Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Количественный амплификации нуклеиновых кислот является важным методом для обнаружения окружающей среды, пищевого происхождения, и водно-патогенных микроорганизмов, а также для клинической диагностики. В режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) является метод золотой стандарт для чувствительной, конкретной и количественного определения нуклеиновых кислот, например, для ВИЧ-1 вирусной нагрузки испытаний, обнаружение бактериальных патогенов, и скрининг на многих других организмов 1 – 3. В режиме реального времени кПЦР, праймеры амплификации ДНК патогена в циклах, и флуоресцентный сигнал, который пропорционален количеству амплифицированной ДНК в образце при каждом цикле. Образец, содержащий неизвестное концентрации патогенов ДНК может быть определена количественно с использованием стандартной кривой, которая относится к начальной концентрации ДНК стандартных образцов и времени, при котором флуоресцентный сигнал достигает определенного порога (т.е. порогового цикла, или С Т).
<p class="Jove_content"> Поскольку в режиме реального времени КПЦР требует дорогостоящего оборудования термоциклировании и несколько часов, чтобы получить результаты, альтернативные изотермические методы амплификации, такие как рекомбиназа полимеразной амплификации (РПА), были разработаны четыре. Эти платформы обычно обеспечивают результаты быстрее и амплификации нуклеиновых кислот при более низкой температуре, одной, которая может быть выполнена с менее дорогой, простой оборудования. РПА, которое является особенно привлекательным для точка-в-ухода приложений, усиливает ДНК в минутах, требуется более низкая температура амплификации (37 ° С), и остается активным в присутствии примесей 5,6. РПА анализы были разработаны для широкого спектра применений, в том числе анализа пищевых продуктов, обнаружения возбудителя, рак скрининга лекарственных средств, и выявления biothreat агентов 7 – 12. Тем не менее, использование РПА для количественного определения нуклеиновых кислот была ограничена 13,14.В предыдущей работе, это было шоWn, что в режиме реального времени количественный РПА (QRPA) возможна 15. Здесь более подробно протокол предназначен для использования в режиме реального времени количественный RPA количественно неизвестных образцов с использованием стандартной кривой, способ, аналогичный количественного использованием КПЦР. Этот протокол описывает, как выполнить реакцию РПА термоциклере для обнаружения ДНК ВИЧ-1, как доказательство правильности концепции, а также о том, как развивать внутренний положительный контроль (IPC), чтобы убедиться, что система функционирует нормально. Сбор данных с использованием амплификатор или микроскопа и анализа данных для построения стандартной кривой с использованием обучающих данных также подробно. Наконец, метод количественного неизвестных образцов, используя калибровочную кривую с помощью специального сценария показано. Этот метод дает количественное QRPA образцов с неизвестными концентрациями и имеет много преимуществ по сравнению с традиционными реального времени кПЦР.
1. Программа термоциклер в режиме реального времени QRPA реакций
2. Подготовка к ВИЧ-1 QRPA экспериментов
3. Соберите ВИЧ-1 QRPA стандартной кривой
4. Разработка положительного контроля внутреннего
5. Построение стандартной кривой из нескольких экспериментов
6. Анализ проверки и количественной оценки неизвестных образцов с использованиемСтандартная кривая
7. Подготовка к сбору данных с использованием флуоресцентного микроскопа и подогревом Chip
8. Сбор и ана данныхSIS с помощью флуоресцентного микроскопа
Для того, чтобы получить значимые данные количественной с использованием алгоритма MATLAB, пользователь должен выбрать соответствующие значения входного сигнала, когда будет предложено. После начала каждого сценария в разделах 5 и 6, все входные переменные автоматически запросил в окне командной и выходы создаются автоматически. В разделе 5.7 пользователю будет предложено выбрать порог наклона. Значение порога наклона влияет на квадрат коэффициента корреляции (R 2), фита. При использовании необработанных данных флуоресценции, экспортированные из термоциклер, значения между 2,0 и 5,0, как правило, дают высокий коэффициент R 2. В разделе 5.8 пользователь должен указать количество стандартных отклонений над фоном, чтобы установить положительный порог. Чтобы оценка образец как положительным, так и отрицательным, скрипт автоматически определяет разница Δ образец между максимальной и минимальной флуоресценции для каждого образца, используя исходные данные флуоресценции экспортируемые из Термал велосипедист. Он рассчитывает среднюю разницу Δ фона и стандартное отклонение σ фона для контрольных образцов все не-мишени. Проба считается положительной, если образец Δ более чем г × σ фоне выше Δ фоне. В разделе 5.10 пользователь решает, следует ли использовать пороговое значение по умолчанию или установить новый порог. Если пользователь желает установить новый порог, определяет новый порог экспериментально путем выполнения 3 экспериментов каждый из которых содержит 12 RPA реакций без какой-либо ВИЧ-1 ДНК, присутствующей. Установите порог в среднем увеличение интенсивности флуоресценции от этих экспериментов плюс 3 стандартных отклонений. После заполнения Раздела 6, сценарий JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m автоматически возвращает Предполагаемая концентрация ДНК каждой реакции QRPA (в log10 копий). Если сценарий определяет, что ВИЧ-1 ДНК не присутствует в образце, по оценкам концентрации указаны либо как "Negative на ВИЧ "или" недействительно, "в зависимости от того флуоресцентного сигнала для внутреннего положительного контроля превысил порог (г × σ фоне + Δ фоне). Если пользователь проверки при помощи стандартной кривой известных концентраций образцов, сценарий будет также возвращать дополнительную таблицу, аналогичную таблице 1.
В целях развития в реальном времени РПА анализа, который обеспечивает точную количественную оценку, экспериментальная последовательность имеет решающее значение. Например, можно использовать одни и те же праймеров и зондов аликвот как для стандартной кривой и проверочные эксперименты. Также следует избегать циклов замораживания-оттаивания, сохраняя праймеров и зондов аликвот при 4 ° С между экспериментами, а не -20 ° С. Аликвоты шаблон, используемый для стандартной кривой и проверки экспериментов хранятся в том же порядке. РПА ферментов гранулы и реагенты из одной партии используются в соответствии с рекомендациями производителя. Наконец, Бекаиспользовать РПА не хватает истинных "циклов", чтобы точно контролировать скорость усиления, стандартизация пользователем шагов абсолютно необходимо. При сборке реакции, пользователь всегда должен выполнить те же действия в том же порядке, тратя примерно такое же количество времени на каждом этапе. Реакции всегда должны быть смешаны осторожно нового наконечника пипетки, и пузыри всегда должны быть устранены. Перед усиления реакции должны быть проведены при стабильной температуре и термоциклер или микроскоп программное обеспечение всегда должны быть готовы перед загрузкой реакции, чтобы избежать каких-либо усиление на неоптимальных температурах, которые могут повлиять на количественную. Любое изменение в начальных условиях реакции могут привести к несогласованности в экспериментальных результатов.
При использовании микроскопа для сбора данных, дополнительные переменные должны контролироваться, чтобы свести к минимуму изменение интенсивности флуоресценции. Все реакции должны быть размещены в том же регионе на сцене теплее, и microscoPE должно быть сосредоточено на том же регионе скважины для каждого образца. Даже если эти методы следуют данные флуоресценции, полученные на микроскопе могут проявлять изменчивость из-за местных ярких пятен, которые, естественно, образующихся при РПА реакций, образования пузырьков в реакционной камеры, или фотовыцветания в результате многократного воздействия возбуждающего света. Влияние этих переменных очевидно в данных флуоресценции собранных на микроскопе (фиг.4А и 4В), которые демонстрируют базовой изменчивость, пики и впадины,. Эти особенности отсутствуют данные флуоресценции собранных на термоциклере (Фигуры 3А и 3В). В конечном счете, сбор данных на микроскопе только для доказательства правильности принципа целях и окончательный анализ будет осуществляться на местах, в рабочем флуоресценции читателя с более точной геометрией и программного управления, которая минимизирует эти переменные.
Еще одним важнымаспектом процесса развития анализа QRPA является последовательность в обработке данных. Протокол, описанный в разделе Методы использует сценарии для обработки исходных данных флуоресценции (сохраненные в файле электронной таблицы), полученные от термоциклере или микроскопа. Все эксперименты, используемые для построения калибровочной кривой должен быть отформатирован идентично. При использовании амплификатор для сбора данных, то же самое расположение пластины должны быть использованы, и данные из скважин, которые не содержат РПА реакции не должна быть экспортирована. При использовании микроскопа для сбора данных, формат данных должен соответствовать формату данных автоматически экспортируются из термоциклер. Например, данные не-мишени управления должно находиться в клетках C2: C61, а также данные для повышения концентрации шаблона должно быть в клетках D2: D61, Е2: Е61 и т.д. Если имеется несколько повторов каждой концентрации в эксперименте, Серия разбавления 2-й повторить заказываются слева направо ни от целевой контроля (NTC) до самой высокой концентрации исохранены в столбцах непосредственно справа от 1-го репликации серии разведений. Например, в схеме пластины, используемой в разделе 1.2 с 2 повторяет для каждого образца, данные флуоресценции на первой повторности каждого образца в серии разведений должно быть сохранено в клетках С2: H61 и флуоресценции данных для второго репликации каждого образца в серийные разведения должны быть сохранены в ячейках I2: N61. Для компоновки пластины, используемой в разделе 1.2, это форматирование по умолчанию при экспорте данных из термоциклера программного обеспечения для электронной таблицы.
Представительства данные, предоставляемые ВИЧ-1 QRPA экспериментов показывают доказательство правильности концепции поддержки РПА может быть использована для количественного определения концентрации нуклеиновой кислоты в исследуемом образце. Клинически полезные ВИЧ-1 вирусной нагрузки у клинический спектр, по крайней мере на 4 порядка, точность 0,5 log10 копий и предельно-о-обнаружение, по меньшей мере 200 экземпляров 19,20. ВИЧ-1 Анализ ДНК описано отвечает этим крiteria и наиболее точным при низких концентрациях, как показано в таблице 1. Таким образом, с включением в обратной транскриптазы стадии, эти результаты свидетельствуют о том, что анализ на ВИЧ-1-RT РПА может иметь потенциал для измерения ВИЧ-1 вирусной нагрузки в клинические образцы. При разработке анализа QRPA, настройке параметров алгоритм может настроить чувствительность и динамический диапазон линейной зависимости от клинических нужд. Рисунок 6 показывает, что регулирование г (параметр, который определяет порог положительных образцов) может влиять на чувствительность и точность при низких и высоких Целевые концентрации. Кроме того, это может быть возможным, чтобы увеличить разрешение и точность определения количества путем инкубации реакцию при более низкой температуре или с использованием меньшего ацетат магния, тем самым уменьшая скорость амплификации.
Это доказательство концепции QRPA анализа могут быть использованы для количественной оценки концентрации образцов, содержащих ДНК ВИЧ-1. QRPA анализа, описанного в этом маnuscript включает в себя подробные инструкции о том, чтобы собрать реакции РПА в режиме реального времени, разрабатывать и экранировать IPC, и обрабатывать исходные данные флуоресценции для построения стандартной кривой, которая может быть использована для количественной оценки неизвестных образцов. С подробные инструкции включены, этот протокол может быть адаптирован для количественного концентрацию ДНК в различных образцов.
The authors have nothing to disclose.
qRPA Assay | |||
HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | |
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
IPC Development | |||
Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Microscope Experiments | |||
Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
Data Analysis | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
MATLAB | MATLAB | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
Adobe Illustrator | Adobe | ||
JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
AxioVision software | Zeiss | ||
JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |