Целью этого протокола является изучение опухолегенеза молочной железы. С помощью этой методики удаляются опухоли молочной железы мышей и из опухолей подготавливаются первичные клетки. Протокол экстракции легких включает в себя протокол экстракции легких для изучения метастазов в легких. Кроме того, включен еще один протокол анализа эмбриональных фибробластов мыши из эмбриона мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Первичная опухоль и MEF Выделение клеток для изучения метастазов в легких
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
При опухолеобразовании молочной железы метастатическая стадия заболевания представляет наибольшую угрозу для пораженного человека. Нормальные клетки молочной железы с измененными генотипами теперь обладают способностью проникать и выживать в других тканях. В этом протоколе удаляются опухоли молочной железы мыши и из опухолей подготавливаются первичные клетки. Клетки, выделенные в результате этой процедуры, затем доступны для экспериментов по профилированию генов. Для успешного метастазирования эти клетки должны быть способны к интравазии, выживанию в циркуляции, экстравазации в отдаленные органы и выживанию в этой новой системе органов. Легкие являются типичной мишенью метастазирования рака молочной железы. Был обнаружен набор генов, который опосредует селективность метастазирования в легкие. В данной статье мы опишем метод изучения метастазов в легких на генетически модифицированной мышиной модели. Кроме того, включен еще один протокол анализа эмбриональных фибробластов (MEF) мыши из эмбриона мыши. MEF-клетки одного и того же животного типа дают ключ к разгадке экспрессии генов нераковых клеток. Вместе эти методы полезны для изучения опухолевого генеза молочной железы у мышей, связанных с ним сигнальных механизмов и путей аномалий у эмбрионов.
Введение
Метастазирование является последним шагом в прогрессировании рака молочной железы 1. Он включает в себя ряд этапов, в ходе которых злокачественные клетки высвобождаются из первичной опухоли и диссеминируются в другие органы. Клетки должны быть способны к интравазии, выживанию в циркуляции, экстравазации в отдаленные органы и выживанию в этой новой системе органов. Каждый этап онкогенеза жестко контролируется клетками посредством различных генетических и эпигенетических изменений 4. Для изучения механизмов онкогенеза рака молочной железы были использованы мышиные модельные системы из-за их короткой продолжительности жизни, небольшого размера и быстрого времени размножения. Некоторые основные преимущества использования мышиных моделей в исследованиях рака заключаются в молекулярном и физиологическом сходстве, которое они имеют с человеком.
Установленные линии клеток мыши и человека широко использовались в исследованиях рака молочной железы. Несмотря на то, что с помощью этих клеток мы можем получить некоторую информацию об этапах метастазирования, генетически модифицированные животные модели с супрессорами опухолей/онкогенами дадут гораздо больше информации о развитии опухоли и метастазировании, начиная с эмбриональной стадии. Таким образом, с помощью этих мышиных моделей мы можем получить генетическую регуляцию и регуляцию развития роста опухоли. Кроме того, микроокружение опухоли также играет важную роль в экспрессии генов опухолевых клеток, и может быть трудно смоделировать тот же сценарий с исследованиями с использованием установленных клеточных линий. Первичные опухоли молочной железы человека также могут быть использованы для изучения опухолевого генеза молочной железы у мышей. Основным недостатком использования изолированных опухолей молочной железы является то, что эта вновь имплантированная опухоль не имеет сосудистой сети и лимфатической ткани мыши. В свою очередь, генетические мышиные модельные системы для изучения опухолегенеза молочной железы позволят отслеживать этапы метастазирования, анализировать микроокружение опухоли и доступ ко всему организму5.
Общая цель этого протокола - изучить опухолегенез молочной железы у мышей. Известно, что рак молочной железы обычно метастазирует в мозг, легкие и кости. Этот протокол позволяет проводить выделение клеток первичной опухоли молочной железы, а также изучать метастазирование рака молочной железы в легкие. Кроме того, включен еще один протокол анализа эмбриональных фибробластов (MEF) мыши из эмбриона мыши. Вместе эти методы полезны для изучения опухолевого генеза молочной железы мышей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты были мыши осуществляется в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональные животных уходу и использованию комитетов (IACUC) в ЛГУ в Школе медицины. Все инструменты должны быть в автоклаве до вскрытия.
1. Подготовка первичных клеток из опухоли молочной железы мыши
- Используйте модель мыши, которая была генной инженерии с помощью мыши опухоли молочной полиомавируса Средний Т-антигена (ВОМЖМ-PyMT-трансгенной мыши), которые самопроизвольно развития опухоли, как описано ранее 6.
- Жертвовать мышей Isoflurane (99,9%) и спрей 75% этанола, чтобы обеспечить стерильную среду (фиг.1А).
- Открытие кожу от области отверстия мочеиспускательного канала к шее с помощью ножниц. Pin кожу, чтобы позволить легкий доступ к органам (рис 1б).
- Изолировать опухоли молочной груди и промыть холодной стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН 7,4) (рис 1С).
- Передача опухолистерильный 10 см культуре ткани пластины и нарезать его стерильным лезвием и ножницами, чтобы примерно 1 мм 3 штук. Последующие шаги должны быть выполнены в стерильном ламинарном боксе.
- Инкубируйте нарезанный опухолевой ткани коллагеназой, растворенного в бессывороточной DMEM среде при конечной концентрации 1 мг / мл на качалке в течение 2 часов при 37 ° С. Центрифуга опухолевой ткани суспензии в течение 3 мин при 200 х г.
Примечание: коллагеназы инкубации необходима для ферментативной диссоциации ткани. - Жидкость над осадком сливают и промывают осадок 3 раза PBS (рН 7,4) центрифугированием в течение 3 мин при 200 х г. После последней промывки, декантируют надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют ткани с 2 мл трипсина ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С, а нутационное. Центрифуга суспензии в течение 3 мин при 200g и повторить мытье.
- Ресуспендируют ткани пеллет в нормальной среде для роста (DMEM, 10% FBS, 2X ручка / стрептококк) на 10 см пластины. ИзменениеСМИ каждый день в течение следующих 3 дней. Культуры клеток до желаемого количества клеток получают.
Примечание: Приблизительно 1x10 7 клеток будут изолированы от этой процедуры. Другие модели онкогенеза молочной железы мыши, такие как MMTV-Neu, дать более низкий выход клеток по сравнению с MMTV-PyMT. При использовании модели, которые производят более низкий выход, это выгодно, чтобы начать с большим опухолевых клеток культуры и более.
2. Мышь легких Добыча визуализировать метастазов в легких
- До экстракции легких, печени удалить и диафрагму. Выбить ребра, не нарушая легкие.
- С тонкой ножницами, открыть верхнюю часть трахеи, которая ближе к яремной вены.
- Использование катетера, вводят агент, такой как 1 мл Z-исправления или тушью через трахею, чтобы заполнить легкие (фиг.2А). Вставить Z-Fix Легкие в парафин.
- Де-пятно легкие инъекционные тушью в растворе Фекете(100 мл 70% спирта, 10 мл 10% забуференном формалине и 5 мл ледяной уксусной кислоты) в течение 5 мин. Определить опухолевые узелки в средних сайтов с ≥ 0,5 мм в диаметре, определить узелки как метастаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за бронхов и бронхиол закупорки опухолью, опухолевые узлы не могут поглощать 15% тушь, и, таким образом, нормально легочной ткани будет в черном, и опухолевые узелки будет в белом цвете 7. Это позволит визуализации отдельных узелков опухоли (фиг.2В).
3. Подготовка мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) из эмбрионов мыши
- Жертвовать беременных мышей изофлураном (99,9%) и спрей 75% этанола, чтобы обеспечить стерильную среду.
- Открытие кожу от области отверстия мочеиспускательного канала к шее с помощью ножниц и изолировать эмбрионов из матки.
- Будьте осторожны, чтобы не беспокоить эмбрионов при открытии кожу.
- Снимите рога матки и промойте их в холодной стераздражать PBS (рН 7,4).
- Отделите эмбрион от ее плаценты очень тщательно и место эмбрионов в 10 см пластины, содержащей ледяной PBS (рН 7,4).
- Удалить голову, печень и кишечник от эмбриона и помещают оставшуюся часть в культуре ткани пластины 12 также, содержащей PBS (рН 7,4).
- Перевести тело эмбриона другой 12-луночный планшет, содержащий трипсин ЭДТА и нарезать небольшими кусочками (~ 1 мм 3) с использованием стерильного лезвия бритвы и ножницы. Инкубируйте нарезанный материал с 5 мл трипсина ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С.
- Деактивировать трипсина путем добавления 1 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) с нарезанной эмбрионов. Центрифуга суспензии при скорости 200 мкг в течение 10 мин, осторожно удалить супернатант, ресуспендируют осадок в 1 мл теплой среды DMEM и передавать все содержимое в 10 см чашку, содержащую 10 мл среды DMEM (20% FBS и 2X пенициллин / стрептомицин ).
- Изменить среды каждый день в течение двух дней. Культуры клеток до нужной ячейкедостигается число.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этап опухолевой прогрессии, при котором в жертву животное, зависит от конкретного исследования и принципов IACUC. На рисунке 1А, 100-дневного возраста C57BL / 6 мыши с мышь опухоли молочной полиомавируса Средний Т-антигена (ВОМЖМ-PyMT) был принесен в жертву на три месяца. Кожа была открыта из области отверстия мочеиспускательного канала к шее с ножницами и кожа была прижата для обеспечения легкого доступа к органам, как показано на рисунке 1В. Это позволило легкий доступ к опухоли, кото...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол для выделения первичных клеток из свежей опухоли мыши. Лизаты получают из этого метода могут быть использованы для белка, ДНК и РНК анализа. Раковые клетки опухоли молочной железы первичной часто метастазируют в мозг, легкие и кости 1. В комплекте есть метод для извлечения легких для выявления метастазов. Окрашивание легких с чернилами пятна позволит визуализации опухолевых узелков, как показано на рисунке 2В. Крепление легкие в Z-Fix решения позволит нам сделать разделы легких,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют раскрытия.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить NIH, LACaTS и фонд клиники Ochsner за финансовую поддержку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | Магазин в 4 ° C |
| 0,05% Трипсин-ЭДТА | Life технологии | 25300-062 | Хранить в – 20 ° C |
| коллагеназа типа IV | Sigma-Aldrich | C5138 | хранить в – 20 ° C |
| гиалуронидаза | сигма-олдрич | H3506 | хранить в – 20 ° C |
| Pen Strep | Life технологии | 15140-122 | Магазин по адресу 4° |
| C Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | Store at – 80 ° C |
| Z-fix | ANATECH | #174 | Магазин в RT |
| India Ink | Yasutomo | Магазин в RT | |
| AERRANE (Isoflurane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | Магазин в RT |
| Ethanol | EMD | AX0441-3 | Магазин в RT |
Ссылки
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
- Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
- Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
- Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).
- Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
