Методическая статья

Анализ аутофагии в

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52577

⸱

1 февраля 2015 г.

1LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF), Senckenberg Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен удобный и мощный метод изучения аутофагии у Penicillium chrysogenum с использованием прокладок голодания (смеси агарозы и водопроводной воды в предметном стекле микроскопа, содержащем центральную полость).

Аннотация

Изучение систем контроля качества сотовой связи стало очень динамичной и актуальной областью современных исследований. Стало ясно, что клетки обладают несколькими линиями защиты от повреждения биологически значимых молекул, таких как нуклеиновые кислоты, липиды и белки. В дополнение к динамике органелл (слияние/деление/подвижность/наследование) и жестко контролируемой активности протеазы, деградация избыточных, поврежденных или скомпрометированных органелл в результате аутофагии (клеточное «самопоедание») привлекла большое внимание научного сообщества. Регуляция аутофагии довольно сложна и зависит от генетических факторов и факторов окружающей среды, многие из которых до сих пор не выяснены. Здесь представлен новый метод, который позволяет удобно изучать аутофагию у нитчатого гриба Penicillium chrysogenum. Он основан на выращивании гриба на так называемых «подушечках голодания» для стимуляции аутофагии воспроизводимым образом. Образцы непосредственно анализируются с помощью микроскопии и оцениваются на предмет индукции аутофагии / прогресса. Представленный здесь протокол не ограничен для использования с P. chrysogenum и может быть легко адаптирован для использования при других нитчатых грибах.

Введение

Нитчатых грибов являются Отличная модель системы для изучения процессов развития. Они предлагают несколько экспериментальных преимущества, как дешевый выращивания, высокой численности потомства и генетического доступности. Последний пункт имеет особое значение для строительства трансформантов, что позволяет исследовать важность так далеко охарактеризованных генов для различных клеточных механизмов. Мицелиальных грибов играют важную роль для выяснения нескольких элементов и механизмов клеточных путей контроля качества, как активность протеазы для деградации аберрантных белков, митохондриальная динамики для поддержания митохондриальной целостности и аутофагии для удаления излишков и / или компонентов неблагополучных клеток и для поддержания Жизнеспособность клеток во время голодания 1,2,3.

Есть несколько экспериментальных методов, доступных для изучения аутофагии в нитчатых грибов 2: (I) Исследование вакуолей яF они содержат плотные тела, когда аутофагической протеазы ингибирует помощью просвечивающей электронной микроскопии 4, (II) визуализация аутофагосом по мониторингу GFP-Atg8 очаги с помощью флуоресцентной микроскопии 5,6 и (III) обнаружения подкисленных autophagosomal структур с помощью монодансил кадаверин флуоресцентный краситель 7.

Здесь новый метод выращивания Пеницилл золотистый для аутофагии исследований представлены. Основным элементом является "голодание колодок ', который просто состоит из 1% агарозы, растворенного в стерилизованной водопроводной воды. Дополнительные соединения (например, стресс-факторы, поглотители, автофагии модуляторы) могут быть добавлены к площадке, пока они не показывают автоматического флуоресценции. Накладка находится в микроскопических слайдов, которые содержат неполную центральную полость. Это колодок в инокулировали либо суспензией спор или небольших фрагментов мицелия. Последнее целесообразно, если штамм не в интересах sporulatе эффективно (например, штаммы ГПТ1 Δ 8). Слайды расположены во влажных камерах (они могут быть легко сконструированы с использованием пипетки пустые коробки), чтобы предотвратить высыхание образца и инкубировали при комнатной температуре. П. chrysogenum может расти в течение нескольких дней в этих условиях. Аутофагия можно наблюдать микроскопически вакуолярной расширения, которая положительно маркер для грибковой аутофагии. В данной статье, в P. chrysogenum Штамм (Висконсин 54-1255) используется, который формирует зеленый флуоресцентный белок, который предназначен для пероксисом его С-концевого "СКЛ" последовательности 9. Поэтому можно контролировать деградацию пероксисом. Вполне возможно, для обозначения и другие отсеки клетки (например, митохондрий), используя соответствующие сигналы локализации и проанализировать их деградации. Хотя, по данным P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) представлена ​​здесь, это, конечно, возможноиспользовать метод «голод Pad 'и для других нитчатых грибов (например, Нейроспора густая, Sordaria macrospora, виды Aspergillus, и т.д.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка P. chrysogenum для голодания экспериментов

  1. Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на рисе ("зеленая рисовая '), поместить 2-3 рисовые зерна, покрытые спорообразующих мицелий в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Заполните его 500 мкл YGG (10 г / л KCl, 20 г / л глюкозы, 10 г / л дрожжевого азотистого основания, 5 г / л K 2 HPO 4, 20 г / л дрожжевого экстракта).
    1. Vortex трубку в течение 30 сек, так что споры могут отделиться от риса эффективно.
    2. Инкубируйте пробирку в течение 1 дня при комнатной температуре (например, от 20 до 25 ° C).
    3. Подготовьте разведение этой суспензии спор в стерильной водопроводной воде 1/50, хорошо перемешать.
  2. Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на агаровой пластине (например, YGG агаром), передавать небольшие кусочки мицелия в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 400 мкл стерильной водопроводной воды и примерно 100 мг GLпопа шарики с помощью стерильного выбор зуба или пипетки.
    1. Вихревые трубки в течение 2 мин, так что мицелий становится фрагментированной. Сразу же использовать содержимое пробирки.

2. Подготовительные шаги для выращивания Р. chrysogenum на голодном колодки

  1. Включите нагревательную плиту и установите его приблизительно на 60 ° C.
  2. Растворить 2 г агарозы в 100 мл водопроводной воды при приготовлении раствора в микроволновой печи. Позаботьтесь, что это решение совершенно ясно после нагревания. Если это не так, готовить его снова до тех пор, пока агарозном растворяется полностью. Пусть раствор агарозы остыть до приблизительно 60 ° С до использования.
  3. Заполните 1,5 мл микроцентрифужных трубки (2-4, в зависимости от количества образцов) с 400 мкл стерильной водопроводной воды каждый (никакие дополнительные соединения не добавлено) или 400-х мкл (добавление х мкл раствора соединения в стадии 2,5) и поместить их на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин, так что Watэ внутри нагревается.
  4. Поместите микроскопа, содержащие центральную полость на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин.
  5. Добавить 400 мкл 2% агарозном к раствору в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и вихревой кратко. После этой стадии, если желательно, дополнительные соединения (например, 1 мкМ рапамицина). Если это сделано, вихревые кратко после каждого дополнительного вещества с помощью пипетки в пробирку. Положите трубки обратно на стол отопления для предотвращения преждевременного затвердевания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в микроцентрифужных трубки должны быть 800 мкл.

3. Подготовка Предметные Содержит голода колодки

  1. Пипеток 140 мкл раствора агарозы в полости микроскопа (который до сих пор расположенные на нагревательной пластине). Старайтесь избегать пузыри, если это возможно.
  2. Сразу место крышку скольжения на раствор агарозы.
    Примечание: Это приведет к плоской поверхности.
  3. Поставьте микроСфера слайд на лабораторном столе в течение примерно 4 мин, чтобы позволить агарозном площадку затвердеть.
  4. Осторожно снимите покровное из агарозы колодки, сдвинув его с помощью большого пальца или указательным пальцем (носить перчатки, чтобы избежать загрязнения!).
  5. Поместите микроскопа с площадки во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание. Рекомендация: Используйте пустую коробку совет, который до сих пор имеет вставку для проведения наконечники. Добавить стерильную воду к коробке так, что дно покрыто. Поместите предметные стекла на вставку и закройте окно.

4. прививки голодание колодки с P. chrysogenum, и инкубационный

  1. Пипеток 5 мкл разведении 1/50 спор (если Культуры выращивали на рисе) или 5 мкл неразбавленной раствора, содержащего мицелий фрагменты (если культуры выращивали на чашке с агаром) на центр голода площадку.
  2. Закройте мокрой камеру и оберните его в полиэтиленовый пакет (это служитдополнительная защита от высыхания голодной площадки). Будьте осторожны, чтобы не переместить окно слишком много, потому что в противном случае прививка капли будет нарушен.
  3. Хранить завернутые коробку при КТ в течение по меньшей мере 20 ч до анализа образцов.

5. микроскопический анализ образцов

  1. После 20 ч инкубации образцы готовы для микроскопического анализа; положить стекло микроскопа на сухой папиросной бумаги (нижняя, как правило, становятся влажными).
  2. Пипеткой небольшое количество воды (около 50 мкл) на голодной площадку. Положите покровное на площадке и выжать излишки воды. Удалить остатки воды с папиросную бумагу.
  3. Положите стекло микроскопа на смотровой стол флуоресцентного микроскопа. Чтобы получить представление о росте мицелия, используйте цели 20X. Использование 63x или 100X цели для изучения локализации GFP в гиф. Для того чтобы предотвратить постепенное высыхание образца не анализируют образцы длябольше, чем 15 мин, прежде чем положить их обратно в мокрой камеры.
  4. Повторите 5,3 через регулярные промежутки времени (например, после 40 ч и 60 ч роста).
    ПРИМЕЧАНИЕ: образец можно вернуть в мокрую камеру. Это не обязательно, чтобы удалить покровное как это не влияет на мицелия рост.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать полезность протокола описано выше деградации пероксисом в P. chrysogenum Штамм Ws54-1255 (GFP-SKL) анализировали. В этом штамме GFP-SKL, как правило, импортируются в пероксисомах 9. Это приводит к появлению множества сферических форм, когда образец анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии. Если аутофагии происходит, вакуоли увеличить. GFP-SKL становится включены в вакуолях путем аутофагии (pexophagy). В связи с тем, что GFP устойчив к деградации вакуоли протеаз, что э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, представленный здесь позволяет удобно и воспроизводимый исследование аутофагии в Р. chrysogenum. Например, он может быть использован для скрининга эффективности различных соединений, являются ли они способны модулировать аутофагии реакцию этого гриба или нет. Результаты с рапамицином показывают, что ингибирование передачи сигналов TOR приводит к выраженной индукции аутофагии в P. chrysogenum, который также было продемонстрировано и для других организмов 11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

CQS получает стипендию от LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). Автор хотел бы поблагодарить Иду Й. ван дер Клей за штаммы P. chrysogenum, использованные в этой работе, и Андреаса С. Райхерта за дар рапамицина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Предметные стекла для микроскопа с центральной полостьюCarl Roth GmbH, Карлсруэ, ГерманияH884.1Их можно использовать несколько раз после очистки.
Стеклянные бусиныCarl Roth GmbH, Карлсруэ, ГерманияA553.1Диаметр: 0,25 - 0,50 мм

Ссылки

  1. Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
  2. Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
  3. Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
  4. Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
  5. Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
  6. Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
  7. Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
  8. Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
  9. Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
  10. Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
  11. Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
  12. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFPDelta 80 G1

Похожие статьи