Мышь проводная бедренной артерии травмы модель рестеноза является технически сложной задачей. В этом протоколе мы показываем основные технические детали необходимы для успешного выполнения травму проволоки, чтобы вызвать последовательную неоинтима для исследований рестеноза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышиной модели артериальный рестеноз: Технические аспекты бедренной Wire травмы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сердечно-сосудистые заболевания, вызванные атеросклерозом является ведущей причиной смерти в развитых странах мира. Сужение просвета сосуда, в связи с развитием атеросклеротической бляшки или разрыву установленных бляшек, прерывает нормальный поток крови, ведущий к различных заболеваний, таких как инфаркт миокарда и инсульт. В клинике эндоваскулярных процедур, таких как ангиопластика, как правило, выполняется возобновить просвет. Тем не менее, эти процедуры неизбежно к повреждению стенки сосуда, а также эндотелий сосудов, вызывая чрезмерную реакцию заживления и развитие неоинтимальной налета, который простирается в просвете, вызывающих сосудов рестеноза (повторного сужения). Рестеноз остается основной причиной выхода из строя эндоваскулярного лечения атеросклероза. Таким образом, на доклинических моделях животных рестеноза имеют жизненно важное значение для исследования патофизиологических механизмов, а также поступательное подходы к сосудистых вмешательств. Среди нескольких мышей experimental модели, травмы провод бедренной артерии широко применяется в качестве наиболее подходящей для исследования после ангиопластики рестеноза, потому что это напоминает процедуру ангиопластики, что повреждает как эндотелий и стенку сосуда. Тем не менее, многие исследователи испытывают трудности с использованием этой модели из-за его высокой степенью технической сложности. Это в первую очередь потому, что металлический провод должен быть вставлен в бедренную артерию, что примерно в три раза тоньше, чем проволоки, чтобы произвести достаточное, чтобы вызвать повреждение заметную неоинтимы. Здесь мы опишем основные хирургические детали эффективно преодолеть основные технические трудности этой модели. Следуя представленные процедур, выполняя травмы провод бедренной артерии мыши становится легче. После того, как ознакомился, вся процедура может быть завершена в течение 20 мин.
Введение
В эпоху расширенного применения эндоваскулярных методов лечения различных сердечно-сосудистых заболеваний, рестеноз после ангиопластики является одной из основных проблем для пациентов, проходящих такое лечение. Повреждение эндотелия сосудов в момент ангиопластики, в сочетании с атеросклеротическим фоном, вызывает чрезмерную пролиферацию гладкомышечных клеток в медиальном слое, что приводит к неоинтимальной гиперплазии. 1,2 Жизнеспособная животная модель, которая повторяет гиперплазию неоинтимы после ангиопластики, таким образом, важна не только для исследования механизмов заболевания, но и для разработки эффективных терапевтических средств для лечения этой патологии.
Мыши представляют собой отличное модельное животное для повторения неоинтимальной гиперплазии по следующим причинам: генетический фон экспериментальных мышей хорошо установлен; доступно большое разнообразие генетически модифицированных штаммов; 2 найти однопометников с одинаковым бэкграундом легко; А стоимость животных относительно невысока. Модель артериального лигирования и модель травмы спицей являются двумя наиболее распространенными моделями механически индуцированной гиперплазии неоинтимы у мышей. Модель перевязки артерий легко создать, но она физиологически не похожа на саму процедуру ангиопластики. Модель травмы проволокой близко имитирует реальные процедуры ангиопластики, но технически сложна из-за небольшого размера артерий мыши. 2,3 Sata et al. впервые описали метод повреждения бедренных артерий мышей проволокой, основанный на анатомической структуре сосудистой сети и использовании гибкой проволоки соответствующего размера. Используя эту технику, им удалось воспроизводимо индуцировать неоинтимальную гиперплазию у различных линий мышей. 4
Хотя травма бедренной проволоки является хорошо зарекомендовавшей себя моделью, некоторые технические аспекты этой техники очень сложны по сравнению с другими моделями, такими как лигирование. 5 Целью данной статьи является подробное описание наших процедур моделирования травм мышиной проволокой, которая является модифицированной версией оригинального метода Саты. Мы внесли две основные модификации: 1) Петля только артерий, и 2) Отсутствие использования лидокаина.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
О себе Этика:: Примечание Все процедуры соответствуют Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (Пресс национальных академий, 8-е издание, 2011), и протоколы, утвержденной Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в университете штата Висконсин. Все операции проводились под ИФ анестезии (через вдыхание, скорость потока 2 мл / мин), и все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания. Животные были умерщвлены в камере постепенно наполняется CO 2.
1. Индукция общей анестезии и разрез кожи
- Использование самцов C57BL / 6 мышей в возрасте 12-16 недель и весом 23-28 г. Обезболить животное по изофлуран через аппарат анестезии замкнутой. Подтвердите надлежащего обезболивания, зажимая его палец. Нанесите небольшое количество искусственных слез мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- Наведите в положении лежа на спине с левой задней конечности слегка похищенного и коленного сустава SLightly согнуты. Бритье волос вокруг левой верхней части бедра и дезинфицировать кожу хлоргексидином, применяется три раза, используя стерильные ватные наконечником аппликаторы. Используйте горячую шарик стерилизатор держать инструменты стерилизуются во время операции.
- Поместите стерильную марлевую салфетку над левой ноги. Сделайте 1,5 см прямо, продольный разрез кожи на левой медиальной бедра от коленного сустава до паха (рис 1А).
2. Воздействие на бедренной артерии и Филиалов
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1В показывает валовую сосудистой анатомии в верхней части бедра. Поверхностной бедренной артерии (SFA) может наблюдаться через вскрытии микроскопом при разрез кожи правильно сделаны вдоль средней линии медиальной бедра.
- Откройте тонкий фасции, покрывающий SFA с мелкими пинцетом, а затем цикл SFA с 9-0 нейлоновой нити.
Примечание: В этом процессе, бедренный нерв легко поместить вязь, но рядом бедренную вену требует пристального внимания, так как его стены настолько тонкие, что это легко пефорирует и кровоточит. Ключевой прием, чтобы сосредоточиться на самой артерии; при условии, что рассечение осуществляется близко к артерии, любое случайное повреждение вены можно предотвратить. - После того, как SFA оборачивается, удерживая нить с москитной пинцетом и вытащить его немного вниз. Этот маневр делает возможным дальнейшее рассечение проще, но, чтобы избежать повреждения артерии не тяните слишком сильно.
- Продолжить рассекает артерию проксимально, чтобы разоблачить и петля общей бедренной артерии (CFA) с 9-0 нейлоновой нити.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, петлю CFA в точке дистальнее эпигастральной артерии (рис 1B) достаточно для вставки провода. Держите шов петля CFA с москитной щипцов таким же образом. - Потяните шва петлю CFA вверх и шов петля SFA вниз, чтобы раскрыть бифуркации ОТВС и глубокой бедренной артерии (DFA). DFA, важнейшая отрасль ЦФО,идет к мышцы бедра (Фиг.1В).
ПРИМЕЧАНИЕ: провод будет вставлено с DFA позже. - Loop DFA с максимальной осторожностью, потому что рядом жила запуталась под артерии. В случае кровотечения из вены, от 30 до 60 сек простое сжатие марлей, как правило, достаточно для получения гемостаза.
- После того, как DFA оборачивается с 9-0 нейлоновой нити, убедитесь, что все три петли шовные находятся на правильных позициях (рис 2а).
- Продолжайте рассечения DFA дистальнее перевязывать артерию в точке, насколько это возможно, от бифуркации. Сокращение дополнительный шов, но оставить определенную длину, так что два конца могут быть проведены с москитной щипцов, которые стабилизируют DFA делает вставку проволоки легче.
3. Создание провода Травмы
- Вставьте провод с помощью DFA
- Процедить швы CFA, SFA, и DFA для установления временного кровоостанавливающего.
- Сделайте небольшое отверстие в DFС microscissors. Вставьте кончики изогнутых microtweezers, чтобы расширить отверстие, достаточно большое для провода с диаметром 0,015 дюйма (2В демонстрирует разницу в размерах между артерией и провода).
- Прежде чем сделать отверстие в DFA, ослабьте шовный цикл CFA и аккуратно зажать / сжать DFA несколько раз скучных наконечником microtweezers. Этот маневр расширяет диаметр артерий замечательно, чтобы облегчить вставление провода. Увлажнение провод тщательно PBS также важно для гладкой вставки.
- При сверлении отверстия в DFA, не обрезать артериальной стенки, но сделать небольшой V-образный зазор и щепотку клапан с острыми наконечниками microtweezers для манипуляций.
- Вставьте провод через адекватно-дилатационной отверстие на DFA. Аккуратно продвижения провод к подвздошной артерии при ослаблении шва петлю вокруг CFA. 5-8 мм достаточно, чтобы покрыть всю длину CFA в большинстве случаев (фиг.2С ). Не вставляйте провод сильно, как артериальная перфорация, как правило, приводит к потере мыши. Сокращение провод до 15-мм в длину помогает с обработкой.
- Оставьте провода внутри в течение 1 мин
- После установки этого провод к оптимальной длины, оставьте его в течение 1 мин затягивать артериальной стенки. Смочите провод и артерии с PBS, чтобы предотвратить высыхание. Еще 9-0 нейлон шовный могут быть размещены вокруг DFA, приближенную к точке проволоки вставки в это время ожидания. Это шов будет использоваться в дальнейшем, чтобы закрыть отверстие на DFA после удаления провода.
- Получить провода и резюме кровотока
- Держите провод с судна катетеризации щипцов, и вытащить его обратно аккуратно; Провод должен быть восстановлен гладко. Чтобы преодолеть любое сопротивление, как правило, вызваны приверженности провода к артериальной стенки, потянув на себя провод с легким вращением полезно. Опять же, сильный прием может привести к потере животных.
- осле извлечения проволоки, лигирования DFA в точке бифуркации с 9-0 нейлоновой нити. Не перевязывать слишком близко к развилке, которая может поставить под угрозу оттока крови к SFA.
- Ослабить шовные петли SFA и КФА возобновить нормальный кровоток. Обратите внимание, что CFA хорошо расширена за счет вставки провода (рис 2D).
4. Кожа Закрытие и Послеоперационный период
- Управление кровоточит. Малой сочилась может быть остановлен путем простого сжатия; некоторые крупные артериальные кровотечения потребует стежками 11-0 нейлона шва в. Эти пришиваются артерии, в конечном счете привести к артериальной окклюзии.
- Закрыть кожной раны с степлеры кожи (обычно 3-4 скобы). Держать рану площадь стерилизовать путем применения хирургического решения хлоргексидина.
- Применить послеоперационных процедур. Контролировать боль мыши с подкожными инъекциями бупренорфина. Держите мышь на потепление площадку, пока он не пришел в Sufциента сознание поддерживать грудины лежачее положение. Дом его в чистом клетке без компании других животных, пока полностью выздоровел.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Четыре недели после операции, урожай провода повредил бедренную артерию и сделать парафинового блока образца проанализировать формирование неоинтимы. Общей анестезии, как описано выше. Немедленно откройте сундук и вставить 20 калибра бабочки иглу в левый желудочек. Подключите линию в инфузии бутылки. Выполните перфузии фиксации с помощью капельного вливания PBS с последующим 4% параформальдегида (обычно 10-20 мл, каждый). Бутылка вливания помещают приблизительно 140 см выше уровня сердца таким образом, что живо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Процедура травмы провод применимо ко всем линий мышей, пока их анатомические структуры похожи. 4 В этой работе, мы использовали самцов мышей C57BL / 6 мышей в возрасте 12-16 недель. Как мы узнали от наших предварительных исследований, бедренные артерии мышей моложе 10 недель, часто настолько мала, что установка проволоки довольно сложно. С другой стороны, вставка проволоки у мышей в возрасте старше 16 недель технически проще, но, как правило, приводит к дополнительной переменной гиперплазии неоинтимы. Самок м...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана премией нового исследователя Висконсинской партнерской программы (ID 2832), грантом R01 Национального института сердца, легких, крови (HL-068673) и грантом на обучение T32 (HL-110853). Мы благодарим группу доктора Мелины Киббе в Северо-Западном университете за предоставленную полезную информацию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Направляющая проволоки с фиксированным сердечником | Cook | G02426 | Диаметр 0,015 дюйма, прямые |
| дилатационные щипцы | Roboz | RS-4927 | Изогнутые, тупые кончики |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Прямые, острые кончики |
| Dumont Сосуд Канюляционные щипцы | World Precision Instruments | 503373 | |
| ножницы McPherson-Vannas | World Precision Instruments | 501234 | |
| Москитные щипцы | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Нейлоновый шов 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Черная нейлоновая мононить |
| Micro AROSuture, стерильная 11-0, 70 микрометров, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, черная нейлоновая мононить |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Степлер | 3М | ДС-25 |
Ссылки
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Повреждение бедренной артерии проволокойбедренная артерия мышиповреждение сосудистого эндотелияформирование неоинтимальной бляшкианализ гиперплазии интимыметодика введения проволокиперерастяжение стенки артериисоздание петли глубокой бедренной артерииforceps для канюляции сосудовокрашивание гематоксилином и эозином
