Методическая статья

Дизайн, обработка поверхности, сотовая Покрытие и культивированию модульных нейронных сетей, состоящих из Функционально взаимосвязанных схем

DOI:

10.3791/52572

⸱

15 апреля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает протокол расти в пробирке модульных сетей, состоящих из пространственно ограниченных, функционально взаимосвязанных нейронов схем. Полимерный маска используется для шаблона белка слой, чтобы способствовать клеточной адгезии по сравнению с культивирования подложки. Плиты нейроны растут на покрытых областях, устанавливающих спонтанные связи и проявляющих электрофизиологические деятельности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мозг работает посредством координации активации и динамической связи нейронов собраний. Основным открытым вопрос о том, как Обширный репертуар динамических мотивов, которые лежат в основе самых разнообразных функций мозга, может возникнуть из фиксированного топологического и модульной организации цепей мозга. По сравнению с исследованиями в естественных условиях нейронных цепей, которые представляют внутренние экспериментальные трудности, препараты в пробирке предложить гораздо больший возможность манипулировать и щуп структурные, динамические и химические свойства экспериментальных нейронных систем. Эта работа описывает экспериментальную методику в пробирке, которая позволяет выращивать модульных сетей, состоящих пространственно отдельных, функционально взаимосвязанных нейронов собраний. Протокол позволяет контролировать двумерный (2D) Архитектура нейронной сети на разных уровнях топологической сложности.

Нужную сеть рисунка может бытьдостигается как на обычных листках покрытия и подложки встроенный микро электродных массивов. Микромеханический структуры тиснением на кремниевой пластине и используются для создания биосовместимых полимерных трафареты, которые включают в себя отрицательные черты желаемого сетевой архитектуры. В трафареты размещены на подложках культивирования в течение процедуры покрытия поверхности с молекулярной слоя для содействия клеточную адгезию. После удаления трафаретов, нейроны высевают и они самопроизвольно перенаправлен в районы с покрытием. При уменьшении между отсека расстояние, можно получить либо отдельные или соединенные между собой нейронов схем. Способствовать выживанию клеток, клетки культивируют совместно с поддерживающей нейронной сети, который расположен на периферии чашки для культивирования. Электрофизиологические и оптические записи активности модульных сетей, полученных соответственно с помощью подложки встроенный микро электрода массивов и визуализации кальция представлены. Хотя каждый модуль показывает SPONTпрочие обязательства глобальные синхронизация, появление синхронизации межмодульной регулируется по плотности связи между цепями.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные и теоретические доказательства подтверждают возможность, что мозг работает на основе скоординированных активации клеточных ансамблей 1-5, которые можно рассматривать как динамические функциональных блоков, которые временно взаимодействуют друг с другом, формирования и основных разных состояний мозга. Функциональный модульность также зависит от и связанные со структурной модульной организации цепей мозга 6,7. Как функция и структура цепей мозга взаимно формировать друг друга прежнему является одним из основных нерешенных вопросов в области неврологии. Чтобы обеспечить более глубокое понимание этого вопроса, важно определить оптимальные экспериментальные основы, где можно обратиться, по крайней мере, частично, эти вопросы. С контролем манипуляции с пространственно-временной динамики нейронных сетей в экспериментах in vivo с является сложной задачей, разработка моделей в пробирке нейронных сетей представляет значительный интерес в связи с их легкой соотвessibility, мониторинг, манипулирование и моделирования 8,9. В последние годы, в пробирке технологий, поддерживаемых передовых методов субстрат паттерна позволили вызвать нейронных сетей для разработки ряда предопределенных модульных конструкций 3 и изучать функциональные свойства сетей с введенных топологий 10. В частности, методы были недавно использованы для организации сетей путем введения физические ограничения 4,11. В самом деле, изучить связь между структурой и функцией в нейронных сетях и обеспечить упрощенное, но правдоподобное представление взаимодействия нейронов сборки системы, в пробирке должна обеспечивать взаимосвязанных нейронов субпопуляции. Широко изучается 2D однородные нейронные культуры не накладывает каких-либо пространственных ограничений на самоорганизации выходящего проводов цепей. Поэтому возможный подход к формированию узлов искусственно соединенных между собой клеток является положение различных популяции нейронов в ссоруially различных областях. Расстояние между этих областях не мешает Интер сборок соединения. Этот подход, в то время обеспечивая значительный контроль над сложность сети, как было показано, обеспечивает богатый репертуар моделей синхронизации 6,7,12.

Для того, чтобы облегчить воспроизводимый культивирование модульных нейронных узлов, протокол, чтобы собрать самоорганизацию сетей в нейронных кластеров, связанных аксонов и дендритов представлены и описаны. Полимерной структуры для физического удержания нейрональных культур был создан из polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS является эластомер широко используется для биомедицинских применений благодаря своей биосовместимости, прозрачности и проницаемости для газов 13. PDMS подготовлен и исключены из микромеханического SU8 2075 14,15 структуры спин-покрытия жидкие PDMS на "хозяина", как описано ранее в Джекман и др. 16 TОн достиг рисунком нейронных сетей состоят из взаимосвязанных модулей разного размера, и они были успешно получены на обоих стеклах и микро матриц электродов (МПС) 17-20. Плотность соединений между модулями может изменить характеристики сетевой синхронизации, от полностью синхронизированной сети, характерной для однородных культур, в переходных режимах синхронизации между модулями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура осуществляется в соответствии со стандартами NIH по уходу и использованию лабораторных животных и был одобрен университета уходу и использованию комитета Тель-Авив животных (номер лицензии - L-14-019) на.

1. Подготовка инструментов и PDMS

  1. Подготовка пластин (табл материалов, или заказать пластины из микроструктур лаборатории), скальпель и пинцет - стерилизация не требуется.
  2. Сделать поли-D-лизина раствор (PDL) в соответствии со следующими условиями: 4 мг / мл в 0,1 М боратного буфера, рН 8, и хранить при -20 ° С.
  3. Подготовка PDMS трафареты в соответствии со следующей процедурой:
    1. Подготовка полидиметилсилоксан (ПДМС, кремнийорганический каучук) путем смешивания основание и отвердитель с соотношением 10: 1, а затем перемешивают в 2 веществ в течение примерно 5 мин.
    2. Место в вакуумной камере в два раза в течение 15 мин каждый раз и проверить пузырьки ушли.
    3. КогдаPDMS готов, подготовить спина нанесения покрытий: открытые ручки азота, чтобы разрешить использование газа, поместите кремниевой пластины (рис 1А) на блесны и использовать вакуум, чтобы предотвратить его перемещение.
    4. Налейте PDMS над пластиной и активировать счетчик течение 1 мин при 1000 оборотах в минуту (создает примерно 100 мкм высотой).
    5. Поместите пластину на горячей плите при 100 ° С в течение 30 мин.
    6. Когда PDMS затвердеет, наметить границы трафарета с PDMS, используя пипетку Пастера. Поместите пластину на горячей плите при 100 ° С в течение 30 мин.
    7. Когда PDMS границы укрепились, а использовать скальпель, чтобы сократить трафареты в соответствии с границами и шелушиться кремния трафарет из пластины (прямоугольной PDMS, содержащие один образец).

2. Петри и крышка скольжения Подготовка

  1. Подготовка 23 квадратных мм стеклянной крышкой скользит и очистить их в соответствии со следующим порядком:
    1. Промыть дистиллированной воды, 70% этанола, и ацетона.
    2. Промыть изопропанола и быстро сухой азотом.
  2. Поместите скопированные PDMS трафареты на покровное и осторожно нажмите чтобы убедиться, что они надежно прикреплены к поверхности стекла. Место в вакуумной камере в течение 15 мин.
  3. Оставьте 1 мл PDL на трафарет. Вставка покровное в вакуумную камеру два раза в течение 20 мин каждый раз, и оставить PDL O / N, чтобы высушить.
  4. Подготовка чашки Петри, чтобы создать вспомогательную сеть клеток:
    1. Покрывают поверхность тарелки (3,5 см) с 1 мл PDL в течение 2 ч в РТ. Удалить падение PDL с помощью пипетки.
    2. Промыть дистиллированной водой и оставить до полного высыхания. Поставьте очень маленькую каплю силиконовой смазки на каждом углу покровное.
  5. Поместите покровное в центре чашки Петри (то есть, PDMS должен быть обращен вверх) и аккуратно нажмите проверить вложение.
  6. Аккуратно снимите PDMS от покровного стекла с помощью пинцета. Для стерилизации, подвергать его воздействию УФ-освещения в течение 7 минут.
ле "> 3. многоэлектродную Array (MEA) Подготовка

  1. Чистый MEA в таком порядке (табл материалов):
    1. Промыть водой под краном и разрушать ультразвуком в концентрированном, ферментативной моющего средства 3 раза.
    2. Ультразвук в дистиллированной воде в 3 раза.
    3. Промыть дистиллированной воде (в капот, 1000 мкл наконечник) в течение 3 раза и место под УФ в течение 30 мин.
  2. Поддержка подготовку сети:
    1. Подготовка проектной сети поддержки формы.
      1. Налейте PDMS в 12-луночный планшет (диаметр 22 мм).
      2. Когда PDMS затвердевает вынуть форму и с помощью скальпеля, вырезать отверстие в середине, чтобы создать форму кольца.
      3. Поместите предназначенный поддержки сети плесень на центре MEA (фиг.2А) и покрывают остальную часть поверхности с PDL в течение 2 ч при комнатной температуре.
    2. Удалить PDL, с помощью пипетки и промывают дистиллированной водой.
    3. Снимите форму и оставить до полного высыхания (2А).
  3. Совместите трафарет МЭС следующим образом:
    1. Поместите трафарет на определенных микро манипулятора. Использование инвертированного микроскопа, чтобы точно совместить с рисунком структуры с электродами, и снизить трафарет, пока не будет сделан на MEA поверхности (фиг.2В).
      Примечание: Контакт с хорошо очищенной МЭС обеспечивает конкурентное адгезии между PDMS и самой МПС.
    2. Поднимите микроманипулятор и, если необходимо, используйте пинцет, чтобы нанести небольшое количество давления выше PDMS, чтобы предотвратить его отсоединение от МПС.
    3. Аккуратно нажмите трафарет для MEA поверхности, и использовать микроскоп, чтобы убедиться, что он был надежно закреплен, и хорошо выровнены. (Рисунок 2C-D).
  4. Поместите MEA в вакуумной камере в течение 15 мин; поместить каплю 1 мл PDL на трафарет.
  5. Вставить в вакуумной камере 2 раза по 20 мин каждый. Оставьте PDL, чтобы высушить O / N в инкубаторе.
  6. Перед покрытием, удалите PDMS трафареты из МЭС и вымойте стерильный WAter. Место под ультрафиолетовым освещением в течение 7 минут.

4. Вскрытие и культура

  1. Подготовка культур, как описано в Herzog и др. 2011 21.

5. Покрытие

  1. Рассчитать количество клеток, необходимых для покрытия, с помощью гемоцитометра (оптимальной плотности в соответствии с размером цепи, как описано в результате).
    1. Убедитесь, что Счетной палаты (гемоцитометр) является чистым и место покровное на нем (использование алкоголя, чтобы очистить).
    2. Развести 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл среды покрытие (разведение 1:20).
    3. Нагрузка 10 мкл разбавленных клеток на краю счетной камере и медленно пипетки клетки из позволяет заполнить камеру себя.
    4. Использование инвертированного микроскопа, визуализировать гемоцитометре сетку. Определить количество клеток в камере с помощью прямого подсчета (здоровые клетки должны быть круглыми). Граф клеток в пределах большой площади withoут тех, пересекая края.
    5. Рассчитайте концентрацию клеток:
      Общее количество клеток / 1000 мкл = Всего подсчитанных клеток × фактор разведения × 10 4 (площадь гемоцитометре).
      Примечание: Например, если коэффициент разбавления был 20, а общее подсчитанных клеток были 100:
      100 × 20 × 10 4 = 0,1 х 10 7 клеток / 1000 мкл или 1 х 10 6/100 мкл. Для того, чтобы пластины 0,75 × 10 6 клеток, принимают 75 мкл из клеток.
  2. Возьмем число клеток, необходимых для покрытия на одну МЭС или чашки Петри, ресуспендирования клеток для предотвращения агрегации и их пластины в центре, в верхней части зоны patternate (при необходимости, можно разбавить клеток в среде) , Для МЭС, поместите каплю 100 мкл в середине. Для покровным, поместите каплю 1000 мкл в середине.
  3. Инкубируйте гальванического клеток при 37 ° С в течение 40 мин. Добавить осажденный среду с гальваническим покрытием клеток, до 1мл в МЭС и 2 мл на покровное.
  4. Хранить при температуре 37 ° С и каждые 4 дн, разбавл ют свежей ростовой среде, обогащенной 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 и 0,75% GlutaMAX.
  5. Из 6/7 DIV, после просмотра связи между островами, разбавленной среде с 10 мкл / мл ФУДР (25 мг дезоксиуридин + 62,5 мг уридин в 12,5 мл MEM (минимальной поддерживающей среде Игла)) или любой другой анти-митотической агента для предотвращения глиальных разрастание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SU8-2075 формы на кремниевой пластине с толщиной функций из примерно 100 мкм был использован, чтобы формировать PDMS. Шаблон состоит из нескольких квадратов размерами, с длиной стороны, и расстояние между различными 200 и 700 мкм (фиг.1В). Размер квадрата была выбрана, чтобы соответствовать поле зрения 10X (для островов с длиной стороны <800 мкм) и объективную 20X (для островов с длиной стороны <400 мкм). Три параметра, а именно клеток плотности покрытия, расстояние между цепями, размер схем ", яв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол расти 2D модульные нейронных сетей в пробирке, состоящей из функционально взаимосвязанных контуров описывается. Процедура основана на сотовой рисунка клеевой слой. Нанесение рисунка достигается с PDMS трафареты воспроизведения отрицательный признак нужного сетевой архитектуры. PDMS трафареты определить те области, где осаждается сотовой клеевой слой. После того, как клетки высевали, они спонтанно собираться на острова, покрытые и самоорганизации в активных взаимосвязанных контуров. Записи функциональны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Европейским проекта BRIANBOW (FP7- молодых исследователей, авторы хотели бы поблагодарить д-ра Якопо Tessadori за полезные замечания по рукописи, и Сильвия Chiappalone за ее помощь в написании графики, используемые в видео.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Nalgene вакуумная камераThermo5305-0609
Poly-D-лизин PDLSigmaP7886
Силиконовая смазка - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
Spin coaterLaurell - Technologies CorporationWS-650-23
12-луночная культуральная пластинаSigmaCLS3336
5-фтор-2'-дезоксиуридинSigmaF0503
UridineSigma U3003
MEA1060-INV-BCМногоканальные системы
TC02Многоканальные системы
Pen Strep BiologicalIndustries Beit Haemek03-033-1C
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM Минимальная необходимая среда EagleБиологическая промышленность Beit Haemek01-025-1B
Микроэлектродные массивы 4QМногоканальные системы60-4QMEA1000iR-Ti-prруководство по очистке: http:// www.multichannelsystems.com
Silicon wafermicrochemSU8-2075Протокол подготовки: http://www.microchem.com

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
  2. Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).
  3. Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
  4. Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
  5. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400(2014).
  6. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443(2010).
  7. Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10(2011).
  8. Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40(2013).
  9. Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
  10. Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648(2012).
  11. Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
  12. Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
  13. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
  14. Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
  15. Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
  16. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
  17. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
  18. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
  19. Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
  20. Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
  21. Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008(2011).
  22. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
  23. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
  24. Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
  25. Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
  26. Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
  27. Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
  28. Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи