 10 8 микропузырьки в целевых готовых ампул. Микропузырьки стабильны в течение до 3 ч после приготовления.

  1. Восстановление Целевые Готово флаконов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры целевых готовых препаратов: эндоглина целевые микропузырьки (MB E, биотинилированными крыс MJ 7/18 антитела к мыши эндоглина; в доме гибридом объекта); сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептора 2 (VEGFR2) целевые микропузырьки (МБ В, с биотином мышиного анти-CD309); крыса изотипу IgG 2 контрольное антитело целевые микропузырьки (MB C, биотин крыса изотипу IgG 2 управления ориентации мыши IgG2a).
    1. Развести раствор антител (20 мкг) в 1 мл (конечный объем физиологического раствора). Держите на льду.
    2. Заполните шприц с 1 мл физиологического раствора, удаляя все пузырьки воздуха. Прикрепление 21 G иглу, вводят раствор медленно в микропузырьков флаконе.
    3. Медленно снять поршень, удаление 1 мл воздуха, и извлеките иглу. Мягкоагитировать. Дайте постоять 5 мин на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковые микропузырьки могут быть уничтожены в соответствии с средах с высоким давлением.
    4. После прошедшего времени, заполнить новый шприц с разведения антитела и добавить к соответствующему флаконе. Аккуратно агитировать. Пусть смесь (теперь 2 мл) стоять в течение 10 мин. Держите на льду. Предполагая полную поверхность сопряжения, среднее количество связанного лиганда для микропузырьков составляет примерно 18 7600 лиганды / мкм 2.
  2. Восстановление нецелевого флаконов
    1. Заполните шприц с 1 мл физиологического раствора, удаляя все пузырьки воздуха. Прикрепление 21 G иглу, вводят раствор медленно в микропузырьков флаконе.
    2. Медленно снять поршень, удаление 1 мл воздуха, и извлеките иглу. Аккуратно агитировать. Дайте постоять 5 мин. Добавить еще 1 мл физиологического раствора, как описано выше. Аккуратно агитировать и дать постоять 10 мин на льду.
  3. Coulter подсчета
    1. Аккуратно агитировать нужный микропузырьков флакон и сделать ~50 мкл раствора в шприц емкостью 1 мл с использованием иглы 21 G. Вводите микропузырьков в пустую 2 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Пипетки 10 мкл образца раствора микропузырьков в 10 мл разбавителя.
    3. После осторожного перемешивания, оценки концентрации и размера распределения населения микропузырьков с помощью сошника счета (см перечень материалов). Граф минимум три 50 измерений мкл (в одном флаконе образца), используя 30 мкм диафрагмы.
  4. Подготовка Микропузырьки для инъекций
    ПРИМЕЧАНИЕ: помощник выполняет этот шаг, когда "инъекции микропузырьков в эмбрионы" (шаг 6) началось. Каждый эмбрион вводят один раз, в зависимости от типа микропузырьков выбраны для каждой инъекции, чтобы быть случайным образом выбирается с заместителем таким образом, что все виды микропузырьков равномерно распределены в течение всей процедуры, но, приведенной в случайном порядке. Убедитесь, хирург слеп к тип пузырька вводили.
    1. Определить йе объем фондового пузыря решения, необходимого для получения конечной концентрации 1 х 10 8 Мб / мл в объеме 400 мкл (рассчитать объем с помощью концентрации акций, измеренные в 5.3.3). Алиготе соответствующий объем физиологического раствора в пустую пробирку микроцентрифужных.
    2. Осторожно перемешивать выбранный микропузырьков пробирку и провести избыточного объема (~ 50 мкл, большую, чем рассчитано выше) раствора в 1 мл шприц с помощью иглы 21 G. Вводите микропузырьков в пустую пробирку микроцентрифужных.
    3. Внесите необходимый объем микропузырьков маточного раствора и добавить к аликвоты раствора. Смешайте осторожным перемешиванием с кончиком пипетки.
    4. Нарисуйте разбавленный микропузырьков раствор в чистый шприц, используя иглу 21 G. Снятие иглы, устранить любые воздушные пузырьки из шприца и прикрепите Луер и трубы. Медленно нажать решение конец трубки решений, чтобы не генерировать пузырьки воздуха.
    5. Вставьте СиринGE в шприц инфузионного насоса, установленного для выдачи микропузырьков со скоростью 20 мкл / мин при общем объеме 20 мкл. Приложить вытащил стеклянную иглу до конца трубки. Перемещение насоса ближе к стадии впрыска.

6. Введение микропузырьков в эмбрионы

  1. Случайно выбрать и удалить (с перфорированной ложкой) один эмбрион от охлажденной СМИ блюдо. Место в рассечение блюдо, расположенной на этапе ультразвукового под стереоскоп и удалить желточный мешок и амниотической мембраны с тонким пинцетом, резки / разрыв со стороны появившемся мере васкуляризированной (antimesometrial сторона). Это легко достигается путем прокалывания на территории, прилегающей к области головы.
    1. Вырезать достаточно, чтобы удалить эмбрион изнутри, но не более. Стабилизировать рассечение блюда, приготовленные из маленьких кусочков пластилина.
  2. Аккуратно маневрировать мешочек со всего эмбриона. Установите эмбриона на его стороне, с плацентой иСосуды пуповины впереди. Использование насекомых штифты, придавить желточный мешок (4 контакта рекомендуется) и на кромки плаценты, при необходимости, чтобы прикрепить на месте. Избегайте крупных сосудов.
  3. Вымойте эмбриона с подогретого 45 ° C PBS до эмбриона не приходит в себя. Определить пупочную вену и связанный с ним сосудистой сети. Расположите тарелку так, чтобы инъекция может быть сделано удобно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нагреве, кровь в эмбрионе потечет, явно накачке в артерии пуповины. Когда впервые начинает поток, вены будут ярко-красные, с кровью в оба судна быстро появляются идентичны. Ветви, вытекающие из пупочной вены обычно перекрывают те из пупочной артерии на поверхности плаценты.
  4. После того, как эмбрион возродился, покрыть его (но не плаценты) с предварительно нагретой США геля, будучи уверенным, деликатно удалить воздушные пузырьки (с использованием тонких щипцов) со всего эмбриона. Долить блюдо с подогретого PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за уровнем Solutiна в PBS и гель шприцы и добавить резервные шприцы отопительного стакане по мере необходимости.
  5. Установить стекло иглу на большой шар пластилина на краю рассечение блюдо и вставить конец иглы в PBS. Выбор вены на хорионический поверхности плаценты диска, как далеко от главной ветви, как разумно, обрезать кончик размера с помощью ножниц. Инъекции легче, если кончик разрезают под небольшим углом. Удалите все зубчатые края стекла, используя лезвие весенних ножницами.
  6. Использование шприца, медленно впрыскивают раствор микропузырьков при 20 мкл / мин в стеклянной иглы, пока весь воздух не будет исключен из кончика иглы и микропузырьки можно увидеть свободно течь в PBS. Остановите насос и сбросить за объемом впрыска от 20 мкл. Не впустить воздух сосудистой системы эмбриона во время инъекции.
  7. Вставьте кончик стекла иглы осторожно в один из вены в плаценте и убедиться, что он неподвижен. Качели прочь стерoscope головы и положение выше эмбриона преобразователь. Инициировать изображений.

7. УЗИ молекулярной визуализации

Примечание: Использование контрастных нелинейные условия формирования изображения, установленные ранее, положение датчика так, что эмбрион расположен равномерно между фокусами 6 и 10 мм. Однажды расположенные начать внутривенную инъекцию микропузырьков. При инъекции завершено, запустить таймер.

  1. Перфузии
    1. Убедитесь, что максимальное количество кадров для нелинейного режима контрастности выбрать, нажав кнопку "Управление исследование» и перейдите на вкладку «префов» в верхней части исследования браузере. Отметьте соответствующий квадрат в окне "Настройки".
    2. Настройте параметры обработки изображений, инициируя нелинейной изображений. Нажмите кнопку "Контраст Режим" на панели управления. Уточнить 2D усиления путем корректировки «усиление & #8217; набрать 30 дБ, снизить мощность до 4% с помощью «власть» циферблата, уменьшить частоту 1 Гц с помощью 'частоту' набора и установить ширину луча (левый нижний угол), чтобы широкое использование ролик мяч / мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все органы управления расположены на панели управления ультразвуковой системы.
    3. Захват всего мыть-ин и рассеивание микропузырька болюса с помощью записи кинопетли 20 мин при частоте кадров 1 Гц. Пресс-скан / замораживания, чтобы начать сбор данных.
    4. После того, как полная последовательность изображений была захвачена, нажмите кнопку "киношный Store ', расположенный на панели управления, чтобы сохранить последовательность изображений в системном буфере. Система создает дате метками кинопетли нелинейных данных контраст модели приобрели.
  2. Целевые Микросепаратор изображений
    1. В разделе "Prefs", установите время серийной съемки до 0,1 сек. Задайте соответствующие параметры изображения с помощью кнопок управления дезсываются выше (7.1.2.).
    2. Инициировать нелинейного изображений контрастности, нажав на кнопку "Контраст Режим" на панели управления. Обеспечить эмбрион правильно расположен под датчиком, и что поток микропузырьков контрастного вещества через эмбриона видна в нелинейном режиме контраст изображения.
    3. Для оценки целевой микропузырьков связывания на стадии эмбриона, исследования молекулярной визуализации, позволяют микропузырьки циркулировать в покое на 3 мин и 40 сек после завершения инъекции. Это время, чтобы сохранение оборотных микропузырьков. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы остановить изображений в течение этого времени.
    4. В 3 мин и 40 сек, резюме визуализации, чтобы подтвердить, что эмбрион еще видны, адекватно покрыты PBS, и что микропузырьки продолжают циркулировать. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать визуализацию.
    5. Приобретать последовательность нарушение / пополнения запасов 3 мин и 50 сек после инъекции с помощью записи 'пре-сового уничтоженияПоследовательность зации », акустический ответ, в 29 Гц. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать сбор данных. В 4 мин после инъекции 18,19, инициировать 0,1 сек высокочастотный акустический взрыв. Нажмите кнопку "всплеск" для реализации взрыв.
    6. Продолжайте записывать кадры для остальной части последовательности (до буфера линия не полностью) и сохраните кинопетли нажав на кнопку "киношный магазин».
    7. Соберите дополнительную кинопетли оборотных микропузырьков. Предполагается, что эта последующая последовательность изображений «пост-уничтожение", чтобы содержать только циркулирующие сигналы пузырь, который пополнили луч. Нажмите «Сканировать / заморозить", чтобы начать визуализацию и "киношный магазин" собрать изображения.
    8. Этикетка петли киношных после съемки каждого эмбриона. Нажмите 'Управление исследование ", выделите файл, используя ролик мяч и' выберите 'кнопки, нажмите' изображения этикетку 'и имя соответствующим образом.

8. Обработка эмбрионов после инъекции

  1. Сообщение изображения, перемещать преобразователь, открепить эмбрион и эвтаназии (с помощью декапитации, цервикальной дислокации, асфиксией диоксидом углерода, или анестезии с последующим быстрым замораживанием или фиксации), по желанию.
  2. Для каждого последующего введения эмбрионов свежие рассечение блюдо, игла, шприц и труб сегмент должен быть использован, с подготовкой следующей партии впрыска микропузырьков решение, происходящих во время вскрытия и возрождения.
  3. Сохранить образцы ткани (например, хвост, мозг) для дополнительных анализов (например, генотипирование определяется с помощью ПЦР анализа изолированной хвоста ДНК, окрашивания LacZ, или полу-количественные показатели экспрессии биомаркеров с помощью вестерн-блоттинга 21).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Инъекция ультразвуковых контрастных агентов в бывших маточно мышиных эмбрионов зависит от успешного выделения живых, в конце гестационного эмбрионов на стадии от матки и поддержание жизнеспособности в течение курса инъекций и связанной изображений ультразвука. После того, как эмбрион был выводили и расположены, как показано на рисунке 1, осторожно инъекции контрастного вещества в эмбриональной сосудистой возможно. Типичный ультразвука В-типа изображения эмбриона мыши E17.5 показано на ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ультразвуковые контрастные агенты вводили в поздней стадии эмбрионов беременность мыши и нелинейных контрастных изображений были приобретены для измерения параметров перфузии и целевых микропузырьков обязательными. Успешное изображений микропузырьков в пределах эмбрионального сосудистую зависит от ряда факторов, первый из которых жизнеспособности эмбриона. Все оборудование и устройства были подготовлены заранее, с тем чтобы свести к минимуму время, необходимое для выделения эмбрионов из матки до начала инъекции. Посколь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ф.С. Фостер признает свою роль в качестве консультанта компании VisualSonics Inc.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой Терри Фокса Национального института рака Канады.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagents
Antibodies (биотинилированные, eBioscience) — Выбор антител зависит от эксперимента
  • rat изотип IgG2 control
eBioscience13-4321-85Эта комбинация антител/микропузырьков часто требуется в качестве экспериментального контроля 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 антитела к эндоглину мышиIn house hybridomaВнешние антитела также могут быть подходящими: мы  использовали eBioscience (13-1051-85) в прошлом
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Среда с высоким содержанием глюкозы
SigmaD5796
  • 50 ml Фетальная бычья сыворотка
ATCC		30-2020lot #
7592456
  • Hepes
Gibco156305 мл, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco15140-1225 мл, 10,000 единиц Pen., 10,000 μ g Стрептококковый
этанол, 70%
Ледяной
параформальдегидСигма762404%
Фосфатный буферный физиологический раствор [1x] SigmaD85371x, без хлорида кальция и хлорида магния
Беременная мышь, CD-1Charles River Laboratories Inc. 
0,9% натрия хлорид (физиологический раствор)Hospira0409-7984-11
Ультразвуковое контрастное вещество, готовый к мишени и нецелевоймикромаркер; Компания VisualSonics Inc.
Гель для ультразвука (Aquasonic 100, бесцветный)CSP Medical133-1009
Equipment
Планшеты для культивирования клеток (4) :  100  х  20  mmFisher Scientific08-772-22
Планшеты для клеточных культур (12) : 60  х  15  ммSigmaD8054
ЦентрифугаSorvall Legend RT 
Конические тубы, 50 мл BD FalconVWR21008-938
РазбавительBeckman CoulterIsoton II Diluent, 8448011
Ножницы для рассечения (Wagner)Инструменты для тонкой наукиWagner 14068-12
Щипцы (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 мм)Щипцы для тонкой науки11200-33
, осколокVWR25601-134
Стеклянный стакан, 2 л (Griffin Beaker)VWR89000-216
Стеклянные капилляры, 1 x 90  мм GD-1 с нитьюнакала NarishigeGD-1
Съемник игл для стеклаNarishigePN-30
ПерчаткиAnsell4002
Брутто-анатомический щупFine Science Tools10088-15
Горячая плитаVWR89090-994
Ведро для льдаCole ParmerRK 06274-01
Imaging ПлатформаVisualSonics Inc.Интегрированная рельсовая система
Источник света, оптоволоконныйFisher Scientific12-562-36Идеально имеет регулируемые рычаги
Luers (12), полипропиленовые колючие женские ¼-28 UNF нитьCole Parmer45500-30
Микроультразвуковая система, высокочастотнаяVisualSonics Inc.Иглы Vevo2100
, 21 калибр  (1 дюйм)VWR305165
Анализатор размера частицBeckman CoulterMultisizer 3 Coulter Counter
Перфорированная ложка (Moria)Fine Science ToolsMC 17 10373-17
Штифты (6), черные анодированные детали 0,15 ммFine Science Tools26002-15
Пипетки [2-20 μ л, 20-200 μ л, 100-1,000 μ l]EppendorfResearch Plus  регулируемый 3120000038;             3120000054;            
Наконечники для пипеток [2-200  μ л, 50-1,000  μ l]EppendorfepT.I.P.S.                                    22491334;                        
Ножницы
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corning
Tubing, лаборатория Tygon 1/32" x 3/32"VWR63010-007
Деревянная палочка-аппликатор (тампон, ватная головка)VWRCA89031-270
Хирургический микроскоп 5-8X увеличениеFisher ScientificSteromaster
Шприцы, 1 мл NormjectFisher14-817-25
Шприцы (10), 30 млVWRCA64000-041
Шприцевой инфузионный насос Био-рысь NE-1000
Термометр, -20-110  ° CVWR89095-598
ТаймерVWR33501-418
Трубки, EppendorfVWR20170-577
Штативы для труб (3)VWR82024-462
Ультразвуковой преобразователь, 20 МГцVisualSonics Inc.MS250
Ваннас-Тюбинген, угловой вверхИнструменты для тонкой науки15005-08
3120000062022491351

Ссылки

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65(2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581(2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162(2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097(2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.