Методическая статья

Loop-опосредованной изотермический амплификации (ЛАМП) Анализы на конкретные виды обнаружения

27.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52552

⸱

20 февраля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Pathogen Biology, Royal Veterinary College, London, 2BIOPHARM, Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs

В этой статье

Краткое содержание

Диагностика инфекции Eimeria у цыплят остается сложной. Подходы, основанные на морфологии паразитов и патологии хозяина, обычно неубедительны, в то время как молекулярные подходы, основанные на ПЦР, оказались требовательными по стоимости и опыту. Целью данного протокола является установление петлевой изотермической амплификации (LAMP) в качестве простой молекулярной диагностики эймериевой инфекции.

Аннотация

Паразиты вида Eimeria, простейшие, вызывающие кишечное заболевание кокцидиоз, представляют серьезную угрозу для производства и благополучия цыплят. При отсутствии эффективного контроля клинический кокцидиоз может быть разрушительным. Устойчивость к химиопрофилактическим средствам, часто используемым для борьбы с эймериями, является распространенным явлением, а субклиническая инфекция широко распространена, влияя на коэффициенты конверсии корма и восприимчивость к другим патогенам, таким как Clostridium perfringens. Несмотря на доступность инструментов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), диагностика эймерийной инфекции по-прежнему почти полностью опирается на традиционные подходы, такие как оценка поражения и морфология ооцисты, но ни то, ни другое не является простым. К ограничениям существующих молекулярных инструментов относятся потребность в специальном оборудовании и трудности с доступом к ДНК в качестве матрицы. В ответ на это был разработан простой протокол подготовки полевой ДНК и панель видоспецифичных анализов петлевой изотермической амплификации (LAMP) для семи эймерий, признанных инфицирующими курицу. Теперь мы предоставляем подробный протокол, описывающий подготовку геномной ДНК из кишечной ткани, собранной после смерти, с последующей настройкой и считыванием анализов LAMP. Видоспецифичный LAMP Eimeria может быть использован для мониторинга появления паразитов, оценки эффективности антикокцидийной стратегии фермы, а также для диагностики субклинической инфекции или клинического заболевания, что особенно ценно в условиях отсутствия экспертного надзора.

Введение

Мировое производство курятины увеличилось в десять раз за последние 50 лет с развивающимся миром хостинг почти в четыре раза расширение свидетелем в развитых странах мира (www.faostat.org) . Как Актуальность куриной продукции для мировой продовольственной безопасности вырос настолько, тоже имеет профиль патогенов, которые могут вызвать серьезные заболевания у кур. Одной из главных примером являются виды Eimeria, вездесущие простейших паразитов, которые могут вызвать в кишечнике кокцидиоз болезни 1. Везде, где куры выращиваются один или несколько видов Eimeria, вероятно, будут распространены 2-4. В развитых странах мира Eimeria, в первую очередь контролируется химиопрофилактики, используя трансфер и вращения программы, чтобы минимизировать воздействие сопротивления 5. Живые вакцины также используются в системах, где значение птица достаточно, чтобы оправдать затраты (например, племенной скот, слои и некоторые бройлеров 5). В RESUл этих мер клиническая кокцидиоз часто хорошо контролируемых, хотя субклинический инфекции является общим 5. В развивающихся странах вакцинации является редким и применение препарата часто менее информированы. Как следствие субклинических и клинических кокцидиоз чаще встречается и оказывает существенное экономическое влияние 3.

Диагностика eimerian инфекций традиционно полагались на поражения, забив посмертно, хотя даже авторы наиболее широко используемых скоринговой системы отметил, что для некоторых видов "кажется сомнительным, следует ли попытка такая процедура в любых, но умеренно тяжелой инфекции" 6. Дополнительное подтверждение может быть собрана с помощью микроскопического выявления экологически устойчивой стадии ооцист жизненного цикла в фекальных или подстилки образцов, хотя перекрытия морфологию можно смешивать все, кроме эксперта 6,7. Молекулярные альтернативы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), случайные amplificatioп полиморфных ДНК (ПЦР RAPD-ПЦР) и количественных технологий ПЦР были доступны до 20 лет 8-10, но на сегодняшний день они не смогли стать популярными. Относительная расходы и потребность в специализированной лаборатории оборудования или обработки ограничивают их использование, несмотря на часто субъективны и технически сложной природы старшего pathology- и микроскопия на основе подходов 10,11. Такие ограничения могут быть преувеличены во многих бедных регионах мира, таких как Юго-Восточной Азии, где воздействие кокцидиоза на бедность может быть пропорционально больше 12. В ответ есть явная потребность в новой проста и чувствительным, но экономически эффективной, Eimeria видов-специфические диагностические тесты.

Цикл опосредованного изотермический усиления (LAMP) является легко приготовить ДНК-полимеразы приводом техники, которое способно усиливать больших количеств ДНК. Самое главное, LAMP использует polymera Bst ДНКSE вместо полимеразной Taq ДНК, обычно используемые в ПЦР, что способствует амплификации ДНК в одной постоянной температуре без необходимости термоциклировании 13,14. Лампа может поддаваться на применение в даже самого элементарного лаборатории или в полевых условиях. Характеризуется относительной устойчивостью к многим ингибиторов ПЦР, высокой чувствительностью и специфичностью, лампа анализы были разработаны для широкого спектра патогенных микроорганизмов, включая вирус инфекционного бурсита, Clostridium Perfringens и Cryptosporidium 15-17. В ответ на спрос на новые экономичные Eimeria видов-специфической диагностики панель лампы анализов, специфичных для каждого из семи видов Eimeria, которые заражают цыплят была разработана 18. Заявки на участие в новых анализов включают в себя паразитов возникновение мониторинга, особое значение, учитывая объединение видов, таких как Eimeria максимумов или Eimeria necatrix с плохой экономической реrformance 3,4. Другие области применения включают оценки эффективности антикокцидальной стратегии фермы, диагностики субклинического инфекции или клинической картины заболевания и оценки риска, связанного с Егтепа на ферму.

Протокол

1. Шаблон Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Любой шаблон геномной ДНК предположительно содержат ДНК, полученной от одного из семи видов Eimeria, которые заражают цыплят может быть использован как шаблон для лампы на основе Eimeria видовой идентификации. Должны быть собраны образцы кишечной ткани для поля диагностического анализа в ходе планового вскрытия, как описано здесь.

  1. Выберите раздел (или разделы) кишечника для тестирования. В таблице 1 для руководства выборки сайта и видов Eimeria скорее всего, будет присутствовать 18 и Рисунок 1 для конкретного вида спектра распределения и местонахождения участков отбора проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это ключевое значение, поскольку Eimeria заметно хост конкретного участка. Каждый вид, который заражает кур определяется области кишечника, что он нацелен на 19. Решение может быть под влиянием предыдущего опыта фермы, заинтересованности в одном или МОRe конкретных видов Eimeria или других диагностических показателей 6.
  2. Акцизные 5 см или больше длины кишечника разделе (ями), выбранным для проверки Eimeria использованием стерильных ножниц или скальпелем. По желанию, хранить образцы для последующего анализа в фиксаторе, такие как, например, в RNAlater 18 или 95% этанола.
    Примечание: При хранении в этаноле пробы должны быть тщательно промывают в стерильной трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТЕ) буфера перед использованием.
  3. Сокращение образца открытый в продольном направлении, удалить содержимое самой кишечные (если они присутствуют) и очистить клетки от слоя слизистой свободный с использованием либо края стерильной стекло микроскопа или этанол / пламени стерилизовать ножниц лезвие. Дополнительно для объединенной выборки включают в себя клетки из всех четырех видов конкретных кишечных сайтов в одной пробирке.
  4. Поставьте Царапины материала в стерильную 1,5 мл с завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных, содержащей 100 мкл стерильной ТЕ-буфера в том числе 10% (вес / объем) Chelex 100 смолы.
  5. Встряхнуть каждый образец энергично в течение 1 мин. Убедитесь, что винт сверху плотно закрыта, а затем инкубируют в кипящей водяной бане в течение 10 мин.
  6. После кипячения каждый образец позволяют охладиться до температуры окружающей среды в течение 1-2 мин.
  7. Центрифуга каждого образца с помощью микроцентрифужную на максимальной скорости (например, ~ 10 000 XG) в течение 1 мин.
  8. Соберите 2 мкл полученного супернатанта быть шаблон в каждой лампы анализа должны быть предприняты. При желании, бассейн более одного кишечного сайт в одной пробирке, чтобы обеспечить мульти-сайт анализа в.

2. Eimeria ЛАМПА Грунтовка Подготовка (Pre-анализ)

  1. Подготовка Eimeria ЛАМПЫ праймеров запасы, достаточные для 100 анализов:
    1. Разведите каждый лиофилизированный Eimeria ЛАМПЫ грунтовки путем добавления воды молекулярно-биологического качества до концентрации 100 мкМ (как указано изготовителем). Если не указано, рассчитать объем молекулярно-биологического качества воды необходимо USINг физические и молекулярные массы каждого праймера.
    2. Внесите 60 мкл молекулярной класса воды в отдельную 0,5 мл флип-топ микроцентрифужных трубки для каждого вида Eimeria быть проанализированы.
    3. Добавить праймеры FIP, BIP, F3, В3, LF и LB специфичные для целевых видов Eimeria в воде с использованием объемы, указанные в таблице 2, создавая серию из семи видов специфических праймеров смесей.
    4. Кратко вихрь перемешать раствор праймера, то пульс микрофужную и заморозить, пока не требуется.
  2. Подготовьте реакции ЛАМПА Mastermix для каждого вида Eimeria быть проанализированы. Увеличить объемы приведены в таблице 3 по количеству образцов и добавить три к положительного контроля, отрицательного контроля и пипетирования запасных. Внести в 0,5 или 1,5 мл флип-топ микроцентрифужную трубку.

3. Eimeria ЛАМПА Анализ

  1. Внесите 23 мкл Eimeria видоспецифичными Bst ДНК-полимеразы / Лампа Mastermix в 0.5 мл микроцентрифужных трубки.
  2. Добавить шаблон ДНК 2 мкл (полученного в разделе 1), что делает конечный объем реакционной смеси 25 мкл.
  3. Добавить 2 мкл Eimeria видоспецифических геномной ДНК с одной реакции (положительный контроль). Добавить 2 мкл воды молекулярно-биологического качества реакции (отрицательный контроль).
    Примечание: Если видоспецифические геномной ДНК не доступен предыдущий положительный лампа или стандартный продукт ПЦР может быть использован вместо.
  4. Инкубируют на водяной бане или тепла блока на 62 ° С в течение 30 мин. Возможно, де-активировать полимеразы Bst ДНК при нагревании до 80 ° С в течение 10 мин, если реакция не будут читать сразу.

4. ЛАМПЫ Анализ Считывание

  1. По завершении инкубации оценить цвет каждой реакции глаз при комнатном освещении. Отрицательные результаты появляются розового до фиолетового цвета, положительные результаты появляются голубой 20.
  2. Возможно, подтвердить результат ЛАМПА анализа в лабораторнрии путем смешивания 5 мкл реакционной лампа продукт с 1 мкл ДНК из геля загрузочного буфера для электрофореза в агарозном геле с использованием 2% агарозном геле в 1 х Трис / борат / ЭДТА (КЭ) буфера, предварительно окрашенные с использованием пятно нуклеиновой кислоты (5 мкл на 50 мл агарозы). Добавить 5 мкл 1kB молекулярной лестнице размер ДНК переулок 1 геля, чтобы расчет размера фрагмента.

Результаты

Проверка Анализ

Во время проверки каждого Eimeria конкретным видам ЛАМПА анализ был протестирован с использованием панели чистых образцов ДНК, представляющих все семь видов Eimeria, которые заражают курицу, а также куриный геномной ДНК в качестве контроля хозяина. Электрофорез в агарозном геле был использован для решения каждого анализа и продемонстрировал абсолютную специфичность видового без каких-либо принимающей перекрестной реактивности 18. Далее, в десять раз сериях разбавления готовят с использованием очищенной Eimeria tenella геномной ДНК выявил предел чувствительности анализа от одного до десяти геномных копий 18. Нет верхний предел не был определен с положительными результатами, достигнутыми до и включая высшую концентрации (100000 копии генома) 18.

Применение с образцами полевых

Пробы, взятые для тестирования Eimeria, скорее всего, будут получены от кур найдены мертвыми, взятые как следствие рOOR здоровья или забито для дозорного эпиднадзора здоровья, указывая на вероятный размер выборки между одним и тремя, когда часть рутины. Тестирование трех птиц, собранных из бройлерной птицефабрики США в рамках программы надзора дали три набора кишечных образцов. Целевые применение на конкретные виды ЛАМПЫ анализов, определения приоритетов предпочтительные кишечных сайты для каждого вида Eimeria (таблица 1), позволил визуальную идентификацию eimerian инфекции во всех птиц протестированы с использованием hydroxynaphthol синий в качестве индикатора (рис 2а). Цвет достигается с помощью негативной реакции LAMP, при использовании hydroxynaphthol синий может варьироваться от фиолетового до розового, но всегда отличается от синего, достигнутого положительного результата. Подтверждение с помощью электрофореза в агарозном геле при условии, сопоставимые результаты (Фигура 2В). Во время нанесения поле пользователь может выбрать, применить весь экран против всех семи видов, или нацелены только на те виды приоритетными,важно или как известно, обращающимися на ферме или окрестности.

Отказ подходов на основе ПЦР укоренилось в качестве диагностических для возникновения Егтепа подчеркивает потребность в простоте в любом новом испытании. В то время как лампа предлагает простой подготовку и обработку, чем ПЦР, требование, чтобы проверить несколько кишечных сайтов на птицу, остается обескураживающим. Производство одной объединенной пробы ДНК на птицу, которая затем может быть проверена с одним или несколькими LAMP-анализах, вероятно, будет более привлекательным. Обработка один объединенного образца на одну птицу, представляющих материал, собранный из каждой из конкретных кишечных сайтов, указанных в таблице 1, и объединенные до получения ДНК, для тестирования всех семи LAMP-анализов при условии, что тот же результат, что и при каждом кишечного сайт был обработан отдельно (фиг.2 по сравнению с рис 3).

figure-results-1
Рисунок 1. Кишечные участков для обнаружения лампа видов паразитов Eimeria, которые заражают цыплят. В области тонкого кишечника, направленные на каждого вида Eimeria подсвечивается цветными линиями, с предпочтительными сайтов отбора проб, указанного числа между пунктирными черными линиями (E. acervulina: желтый / 1, Е. Брунетти: розовый / 2, Е. максимумы: синий / 3, Е. тШз: оранжевый / 4, Е. necatrix: красный / 5, Е. praecox: зеленый / 6 и E.tenella,: серый / 7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2. ЛАМПА диагноз eimerian инфекции сюдам три коммерческих бройлерных цыплят. ЛАМПЫ реакции разрешаются с помощью (A) hydroxynaphthol синий, где голубое небо реакция была положительной и фиолетового до розового реакция была отрицательной, и гель-электрофорез (B) агарозы. Кишечные сайты выборку были, как показано в таблице 1, для каждого паразита видов. = E. acervulina, B = E. Брунетти, Ма = E. максимумы, Ми = E. тШз, N = E. necatrix, P = E. praecox и T = E. tenella. Дорожка 1 содержится лестнице GeneRuler 1Kb ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3. ЛАМПА диагноз eimerian инфекции, с использованием объединенных пробах из трех отдельных коммерческих бройлерных цыплят. ЛАМПЫ Reacции разрешаются с помощью hydroxynaphthol синий, где голубое небо реакция была положительной и фиолетового до розового реакция была отрицательной. = E. acervulina, B = E. Брунетти, Ма = E. максимумы, Ми = E. тШз, N = E. necatrix, P = E. praecox и T = E. tenella. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Образец сайт Eimeria видов анализа (скорее всего)
Двенадцатиперстной кишки (D) E. acervulina, Е. praecox
Тощей кишки / подвздошной кишки * (Дж / I) E. максимумы, Е. necatrix
Придатков (С) E. necatrix, E.tenella,
Терминального отдела подвздошной кишки (TI) E. Брунетти, Е. тШз
Объединенные образцы (Р) E. acervulina, Е. Брунетти, Е. максимумы, Е. тШз, Е. necatrix, Е. praecox, E.tenella,

Таблица 1. Кишечные конкретного региона выбор видов тестов кандидат Eimeria. Выбор области для отбора проб изменяется для каждого вида Eimeria, как показано на фиг.1. Партии образцов включают в себя материал, собранный со всех четырех конкретных сайтов, которые затем были объединены для получения ДНК.

Грунтовка * Концентрация запасов (мкМ) Объем (мкл)
Вода - 60
Вперед Внутренний Primer (FIP) 100 40
Обратная Внутренняя PriМер (BIP) 100 40
Вперед Внешний Primer (F3) 100 10
Обратная Внешний Primer (B3) 100 10
Loop вперед (LF) 100 20
Loop назад (LB) 100 20
Общий 200

Таблица 2. Подготовка лампы грунтовки смеси. Компоненты и пропорции, необходимые для подготовки грунтовки премикс для лампы. Объемы приведены для 100 реакций лампы. * Грунтовка идентичности, как показано в материалах и Barkway и др (2011) 18.

Фото конц н Конечной реакционной конц н Объем на реакцию (мкл)
DDW - - 10,1
ThermoPol буфер 10 х 1 х 2,5
MgSO 4 100 мМ 2 мм 0,5
Грунтовка смесь * Таблица 2 2,5
дНТФ 25 мм 400 мкМ 0,4
Бетаин 5 M 1 М 5
Hydroxynaphthol синий 3 мм 120 мкМ 1
Полимеразной Bst ДНК 8000 ед / мл 8 U 1
Общий 23

Таблица 3. Получение LAMP реакция Mastermix. * Eimeria конкретным видам.

Обсуждение

Видоспецифичные анализы LAMP Eimeria , описанные в этой статье, предлагают новый набор диагностических инструментов для поддержки эффективной борьбы с кокцидиозом и заболеванием кокцидиозом. Последствия эймериевой инфекции могут включать в себя серьезные экономические потери, а также серьезную угрозу благополучию птиц и повышенную восприимчивость к колонизации зоонозными патогенами21. Возможности мониторинга стад на предмет появления некоторых или всех видов Eimeria могут обеспечить раннее предупреждение о снижении эффективности антикокцидийного контроля. К основным преимуществам LAMP относятся устойчивая мишенная специфичность, обусловленная требованием шести различных мишеней для последовательности ДНК, а также высокая чувствительность, усиленная включением петлевых праймеров13, хотя качественный, а не количественный характер LAMP можно считать ограничением. В настоящее время невозможно отличить низкоуровневый побег паразита от рутинной химиопрофилактики или репликацию живой вакцины от неконтролируемой репликации эймерий. Тем не менее, техническая простота протокола и окончательное считывание обеспечивают значительное улучшение по сравнению с существующими специализированными и часто субъективными подходами, основанными на патологии и морфологии6,7. Каждый анализ может быть выполнен по цене ~£0,75 за образец, независимо от затрат на рабочую силу и установку оборудования. Таким образом, анализы LAMP также более экономичны, чем другие молекулярные методы диагностики, такие как ПЦР, поскольку они требуют изотермической инкубации без необходимости использования специального оборудования.

В течение многих лет доступ к геномной ДНК Eimeria в качестве матрицы ограничивал развитие и применение молекулярной диагностики поля. Ооциста является наиболее легкодоступной фазой жизненного цикла эймерии, но для рутинной экстракции ДНК требуется лабораторноеоборудование22. Другие, более лабильные стадии жизненного цикла кишечника требуют очистки перед препарированием ДНК для предотвращения ингибирования ПЦР и последующей потери чувствительности23,24. Возможность экстракции эймериевой ДНК качества, подходящего для LAMP, с помощью оборудования, не более специализированного, чем микроцентрифуга и водяная баня, дополненная адсорбцией ингибитора с использованием хелексной смолы, в настоящее время способствует более широкому использованию молекулярной биологии в диагностике эймерий. Интересно, что сообщение об обнаружении количественно измеряемой с помощью ПЦР ДНК Eimeria в кишечной ткани через 20 дней после начала паразитарной инфекции, через 11 дней после последнего обнаруживаемого выхода ооцисты, позволяет предположить, что LAMP может быть использован для обнаружения разрешенного контакта с паразитами, а также продолжающейся инфекции, дажепосле того, как любые видимые повреждения могли быть устранены.

Относительно низкая стоимость и низкие технические требования к диагностике LAMP Eimeria могут способствовать ее применению в развивающихся странах, где другие, более устоявшиеся подходы могут быть недоступны или нецелесообразны. Для того чтобы это было применимо, каждый анализ должен быть способен обнаруживать все штаммы, которые могут циркулировать в каждом регионе. В то время как понимание генетического разнообразия, преобладающего среди видов Eimeria , ограничено26, использование целевых последовательностей, ранее валидированных для использования в количественной ПЦР со штаммами из Африки, Азии, Европы и Южной Америки, дает некоторые доказательства сохранения, подтверждающие полезность этих анализов LAMP во всеммире10.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа, проведенная в этом исследовании, была частично поддержана Королевским ветеринарным колледжем через фонд студенческих исследовательских проектов, а также Исследовательским советом по биотехнологии и биологическим наукам и Департаментом международного развития (номер гранта BB/H009337/2). Данной рукописи присвоен PPB_00795 РВК.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RNAlaterAmbionAM7024
ЭтанолVWR Chemicals20821.321Осторожно, легковоспламеняющийся
100 x Tris-EDTA (TE) буферный концентратSigma-AldrichT9285
Chelex 100 смолаBio-Rad142-1253
Молекулярный водныйInvitrogen10977035
E. acervulina F3Sigma-AldrichVC00021*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC
E. acervulina B3Sigma-AldrichVC00021*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG
E. acervulina FIPSigma-AldrichVC00021* AGAGCACAGTGGCAGTGCC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT
E. acervulina BIPSigma-AldrichVC00021* GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTACCGGGG
E. acervulina LBSigma-AldrichVC00021*TAAGGTTACACCCGTGGAGG
E. acervulina LFSigma-AldrichVC00021*GCCATGCACAAAGCGACTT
E. brunetti F3Sigma-AldrichVC00021*GGCCATCAAGTTCCATGAGC
E. brunetti B3Sigma-AldrichVC00021*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT
E. brunettiFIP Sigma-AldrichVC00021* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTAGAGCGTT
E. brunetti BIPSigma-AldrichVC00021*TACTTCCTAGGATCCATCCGC-AGTTTCGCTGCCCCTCTCTC
E. brunetti LBSigma-AldrichVC00021*GAAACGCTCGAACATGGC
E. brunetti LFSigma-AldrichVC00021*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT
E. maxima F3Sigma-AldrichVC00021* ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT
E. maxima B3Sigma-AldrichVC00021*CCTTCCTCCCTTGAAAACTG
E. maxima FIPSigma-AldrichVC00021*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA
AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG
E. maxima BIPSigma-AldrichVC00021*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGGTGTGTGTA
E. maxima LBSigma-AldrichVC00021* CAAGCCTACGCGGACATC
E. maxima LFSigma-AldrichVC00021* TTATGCAGCTGGGTCAACG
E. mitis F3Sigma-AldrichVC00021* ACGATAGCCAAGACACGTAAGG
E. mitis B3Sigma-AldrichVC00021*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA
E. mitis FIPSigma-AldrichVC00021*CGCGGGTCGTGAGATTAAATT
AT-GGAAGATCAGGACGGGGCACT
E. mitis BIPSigma-AldrichVC00021*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA
GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG
E. mitis LBSigma-AldrichVC00021*TCCATGCATCCCCTTTTT
E. mitis LFSigma-AldrichVC00021*CGTGGGCACAGATTGATTC
E. necatrix F3Sigma-AldrichVC00021*TGGCTTTCCCGCGTACC
E. necatrix B3Sigma-AldrichVC00021*CGGCCCAACAAAGACTG
E. necatrix FIPSigma-AldrichVC00021*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA
CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA
E. necatrix BIPSigma-AldrichVC00021*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC
E. necatrix LBSigma-AldrichVC00021*GTCTGTaacttgggacgtgt
E. necatrix LFSigma-AldrichVC00021*GAACAGCCGGAGCCTCTC
E. praecox F3Sigma-AldrichVC00021*GCCCTTGTATGTGTTGCTTTCTCTCTCTCTCTCT
E. praecox B3Sigma-AldrichVC00021*GCGCACGAATCTGAATGAATCACAC
E. praecox FIPSigma-AldrichVC00021*ATCTCCTCAAAAGACTTTCGCGT
A-GCGCTTGGCTATATCATGG
E. praecox BIPSigma-AldrichVC00021*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT
E. praecox LBSigma-AldrichVC00021*GAATAGCATTGCCAGGTGG
E. praecox LFSigma-AldrichVC00021*GTCCACTGTCATTAATATTGC
TGC
E. tenella F3Sigma-AldrichVC00021*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG
E. tenella B3Sigma-AldrichVC00021* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT
E. tenella FIPSigma-AldrichVC00021*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC
AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT
E. tenella BIPSigma-AldrichVC00021*GTTTGGCCCGAAAGTTGAA
GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT
E. tenella LBSigma-AldrichVC00021*CGCATGTGCAGTTGAAGACA
E. tenella LFSigma-AldrichVC00021*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA
TTAACAAG
10 x ThermoPol реакционный буферNew England BiolabsB9004S
MgSO4Sigma-AldrichM7506
dNTPsPromegaU1330
Раствор бетаина (5 M)Sigma-AldrichB0300
Bst полимеразаNew England BiolabsM0275S
Гидроксинафтол синийSigma-Aldrich33936Растворен в молекулярной воде.
UltraPure agaroseInvitrogen16500-500
10 x Трис/Борат/ЭДТА (КЭ) буферInvitrogenAM9863
Синий/Оранжевый ДНК-загрузочный краситель (x6)PromegaG1881
GeneRuler 1Kb ДНК-лестницаThermo ScientificSM0313
SafeView краситель нуклеиновых кислотNBS BiologicalsNBS-SV

Ссылки

  1. Chapman, H. D., et al. A selective review of advances in coccidiosis research. Adv Parasitol. 83, 93-171 (2013).
  2. Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination. Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).
  3. Fornace, K. M., et al. Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability. PLoS ONE. 8 (12), e84254(2013).
  4. Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. Genomic analysis of Eimeria spp. populations in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina. J Parasitol. 95 (4), 871-880 (2009).
  5. Peek, H. W., Landman, W. J. Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other prevention strategies. Vet Q. 31 (3), 143-161 (2011).
  6. Johnson, J., Reid, W. M. Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp Parasitol. 28 (1), 30-36 (1970).
  7. Haug, A., Gjevre, A. G., Skjerve, E., Kaldhusdal, M. A survey of the economic impact of subclinical Eimeria infections in broiler chickens in Norway. Avian Pathol. 37 (3), 333-341 (2008).
  8. Procunier, J., Fernando, M., Barta, J. Species and strain differentiation of Eimeria spp. of the domestic fowl using DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers. Parasitology Research. 79 (2), 98-102 (1993).
  9. Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Mattsson, J. G., Tomley, F. M., Shirley, M. W. Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken. Avian Pathol. 27 (5), 490-497 (1998).
  10. Vrba, V., Blake, D. P., Poplstein, M. Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken. Vet Parasitol. 174 (3-4), 183-190 (2010).
  11. Morris, G. M., Gasser, R. B. Biotechnological advances in the diagnosis of avian coccidiosis and the analysis of genetic variation in Eimeria. Biotechnol Adv. 24 (6), 590-603 (2006).
  12. Perry, B., Randolph, T., McDermott, J., Sones, K., Thornton, P. Investing in animal health research to alleviate poverty. , ILRI (International Livestock Research Institute). Nairobi, Kenya. (2002).
  13. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers). Mol Cell Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), E63(2000).
  15. Kaneko, I., et al. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7526-7532 (2011).
  16. Karanis, P., et al. Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection of cryptosporidium oocysts in fecal and water samples. Appl Environ Microbiol. 73 (17), 5660-5662 (2007).
  17. Xue, C., et al. Rapid detection of Infectious bursal disease virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. J Vet Diagn Invest. 21 (6), 841-843 (2009).
  18. Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. BMC Vet Res. 7 (1), 67(2011).
  19. Long, P., Joyner, L., Millard, B., Norton, C. A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria Latina. 6 (3), 201-217 (1976).
  20. Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. BioTechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
  21. Arakawa, A., Baba, E., Fukata, T. Eimeria tenella infection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens. Poult Sci. 60 (10), 2203-2209 (1981).
  22. Blake, D. P., Smith, A. L., Shirley, M. W. Amplified fragment length polymorphism analyses of Eimeria spp.: an improved process for genetic studies of recombinant parasites. Parasitol Res. 90 (6), 473-475 (2003).
  23. Lund, M., Nordentoft, S., Pedersen, K., Madsen, M. Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR. J Clin Microbiol. 42 (11), 5125-5132 (2004).
  24. Raj, G. D., et al. Real-time PCR-based quantification of Eimeria genomes: a method to outweigh underestimation of genome numbers due to PCR inhibition. Avian Pathol. 42 (4), 304-308 (2013).
  25. Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W., Smith, A. L. Eimeria maxima: the influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR. Int J Parasitol. 36 (1), 97-105 (2006).
  26. Beck, H. P., et al. Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites. Int J Parasitol. 39 (2), 175-189 (2009).

Перепечатки и разрешения

Теги

Eimeria
Loop-опосредованной изотермический амплификации (ЛАМП) Анализы на конкретные виды обнаружения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.