Дизайн, обработка поверхности, сотовая Покрытие и культивированию модульных нейронных сетей, состоящих из Функционально взаимосвязанных схем

Экспериментальные и теоретические доказательства подтверждают возможность, что мозг работает на основе скоординированных активации клеточных ансамблей ^1-5, которые можно рассматривать как динамические функциональных блоков, которые временно взаимодействуют друг с другом, формирования и основных разных состояний мозга. Функциональный модульность также зависит от и связанные со структурной модульной организации цепей мозга ^6,7. Как функция и структура цепей мозга взаимно формировать друг друга прежнему является одним из основных нерешенных вопросов в области неврологии. Чтобы обеспечить более глубокое понимание этого вопроса, важно определить оптимальные экспериментальные основы, где можно обратиться, по крайней мере, частично, эти вопросы. С контролем манипуляции с пространственно-временной динамики нейронных сетей в экспериментах in vivo с является сложной задачей, разработка моделей в пробирке нейронных сетей представляет значительный интерес в связи с их легкой соотвessibility, мониторинг, манипулирование и моделирования ^8,9. В последние годы, в пробирке технологий, поддерживаемых передовых методов субстрат паттерна позволили вызвать нейронных сетей для разработки ряда предопределенных модульных конструкций ³ и изучать функциональные свойства сетей с введенных топологий ^10. В частности, методы были недавно использованы для организации сетей путем введения физические ограничения ^4,11. В самом деле, изучить связь между структурой и функцией в нейронных сетях и обеспечить упрощенное, но правдоподобное представление взаимодействия нейронов сборки системы, в пробирке должна обеспечивать взаимосвязанных нейронов субпопуляции. Широко изучается 2D однородные нейронные культуры не накладывает каких-либо пространственных ограничений на самоорганизации выходящего проводов цепей. Поэтому возможный подход к формированию узлов искусственно соединенных между собой клеток является положение различных популяции нейронов в ссоруially различных областях. Расстояние между этих областях не мешает Интер сборок соединения. Этот подход, в то время обеспечивая значительный контроль над сложность сети, как было показано, обеспечивает богатый репертуар моделей синхронизации ^6,7,12.

Для того, чтобы облегчить воспроизводимый культивирование модульных нейронных узлов, протокол, чтобы собрать самоорганизацию сетей в нейронных кластеров, связанных аксонов и дендритов представлены и описаны. Полимерной структуры для физического удержания нейрональных культур был создан из polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS является эластомер широко используется для биомедицинских применений благодаря своей биосовместимости, прозрачности и проницаемости для газов ^13. PDMS подготовлен и исключены из микромеханического SU8 2075 ^14,15 структуры спин-покрытия жидкие PDMS на "хозяина", как описано ранее в Джекман и др. ¹⁶ TОн достиг рисунком нейронных сетей состоят из взаимосвязанных модулей разного размера, и они были успешно получены на обоих стеклах и микро матриц электродов (МПС) ^17-20. Плотность соединений между модулями может изменить характеристики сетевой синхронизации, от полностью синхронизированной сети, характерной для однородных культур, в переходных режимах синхронизации между модулями.

Процедура осуществляется в соответствии со стандартами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и был одобрен университета уходу и использованию комитета Тель-Авив животных (номер лицензии - L-14-019) на.

1. Подготовка инструментов и PDMS

1. Подготовка пластин (табл материалов, или заказать пластины из микроструктур лаборатории), скальпель и пинцет - стерилизация не требуется.
2. Сделать поли-D-лизина раствор (PDL) в соответствии со следующими условиями: 4 мг / мл в 0,1 М боратного буфера, рН 8, и хранить при -20 ° С.
3. Подготовка PDMS трафареты в соответствии со следующей процедурой:
   1. Подготовка полидиметилсилоксан (ПДМС, кремнийорганический каучук) путем смешивания основание и отвердитель с соотношением 10: 1, а затем перемешивают в 2 веществ в течение примерно 5 мин.
   2. Место в вакуумной камере в два раза в течение 15 мин каждый раз и проверить пузырьки ушли.
   3. КогдаPDMS готов, подготовить спина нанесения покрытий: открытые ручки азота, чтобы разрешить использование газа, поместите кремниевой пластины (рис 1А) на блесны и использовать вакуум, чтобы предотвратить его перемещение.
   4. Налейте PDMS над пластиной и активировать счетчик течение 1 мин при 1000 оборотах в минуту (создает примерно 100 мкм высотой).
   5. Поместите пластину на горячей плите при 100 ° С в течение 30 мин.
   6. Когда PDMS затвердеет, наметить границы трафарета с PDMS, используя пипетку Пастера. Поместите пластину на горячей плите при 100 ° С в течение 30 мин.
   7. Когда PDMS границы укрепились, а использовать скальпель, чтобы сократить трафареты в соответствии с границами и шелушиться кремния трафарет из пластины (прямоугольной PDMS, содержащие один образец).

2. Петри и крышка скольжения Подготовка

1. Подготовка 23 квадратных мм стеклянной крышкой скользит и очистить их в соответствии со следующим порядком:
   1. Промыть дистиллированной воды, 70% этанола, и ацетона.
   2. Промыть изопропанола и быстро сухой азотом.
2. Поместите скопированные PDMS трафареты на покровное и осторожно нажмите чтобы убедиться, что они надежно прикреплены к поверхности стекла. Место в вакуумной камере в течение 15 мин.
3. Оставьте 1 мл PDL на трафарет. Вставка покровное в вакуумную камеру два раза в течение 20 мин каждый раз, и оставить PDL O / N, чтобы высушить.
4. Подготовка чашки Петри, чтобы создать вспомогательную сеть клеток:
   1. Покрывают поверхность тарелки (3,5 см) с 1 мл PDL в течение 2 ч в РТ. Удалить падение PDL с помощью пипетки.
   2. Промыть дистиллированной водой и оставить до полного высыхания. Поставьте очень маленькую каплю силиконовой смазки на каждом углу покровное.
5. Поместите покровное в центре чашки Петри (то есть, PDMS должен быть обращен вверх) и аккуратно нажмите проверить вложение.
6. Аккуратно снимите PDMS от покровного стекла с помощью пинцета. Для стерилизации, подвергать его воздействию УФ-освещения в течение 7 минут.

1. Чистый MEA в таком порядке (табл материалов):
   1. Промыть водой под краном и разрушать ультразвуком в концентрированном, ферментативной моющего средства 3 раза.
   2. Ультразвук в дистиллированной воде в 3 раза.
   3. Промыть дистиллированной воде (в капот, 1000 мкл наконечник) в течение 3 раза и место под УФ в течение 30 мин.
2. Поддержка подготовку сети:
   1. Подготовка проектной сети поддержки формы.
      1. Налейте PDMS в 12-луночный планшет (диаметр 22 мм).
      2. Когда PDMS затвердевает вынуть форму и с помощью скальпеля, вырезать отверстие в середине, чтобы создать форму кольца.
      3. Поместите предназначенный поддержки сети плесень на центре MEA (фиг.2А) и покрывают остальную часть поверхности с PDL в течение 2 ч при комнатной температуре.
   2. Удалить PDL, с помощью пипетки и промывают дистиллированной водой.
   3. Снимите форму и оставить до полного высыхания (2А). </ Li>
3. Совместите трафарет МЭС следующим образом:
   1. Поместите трафарет на определенных микро манипулятора. Использование инвертированного микроскопа, чтобы точно совместить с рисунком структуры с электродами, и снизить трафарет, пока не будет сделан на MEA поверхности (фиг.2В).
      Примечание: Контакт с хорошо очищенной МЭС обеспечивает конкурентное адгезии между PDMS и самой МПС.
   2. Поднимите микроманипулятор и, если необходимо, используйте пинцет, чтобы нанести небольшое количество давления выше PDMS, чтобы предотвратить его отсоединение от МПС.
   3. Аккуратно нажмите трафарет для MEA поверхности, и использовать микроскоп, чтобы убедиться, что он был надежно закреплен, и хорошо выровнены. (Рисунок 2C-D).
4. Поместите MEA в вакуумной камере в течение 15 мин; поместить каплю 1 мл PDL на трафарет.
5. Вставить в вакуумной камере 2 раза по 20 мин каждый. Оставьте PDL, чтобы высушить O / N в инкубаторе.
6. Перед покрытием, удалите PDMS трафареты из МЭС и вымойте стерильный WAter. Место под ультрафиолетовым освещением в течение 7 минут.

4. Вскрытие и культура

1. Подготовка культур, как описано в Herzog и др. 2011 ^21.

5. Покрытие

1. Рассчитать количество клеток, необходимых для покрытия, с помощью гемоцитометра (оптимальной плотности в соответствии с размером цепи, как описано в результате).
   1. Убедитесь, что Счетной палаты (гемоцитометр) является чистым и место покровное на нем (использование алкоголя, чтобы очистить).
   2. Развести 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл среды покрытие (разведение 1:20).
   3. Нагрузка 10 мкл разбавленных клеток на краю счетной камере и медленно пипетки клетки из позволяет заполнить камеру себя.
   4. Использование инвертированного микроскопа, визуализировать гемоцитометре сетку. Определить количество клеток в камере с помощью прямого подсчета (здоровые клетки должны быть круглыми). Граф клеток в пределах большой площади withoут тех, пересекая края.
   5. Рассчитайте концентрацию клеток:
      Общее количество клеток / 1000 мкл = Всего подсчитанных клеток × фактор разведения × 10 ⁴ (площадь гемоцитометре).
      Примечание: Например, если коэффициент разбавления был 20, а общее подсчитанных клеток были 100:
      100 × 20 × 10 ⁴ = 0,1 х 10 ⁷ клеток / 1000 мкл или 1 х 10 ^6/100 мкл. Для того, чтобы пластины 0,75 × 10 ⁶ клеток, принимают 75 мкл из клеток.
2. Возьмем число клеток, необходимых для покрытия на одну МЭС или чашки Петри, ресуспендирования клеток для предотвращения агрегации и их пластины в центре, в верхней части зоны patternate (при необходимости, можно разбавить клеток в среде) , Для МЭС, поместите каплю 100 мкл в середине. Для покровным, поместите каплю 1000 мкл в середине.
3. Инкубируйте гальванического клеток при 37 ° С в течение 40 мин. Добавить осажденный среду с гальваническим покрытием клеток, до 1мл в МЭС и 2 мл на покровное.
4. Хранить при температуре 37 ° С и каждые 4 дн, разбавл ют свежей ростовой среде, обогащенной 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 и 0,75% GlutaMAX.
5. Из 6/7 DIV, после просмотра связи между островами, разбавленной среде с 10 мкл / мл ФУДР (25 мг дезоксиуридин + 62,5 мг уридин в 12,5 мл MEM (минимальной поддерживающей среде Игла)) или любой другой анти-митотической агента для предотвращения глиальных разрастание.

SU8-2075 формы на кремниевой пластине с толщиной функций из примерно 100 мкм был использован, чтобы формировать PDMS. Шаблон состоит из нескольких квадратов размерами, с длиной стороны, и расстояние между различными 200 и 700 мкм (фиг.1В). Размер квадрата была выбрана, чтобы соответствовать поле зрения 10X (для островов с длиной стороны <800 мкм) и объективную 20X (для островов с длиной стороны <400 мкм). Три параметра, а именно клеток плотности покрытия, расстояние между цепями, размер схем ", являются определяющими для получения монослоя или кластерных схем, а также наложить и формы их взаимосвязи. Тем не менее, эти параметры не являются независимыми, так как, учитывая фиксированное расстояние между двумя цепями, вероятность того, что они спонтанно установить увеличение подключения с размером цепей. В примере, рассмотренном в данной работе, для малых нейронных модулей ~ 300 х 300 мкм, соединенияБыли созданы, когда расстояние было не больше, чем ~ 300 - 400 мкм, в то время как для больших нейронных модулей ~ 700 х 700 мкм, соединения были установлены, когда расстояние было меньше, чем ~ 700 мкм. В общем, за счет увеличения расстояния между квадратами можно было изменить, чтобы установить вероятность спонтанно взаимосвязью между модулями, при переходе от высокой соединенных модулей изолированных единиц.

Нервные модули ~ 600 х 600 мкм показаны на 4 дня в пробирке (DIV; Рисунок 3A). После нескольких дней в пробирке нейронов в основном расположены в районах, покрытых в то время как это не возможно наблюдать развитых нервных процессов и связей. Напротив, в 14 DIV нейроны (рис 3B-C) установить связи внутри и между модулями. В то время как более крупные нервные цепи ~ 600 х 600 мкм может самоорганизовываться в монослоев (3А-C), схемы Smalleг размеры (например, ~ 300 х 300 мкм на рис 3D), как правило, группируются. Поэтому, для того, чтобы получить лучшее калибровки для двумерных схем, клетки высевали с различной плотностью варьируется от 0,25 × 10 6 до 1 · 10 6 клеток / 23 мм крышка скольжения прикрепленной в 35 мм чашки Петри. Для больших схем ~ 700 х 700 мкм мы обнаружили, что 0,75 х 10 6 клеток / 23 мм покровное прилагается в 35 мм чашки Петри является оптимальная плотность которых индуцирует образование монослоя схемы не препятствует их самопроизвольное взаимоподключению (3С ). Же результат монослоя цепи было получено в небольших схем ~ 300 х 300 мкм при посеве 0,5 х 10 6 клеток / 23 мм покровным прилагается в 35 мм чашки Петри. В общем, при рассмотрении плотность клеток покрытия, важно подчеркнуть, что, как обсуждалось ранее 7, нейронные и глиальные клетки имеют врожденную тенденцию группироваться, поэтому в некоторой степени Clustering почти неизбежно через некоторое время в культуре. Тем не менее, мы обнаружили, что увеличение площади, предназначенный для опорной сети позволит повысить вероятность выживания схем "и их моно-слоистой организации, вероятно, из-за большей концентрации питательных веществ во внеклеточном пространстве. В любом случае, методом проб и ошибок подход необходим для определения оптимальной плотности клеток обшивки для создания моно-слоистых схем для визуализации кальция. Каждые 4 дня среду разбавляют свежей средой роста. Из 6/7 DIV, после просмотра связи между островами, 10 мкл / мл ФУДР был добавлен, чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост глиальных.

Рисунок 4 показывает динамику модульной сети, записанные с помощью визуализации кальция (как описано в Bonifazi и др. 2013 8). Кальций флуоресценции изображения были получены с использованием увеличения цели 4X, что позволило мониторинг деятельности всей сети (Figurе 4А). Анализ изображений кальция проводили, как описано в Bonifazi и др. 2013 8. На рисунке 4В растрового участка событий кальция наступлением отображения спонтанную активность представлена ​​(цвета соответствуют модулей, отмеченных на рисунке 4а). Кальций изображений проводили при 30 Гц и размер изображения 1000 х 1000 пикселей.

Зеленые и розовые модули высокой синхронизированы, как показано на растровом участка (фиг.4В) в соответствии с их толщиной соединительных пучков, возможно, соответствующее большое число соединений (фиг.4А). Синие и красные модули слабо связаны с зелеными и розовыми модулей, и поэтому они иногда синхронизироваться с ними (рис 4В). Видео записи доступен онлайн (фильм M1).

Изображение модульной сети, выращенной на MEA в 21 DIV показано на фиг.5А. Яп для того, чтобы получить лучшее калибровки для двумерных схем, мы высевали клетки коры с различной плотностью варьируется от 250 х 10 3 до 500 · 10 3 клеток / в МЭС. 250 · 10 3 клеток / на MEA (30 мм кольцо) дает лучшие результаты с точки зрения образования однослойных схем, при этом не препятствуя их самопроизвольное интер-соединение. После того, как узорные нейронные сети были достигнуты на МПС подложки (рис 5А), электрофизиологические деятельность была контролироваться с помощью коммерческого систему, используемую для получения и записи электрофизиологических сигналов. Спонтанная активность культур определяется с помощью точных сроков обнаружения Спайк (ПТСР) алгоритм 22.

5В показывает растровое участок, соответствующий 5 мин спонтанной активности (только активные электроды видны), цветной кодированный в соответствии с номером кластера. Глядя на этих участках, это можно сделать качественные оценкидеятельности отдельных кластеров и всей сети, в то же время. В частности, можно наблюдать сильное синхронизации между деятельностью, записанных в каждом кластере. Видео представительного записи из узорчатых культур на протяжении МЭА доступна в Интернете (видео M2).

Рисунок 1. Кремниевая пластина. (А) кремниевая пластина (диаметр ~ 4 дюйма), используемый для формования трафареты PDMS. Различные SU8 структуры представляют собой различные модульные сетей. (B) Представитель конструктивная особенность реализована на кремниевой пластине для строительства модульных сетей. Каждый зеленое пятно определить SU8 структуру стойки и, следовательно, область для одного модуля. Конструкции внутри пунктирной черного прямоугольника соответствуют три различных трафаретов, которые могут быть использованы в стандартных культуральных квадратных покровные 23 мм боковой LenГТГ. В каждом шаблоне, звездочка отмечает макрорегион для опорной сети. В зависимости от расстояния между пятнами, схема конечного размера или модули могли бы установить спонтанные нейронные связи между ними. Дизайн особенностей был выбран, чтобы создать другой размер модуля и расстояние между модулями для достижения изолированных или взаимосвязанных нейронов схемы, которые могут поместиться в поле зрения в разных объективных увеличениях (4X, 10X и 20X; поле зрения для каждого увеличения является представлена ​​красными квадратами). Особенности из пунктирной черного прямоугольника разработаны, чтобы соответствовать одновременное использование MEA и кальция визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2.PDMS структуры осаждением на МПС. () PDMS плесень с кольцевой формы (обозначенному красной стрелкой) установлен на МЭС. Пресс-форма используется для покрытия площадь предназначенных к опорной нейронной сети и расположены на периферии области культивирования (это ограничено кольцом, установленным на MEA и отмечены зеленой стрелкой). (В) Выравнивание PDMS трафарета на рубеже тысячелетий помощью микро-манипулятором. (C) PDMS трафарет, нанесенный на на MEA после выравнивания. (D) Изображение в PDMS трафаретом МЭА, используя 10-кратным увеличением с (между электродами расстояние составляет 500 мкм). Это можно заметить отверстия на трафареты в соответствии электродов. Клеевой слой пользу клеточную адгезию будут зачислены только на открытых местах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

GE = "всегда">
Рисунок 3. Модульные нейронные сети на другой DIV. Яркий поле изображения корковых модулей ~ 600 х 600 мкм (а) после 4 DIV и (б) после 14 дел. (C) Обратите внимание на спонтанные взаимосвязи между цепями после 14 DIV. Клетки высевали при оптимальной плотности клеток для больших схем организации в монослоев, т.е. 750 · 10 3 клеток / 23 мм покровным стеклом прикреплены в чашке Петри 35 мм. (D) с использованием PDMS особенности половину размера и концентрации же клеток, нейронные цепи организованы в кластеры структур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

highres.jpg "ширина =" 700 "/>
Рисунок 4. Кальций изображений модульных сетей. (A) корковых клеток (18 дел), загруженные с индикатором кальция OGB. Различные цвета отмечают различные модули. Поле зрения 2 х 2 мм. (B) Raster участок спонтанной активности. Различные цвета соответствуют клеток в различных модулей, как показано на панели А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5. MEA записи модульных сетей. () Модульная сеть (корковых нейронов, 21 дел), состоящий из 3 отдельных цепей, выращенных на 4-м квартале МЭА. Нейронные цепи находятся на расстоянии ~ 600 мкм взаимосвязаны друг с другом. (В) растровых график, показывающий 5 мин спонтанного электрophysiological записи деятельность. C1, C2 и C3 соответствуют, соответственно, в левом верхнем углу, в правом нижнем углу и деятельности в левом нижнем углу кластера, выделяются различными цветами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Авторы не имеют ничего раскрывать.