Инструменты редактирования генома, такие как система CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-ассоциированная), значительно повысили эффективность нацеливания на гены в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека (hiPSCs). В данной рукописи описан протокол генерации специфичного для линии репортера hiPSC с использованием гомологичной рекомбинации с помощью системы CRISPR/Cas.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективная генерация специфических для нокина репортеров hiPSC Neural Lineage с использованием системы CRISPR/Cas9 и Cas9 Double Nickase
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нацеливание на гены является критически важным подходом к характеристике функций генов в современных биомедицинских исследованиях. Тем не менее, эффективность нацеливания генов в клетках человека была низкой, что не позволяло генерировать человеческие клеточные линии с желаемой скоростью. За последние два года мы стали свидетелями быстрого прогресса в повышении эффективности генетических манипуляций с помощью инструментов редактирования генома, таких как система CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-ассоциированная). В данной рукописи описан протокол генерации репортеров индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC) с использованием гомологичной рекомбинации с помощью системы CRISPR/Cas. Описаны процедуры получения необходимых компонентов для построения нейронных репортерных линий с использованием системы CRISPR/Cas, ориентированной на построение векторов нацеливания и одиночных направляющих РНК. Этот протокол может быть расширен для создания платформы и коррекции мутаций в ИПСК
Введение
Система CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-ассоциированная), вместе с другими инструментами редактирования генома, произвела революцию в манипулировании геномом человека в последние годы1-7. Основными компонентами в системе CRISPR/Cas9 являются одиночная направляющая РНК (sgRNA) и Cas9. Cas9 представляет собой эндонуклеазу ДНК II типа, управляемую РНК. Он имеет два нуклеазных домена, HNH и RuvC, которые отвечают за создание двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) в определенной области генома рядом с протоспейсерным соседним мотивом (PAM)7-10. sgРНК выполняет комбинированную функцию crRNA и tracrRNA, двух молекул адаптивной иммунной РНК, идентифицированных у бактерий (таких как Streptococcus pyogenes) и архей для борьбы с вторжением ДНК из экзогенных источников9-11. При надлежащем дизайне и совместном введении в клетки млекопитающих, sgRNA распознает последовательность PAM, образует пары оснований с комплементарной цепью ДНК-мишени, а также направляет и трансактивирует Cas9 для расщепления обеих цепей ДНК непосредственно перед PAM7. Впоследствии для репарации DSB будет происходить гомологичная направленная рекомбинация (HDR, в присутствии вектора-мишени) или негомологичное соединение концов (NHEJ). Трансгены, такие как кДНК, репортерные кассеты или устойчивые к антибиотикам фрагменты, могут быть интегрированы, а также созданы трансгенные или нокиновые линии.
Хотя система CRISPR/Cas9 очень эффективна и относительно специфична, сообщалось о нежелательных нецелевых действиях12-15. Чтобы свести к минимуму нецелевые события, также были разработаны никазы Cas9 (Cas9n)9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A или Cas9 H840A) — фермент Cas9 с мутациями в одном из двух нуклеазных доменов, который вызывает разрыв только на одной цепи ДНК. Чтобы добиться расщепления на обеих цепях, две sgРНК предназначены для направления пары никаз, которая разрезается отдельно в соседних локусах двух разных нитей ДНК. Стратегия «двойного никинга» требует более строгого дизайна, чем обычная платформа Cas9, и предлагает как высокую эффективность, так и высокую специфичность для экспериментов по редактированию генов.
В этой рукописи описывается протокол создания репортера индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC) с использованием гомологичной рекомбинации с помощью системы CRISPR/Cas. Описаны этапы получения необходимых компонентов для создания нейронных репортерных линий с использованием опосредованного редактирования генома в системе CRISPR/Cas с акцентом на построение векторов-мишеней и sgРНК. Этот протокол был успешно повторен в нескольких линиях ИПСК, в том числе полученных от здоровых людей и пациентов с заболеваниями ЦНС. В нашей лаборатории нацелены следующие гены: OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 и SOD1. Эффективность нацеливания на систему CRISPR/Cas, опосредованная гомологичной рекомбинацией в ИПСК колеблется от 20 до 40%, что согласуется с предыдущими отчетами1,18,19. По сравнению с типичной эффективностью в 1-2% в обычных экспериментах по нацеливанию генов, эффективность нацеливания значительно повышается.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Дизайн и построение векторов для векторов таргетинга
- После определения маркера, специфичного для линии, найдите геномную последовательность гена и спроектируйте соответственно плечи гомологии. Длина плеча 5' гомологии составляет ~1 kb, а плеча 3' гомологии - ~1,5 kb (рис. 1).
- Пометьте репортерную кассету последовательно после геномной последовательности непосредственно перед стоп-кодоном путем субклонирования, чтобы эндогенная экспрессия не была изменена или нарушена. Свяжите репортер или двойную репортерную кассету (кассеты) с саморасщепляющимися пептидными последовательностями 2A (F2A, E2A или T2A) 20,21 или внутренним сайтом входа рибосомы (IRES).
Примечание: Репортеры могут включать флуоресцентные белки, такие как GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, люциферазу или кассету с устойчивостью к антибиотикам, комбинацию флуоресцентного белка и кассеты с устойчивостью к антибиотикам. На рисунке 1 показан пример построения вектора нацеливания для гена ALDH1L1 человека, помеченного EGFP и кассетой резистентности к неомицину. - Добавьте кассету с положительным выбором ниже по потоку от репортера. Положительный отбор представляет собой флоксированную устойчивую к антибиотикам кассету, которая будет вырезана из целевых ИПСК после того, как положительные клоны будут отобраны и выделены.
- Включите кассету с отрицательным выбором за пределами плеча 3'-гомологии. Распространенными кассетами отрицательного отбора являются тимидинкиназа, ТЗ и дифтерийный токсин А (ДТА) 22.
- Получить клон BAC человека, содержащий последовательность маркера линии, и верифицировать клон с помощью ПЦР-амплификации. Сконструируйте вектор нацеливания в pKD46, содержащем DH5α, используя рекомбинирование, чтобы стянуть вниз сайт нацеливания 23. При необходимости применяйте многосайтовый шлюз, стратегии Золотые ворота23,24.
2. Дизайн и векторное построение sgRNA для системы CRISPR/Cas9.
- Определите маркер, специфичный для родословной, на который будет нацелен репортер. Скопируйте последовательность кДНК из базы данных NCBI. Перейдите к поиску BLAT человека, чтобы получить выравнивание геномной ДНК.
- Нажмите на вкладку «браузер», чтобы просмотреть сборку гена. На вкладке «Просмотр» нажмите «ДНК», чтобы получить полную последовательность геномной ДНК в формате FASTA.
- Найдите стоп-кодон в последовательности ДНК, где будут помечены последовательность 2А и репортерная кассета.
- Поиск мотива, примыкающего к протоспейсеру (PAM, т.е. NGG) в пределах виничности (~100.о. фланкирующей области) стоп-кодона. Отсканируйте обе цепи, чтобы найти подходящую последовательность NGG. Учитывайте специфику восходящих последовательностей, чтобы избежать потенциальных нецелевых событий. Используйте инструменты с открытым исходным кодом, такие как BLAST и CasOT (подробнее см. Шаг 5).
- Скопируйте последовательность из 20 оснований непосредственно перед NGG и вставьте ее в инструмент веб-проектирования ZiFit для создания олигонов с выступами, совместимыми с вектором экспрессии человека-гРНК (с промотором U6) MLM3636.
- Синтезируйте как прямые, так и обратные олигонухи 7.
- Чтобы получить двухцепочечную sgРНК, денатурируйте оба олигопласта при 70 °C в течение 15 минут и постепенно охлаждайте до RT. Для реакции объемом 50 мкл добавьте 22,5 мкл прямого и обратного олигонотида (исходная концентрация 0,1 мМ) соответственно и 5 мкл буфера для отжига (100 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА, 1,5 М NaCl, pH 8,0).
- Смешайте и лигатируйте олигону, полученные на шаге 2.7, с BsmBI-расщепленным вектором экспрессии гРНК человека (с промотором U6) MLM3636. Для реакции объемом 20 мкл добавьте 1 мкл олигонукосов из стадии 2.7, 100 нг MLM3636 и 1 мкл (400 ЕД) Т4-лигазы. Инкубация при RT O/N.
- Трансформируйте компетентные клетки DH5α с помощью продукта лигирования с помощью теплового шока при 42°C в течение 30 сек. Выращивайте бактерии в планшете с агаром LB Ampicillin (100 мкг/мл) при 37°C O/N. Выберите 3 ~ 5 колоний для мини-подготовки плазмид в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование плазмидной ДНК для подтверждения с помощью коммерческих поставщиков. Maxiprep подбирает правильную плазмиду в соответствии с протоколом производителя.
- Оцените sgRNA с помощью анализа на эндонуклеазу T7 1 (T7E1) (подробнее см. Шаг 4). Трансфектный hiPSC с плазмидой и sgРНК будет экспрессироваться под встроенным промотором U6 в MLM3636 позвоночнике (подробнее см. шаг 6).
3. Проектирование и создание Cas9n Double Nickase sgRNA
- Получить двойную никазу Cas9n D10A вектор pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
- Разработайте пару прямых и обратных олигон для каждого локуса нацеливания. Скопируйте последовательность из 20 оснований непосредственно перед NGG, как описано в Шаге 2, и вставьте ее в инструмент веб-дизайна ZiFit
- Чтобы получить олигоносаменты со свесами, совместимыми с pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), удалите первое и последнее основание как прямых, так и обратных олигон, которые отображаются инструментом проектирования ZiFit.
- Синтез прямых и обратных олигон7. Назовите эти олигонуклеотиды как f(n)-F, f(n)-R для PAM на одной стороне целевого сайта, r(n)-F, r(n)-R для PAM на другой стороне целевого сайта. Из них n — это число для обозначения различных PAM, строчные f и r представляют расположение PAM либо на цепи смысла (f), либо на антисмысловой (r) цепи, F и R представляют прямые и обратные олигону.
- Протестируйте несколько пар (например, r5 и f2) с помощью анализа T7E1 (подробно описанного в шаге 4) для определения оптимизированной пары sgРНК, которые будут использоваться для Cas9n.
- Чтобы получить двухцепочечную sgРНК, денатурируйте оба олигопласта при 70 °C в течение 15 минут и постепенно охлаждайте до RT. Для реакции объемом 50 мкл добавьте 22,5 мкл прямого и обратного олигонотидов (исходная концентрация 0,1 мМ) соответственно и 5 мкл буфера для отжига (100 мМ Tris-HCl, 10 мМ ЭДТА, 1,5 М NaCl, pH 8,0).
- Смешайте и лигатируйте олигону, полученные на этапе 3.5, с расщепленным BbsI pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A). Для реакции объемом 20 мкл добавьте 1 мкл sgRNA из стадии 3.5, 100 нг Cas9n (D10A), 1 мкл (400 ЕД) Т4-лигазы. Инкубация при RT O/N.
- Трансформируйте компетентные клетки DH5α продуктом лигирования с помощью теплового шока при 42 °C в течение 30 сек. Вырастите бактерии в планшете с агаром LB Ampicillin (100 мкг/мл) при 37 °C O/N. Выберите 3 ~ 5 колоний для мини-подготовки плазмид в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование плазмидной ДНК для подтверждения с помощью коммерческих поставщиков. Maxiprep подбирает правильную плазмиду в соответствии с протоколом производителя.
- Оцените sgRNA с помощью анализа T7E1 (подробнее см. Шаг 4). Трансфектный hiPSC с плазмидой и sgРНК будет экспрессироваться под встроенным промотором U6 в каркасе Cas9n (D10A) (подробнее см. шаг 6).
4. Оценка sgРНК с помощью анализа T7 Endonuclease1 (T7E1)
- Для одного 24-луночного планшета, планшет 2 x 105 293FT ячеек на лунку за один день до этого (день -1).
- В день трансфекции (день 0) со-трансфектируют клетки 293FT с плазмидой sgRNA и вектором экспрессии Cas9. Добавьте 0,5 мкг вектора sgRNA, 0,5 мкг вектора экспрессии Cas9 JDS246 (Cas9-003) и 1,5 мкл Lipofectamine 2000.
- Для отрицательного контроля добавьте 0,5 мкг вектора экспрессии GFP (например, GFP, управляемого промотором ЦМВ в остове pcDNA3) вместо векторов sgRNA.
- Через 72 часа (день 3) соберите клетки, добавив 100 μл буфера для быстрой экстракции ДНК и энергично растирая.
- Инкубируйте смесь при температуре 68 °C в течение 15 минут, затем при 95 °C в течение 8 минут. Это шаблон для последующих ПЦР-экспериментов.
- Спроектируйте как прямые, так и обратные праймеры для ПЦР для амплификации последовательности, фланкирующей PAM. Обычно продукт ПЦР-нацеливания имеет длину около 400-500.о. Синтезируйте олигопласты7.
- Для проведения ПЦР-реакции объемом 50 мкл добавьте 1 мкл матрицы из Стадии 4.5, 0,5 мкл Herculase II, 0,5 мкл DMSO, 10 мкл 5x буфера, 0,5 мкл смеси dNTP и 1 мкл прямой и обратной смеси праймеров.
- Используйте следующие параметры ПЦР: 98 °C в течение 2 мин, 35 циклов по 98 °C в течение 20 сек, 59 °C в течение 20 сек, 72 °C в течение 1 мин, с окончательным продлением при 72 °C в течение 5 мин.
Примечание: Описанные здесь параметры ПЦР позволяют получить специфические продукты для нескольких тестируемых генов. Однако эти условия зависят от выбранных пользователем генов, которые представляют интерес. ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве матрицы часто требует оптимизации, чтобы гарантировать отсутствие дополнительных полос. Эти дополнительные полосы можно спутать с продуктами расщепления после анализа T7E1. - Измерьте концентрацию ДНК продуктов ПЦР с помощью спектрометра при температуре А260.
- Добавьте 400 нг продуктов ПЦР в 2 мкл буфера для сбраживания 2. Добавьте ddH2O в конечный реакционный объем 19 мкл. Выдерживать в кипящей воде 5 мин. Дайте реакции постоять на скамейке и естественным образом остыть до RT (45-60 минут).
- Добавьте 1 μл (10 единиц/μл) T7E1, инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин. Остановите реакцию, добавив 2 мкл 0,25 М ЭДТА, смешанного с 6x ДНК-загрузочным красителем.
- Растворите 2,5 г порошка агарозы в 100 мл 1xTAE. Разогрейте смесь в микроволновой печи и налейте гель на гелевую коробку. Когда образуется гель, загрузите всю реакцию 20 мкл до 2,5% агарозного геля. Запустите гель при 100-150 В в течение 30 минут.
- Осмотрите гель под воздействием ультрафиолета (Рисунок 3). T7E1 режет на несовпадающих участках. Для sgРНК, которые вызвали негомологичное соединение концов, продукты ПЦР будут показывать дополнительные быстро мигрирующие полосы (меньшие по размеру) по сравнению с отрицательным контролем (описанным в шаге 4.3).
- Оценка и ранжирование эффективности разрезания sgRNA и процента вставки и делеции (indel%) путем сравнения плотности полосы с помощью программного обеспечения Image J.
- Для каждого образца, который наносится на гель, обозначьте гелевые ленты как неразрезанную полосу, разрезанную полосу 1 и разрезанную полосу 2.
- Измерьте плотность каждого канала с помощью ImageJ в соответствии с руководством по программному обеспечению.
- Рассчитайте fcut по следующей формуле: fcut = (полоса разреза 1 + полоса разреза 2) / (неразрезанная полоса + полоса разреза 1 + полоса разреза 2)
- Рассчитайте Indel% по следующей формуле: Indel=1- √(1-f cut).
5. Прогнозирование in silico потенциальных нецелевых участков
Примечание: Потенциальные нецелевые сайты могут быть предсказаны с помощью онлайн-инструмента с открытым исходным кодом под названием CasOT17, который является программой на основе Perl.
- Для системы Windows загрузите программу CasOT и файлы базы данных генома человека на локальный жесткий диск.
- Подготовьте целевой файл спроектированной sgRNA в формате FASTA.
- Откройте файл с именем "casot". Появится командное окно. Пока оставим все как есть.
- Откройте файл с именем "opt-generator", чтобы сгенерировать строку опций. Вставьте путь и имя целевого файла в диалоговое окно опции "-t" или "-target".
- Вставьте путь к файлу последовательности генома в диалоговое окно опции "-g" или "-genome".
- Входные значения –s или –seed (значение по умолчанию 2) и –n или -nonseed (значение по умолчанию 255). Строка опций будет сгенерирована и появится в поле в верхней части страницы.
- Скопируйте строку параметров и вставьте ее в командное окно CasOT, описанное в шаге 5.3.
Примечание: Запуск программы CasOT может занять 30-90 минут в зависимости от опций и используемого компьютера. После завершения будет создана папка с именем «--». В папку будут включены два файла: файл ".stat" с описанием статистики и файл .csv (значения, разделенные запятыми) с подробными результатами поиска. - Откройте файл .csv с помощью программы для работы с электронными таблицами. В файле содержится следующая информация для каждого нецелевого сайта: хромосомное и геномное расположение, последовательность сайта, тип несоответствия (Mm), общее количество несовпадающих оснований и информация об экзонах, относящаяся к нецелевому сайту.
- Разработайте праймеры для ПЦР для сайтов, которые имеют <2 Мм в затравочной или незатравочной последовательности.
- Проводят ПЦР для выбранного положительного клона hiPSC в следующих условиях: 98 °C в течение 2 мин, 35 циклов по 98 °C в течение 20 сек, 59 °C в течение 20 сек, 72 °C в течение 1 мин, с окончательным продлением при 72 °C в течение 5 мин.
Примечание: Описанные здесь параметры ПЦР позволяют получить специфические продукты для нескольких генов, протестированных в нашей лаборатории. Однако эти условия зависят от выбранных пользователем генов, которые представляют интерес. ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве матрицы часто требует оптимизации, чтобы гарантировать отсутствие дополнительных полос. - Секвенирование продуктов ПЦР, согласование результатов секвенирования с предсказанными последовательностями и поиск мутаций. Если мутации существуют, то выявляются нецелевые события.
6. Электропорация иПСК для создания нейронных репортеров
- Культивирование гиПСК в среде TeSR-E8 на посуде с покрытием Geltrex. Смените среду на среду MEF-CM (кондиционированная среда эмбриональных фибробластов мыши) за два дня до электропорации. Инкубировать в 2 мл Аккутазы в течение 5 мин и собрать клетки.
- Электропорирование hiPSCs с линеаризовавшимся вектором нацеливания, вектором экспрессии Cas9-003 и вектором sgRNA с использованием следующих условий: 1 x 107 hiPSCs, ко-трансфект 2,5 мкг sgRNA, 2,5 мкг Cas9 и 50 мкг вектора нацеливания. Для стратегии двойной никазы добавьте 50 мкг вектора наведения, по 2,5 мкг каждой sgРНК (с коэкспрессией Cas9n вектором).
- Выберите клоны по положительным и отрицательным выборкам, как описано24,25.
- Идентификация положительных клонов с помощью анализа методом Саузерн-блоттинга или геномной ПЦР на большом расстоянии24,25.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Конструируют таргетные векторы со всеми необходимыми компонентами, включая плечи гомологии, репортерную кассету, а также кассеты для позитивного и негативного отбора (Рисунок 1). На основании эндогенного геномного локуса разрабатывают несколько (от 2 до 3) sgRNA (при использовании системы Cas9) или пар sgRNA (при использовании стратегии с двойной никазой Cas9n {D10A}) и встраивают их в остовы вектора экспрессии человеческих gRNA MLM3636 или pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) (Рисунок 2)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Нацеливание на гены является важным инструментом в определении характеристик функций генов. Однако относительно низкая эффективность требует трудоемкой и длительной работы. Недавнее развитие инструментов редактирования генома, таких как система CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-ассоциированная), значительно повысила эффективность нацеливания. В данной рукописи описан протокол генерации специфического для линии репортера индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC) с использованием...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Отделением нейрохирургии, Фондом Стамана Огилви Memorial Hermann Foundation, Центром инсульта Бентсена при Центре медицинских наук Техасского университета в Хьюстоне и Фондом Mission Connect TIRR.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | Центр генетического фонда коли, CGSC | 7634 | |
| Последовательность PGK-neo-bpA | Addgene | 13442 | |
| Клоны BAC человека генов-мишеней | |||
| JDS246 (Cas9-003), Streptococcus pyogenes, оптимизированный для кодонов млекопитающих, Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| MLM3636, Human-gRNA-ExpressionVector с промотором U6 | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 | |
| дизайн sgRNA, ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| инструмент прогнозирования нецелевых значений CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | ||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| гРНК Синтез праймера | Sigma | ||
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Компетентные клетки | Life Technologies | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 | |
| Ферменты рестрикции | NEB и Life Technologies | ||
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 | |
| Буфер для быстрой экстракции ДНК | Epicenter | QE0905T | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerases | Agilent Technologies | 600675 | |
| Буфер для пищеварения 2 | New England Biolab | ||
| 6X DNA Loading Dye | Thermo | Scientific R0611 | |
| TeSR-E8 Набор для поддержки hESC/hiPSC | Технологии стволовых клеток | 05940 | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 | |
| Essential 8 средний | Life Technologies | A1517001 | |
| Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер без кальция и магния | Life Technologies | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 с Glutamax | Life Technologies | 10565018 | |
| D-MEM с Glutamax | Life Technologies | 10566040 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота квалифицирована | Life Technologies | 10439 | |
| Замена сыворотки с нокаутом | Life Technologies | 10828010 | |
| 2-меркаптоэтанол 1000X | Life Technologies | 21985023 | |
| заменимые аминокислоты | Life Technologies | 11140050 | |
| Stempro Accutase | Life Technologies | A1110501 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| 0,25% раствор трипсина-ЭДТА | Life Technologies | 25200-056 | |
| Geltrex | Технологии жизни | 12760-013 | |
| Ингибитор ROCK Y-27632 | Millipore | Реагент SCM075 | |
| SMC4 | BD | 354357 | |
| устойчивый к неомицину MEF | Millipore | PMEF-NL | |
| Гигромицин устойчив к MEF | Millipore | PMEF-HL | |
| G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 | |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687010 | |
| FIAU (Фиалуридин, 1-2-дезокси-2-фтор-ß-D-арабинофуранозил-5-йодурацил | Moravek Biochemicals and Radiochemicals | Электропоратор M251 | |
| : генный генератор Xcell | Bio-Rad | ||
| 0,4 см электропорационная кювета | Bio-Rad | 165-2088 | |
| DIG-High prime prime ДНК стартовый набор II | Roche | 11585614910 | |
| Гибридизация денатурационное решение | VWR | 82021-478 | |
| Набор для синтеза зондов PCR DIG | Набор для | 11636090910 | |
| DIG | Roche | 11585762001 | |
| Антидигоксигенин (DIG-AP) | Система | ||
| CSPD | Roche | 11755633001 | |
| DIG Комплект промывочных и буферных блоков | Буфер Roche | 11585762001 | |
| 50X TAE | Life Technologies | 24710030 | |
| Буфер для блоттинга (25 мМ Трис pH 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1% Tween20) | |||
| Hoefer Ultraviolet Crosslinker | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| Спермидин | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7,5) | VWR | 200064-506 | |
| Denville Scientific синяя биопленка 8x10 | Fisher | nc9550782 | |
| Маркер молекулярной массы ДНК II ( меченый DIG ) | Roche | 11218590910 | |
| Amersham Blotting мембрана Hybond-N+ | Roche | 95038-400 | |
| Стеклянный сушильный поддон Pyrex | Fisher | 15-242A | |
| Kimberly-Clark C-fold бумажные полотенца | Fisher | 06-666-32B | |
| Ватман 3мм бумага (26X41) | Fisher | 05-713-336 | |
| Пакет для гибридизации | Roche | 11666649001 | |
| Гибридизационные трубы | Fisher | 13-247-300 | |
| Гибридизационный гриль Shake 'n' Stack | Фишер | HBMSOV14110 |
Ссылки
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
- Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
- Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
- Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
- Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
- Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
