Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

Количественный амплификации нуклеиновых кислот является важным методом для обнаружения окружающей среды, пищевого происхождения, и водно-патогенных микроорганизмов, а также для клинической диагностики. В режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) является метод золотой стандарт для чувствительной, конкретной и количественного определения нуклеиновых кислот, например, для ВИЧ-1 вирусной нагрузки испытаний, обнаружение бактериальных патогенов, и скрининг на многих других организмов ^{1 – 3.} В режиме реального времени кПЦР, праймеры амплификации ДНК патогена в циклах, и флуоресцентный сигнал, который пропорционален количеству амплифицированной ДНК в образце при каждом цикле. Образец, содержащий неизвестное концентрации патогенов ДНК может быть определена количественно с использованием стандартной кривой, которая относится к начальной концентрации ДНК стандартных образцов и времени, при котором флуоресцентный сигнал достигает определенного порога (т.е. порогового цикла, или С _Т).

<p class="Jove_content"> Поскольку в режиме реального времени КПЦР требует дорогостоящего оборудования термоциклировании и несколько часов, чтобы получить результаты, альтернативные изотермические методы амплификации, такие как рекомбиназа полимеразной амплификации (РПА), были разработаны ^{четыре.} Эти платформы обычно обеспечивают результаты быстрее и амплификации нуклеиновых кислот при более низкой температуре, одной, которая может быть выполнена с менее дорогой, простой оборудования. РПА, которое является особенно привлекательным для точка-в-ухода приложений, усиливает ДНК в минутах, требуется более низкая температура амплификации (37 ° С), и остается активным в присутствии примесей ^5,6. РПА анализы были разработаны для широкого спектра применений, в том числе анализа пищевых продуктов, обнаружения возбудителя, рак скрининга лекарственных средств, и выявления biothreat агентов ^{7 – 12.} Тем не менее, использование РПА для количественного определения нуклеиновых кислот была ограничена ^13,14.

В предыдущей работе, это было шоWn, что в режиме реального времени количественный РПА (QRPA) возможна ^15. Здесь более подробно протокол предназначен для использования в режиме реального времени количественный RPA количественно неизвестных образцов с использованием стандартной кривой, способ, аналогичный количественного использованием КПЦР. Этот протокол описывает, как выполнить реакцию РПА термоциклере для обнаружения ДНК ВИЧ-1, как доказательство правильности концепции, а также о том, как развивать внутренний положительный контроль (IPC), чтобы убедиться, что система функционирует нормально. Сбор данных с использованием амплификатор или микроскопа и анализа данных для построения стандартной кривой с использованием обучающих данных также подробно. Наконец, метод количественного неизвестных образцов, используя калибровочную кривую с помощью специального сценария показано. Этот метод дает количественное QRPA образцов с неизвестными концентрациями и имеет много преимуществ по сравнению с традиционными реального времени кПЦР.

Protocol

1. Программа термоциклер в режиме реального времени QRPA реакций

1. Создать новый протокол в программном обеспечении термоциклера.
   1. Вставьте предварительной инкубации шаг: 39 ° С в течение 1 мин.
   2. Добавьте второй шаг: 39 ° С в течение 20 сек с последующим пластинчатым чтения.
   3. Наконец, вставьте "Go To", которая повторяется второй шаг 59 несколько раз.
   4. Сохраните протокол.
2. Создайте новый пластину на вкладке "Редактор тарелка" программного обеспечения. Выберите скважин на пластине, соответствующие места РПА реакций (здесь, используют колодцы A1, A4-A8, B1 и B4-B8).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это не важно, указан ли тип образца из скважины (например, "Стандарт", "НТЦ"), а анализ данных выполняется с помощью пользовательского сценария.
   1. Для экспериментов, содержащих только ВИЧ-1 ДНК, выберите "HEX" флюорофор для всех скважин. Для экспериментов, содержащих ДНК ВИЧ-1 и внутренний положительный COуправляете, выберите оба "Hex" и "FAM" флуорофоры для всех скважин. Сохранить пластину.

2. Подготовка к ВИЧ-1 QRPA экспериментов

1. Соберите РПА реакции в указанном предварительного усиления рабочей содержащих назначение пипетки, наконечники, Vortexer, и мини-центрифуги, как и для количественной ПЦР. Как РПА может усилить одну копию ДНК на целых десять порядков (данные не показаны), ручка и распоряжаться пробирки, содержащие пост-продуктов амплификации ДНК в определенном районе после усиления.
   1. Избегать контакта между всеми Предварительное усиление реагентов и пост-продуктов амплификации. Спрей предварительной амплификации рабочие и оборудование с 50% хлорной до и после всех экспериментов. Используйте бумажное полотенце, чтобы вытирать излишки отбеливатель.
2. Покупка последовательность прямого праймера 5'-TGG CAG ТАТ TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3 'и обратного праймера 5'-CCC GAA AAT ТТТ GAA ТТТ ТТГ ТАА TTT GTT ТТТ G-3 'от коммерческих синтезаторов ДНК. Купить последовательность зонда 5'ТГК тат тат GTC TAC ТАТ TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [ТГФ] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C-3 'из коммерческих источников. Хранить все праймеры и зонды при 4 ° С в аликвотах при концентрации 10 мкМ до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: QRPA анализ усиливает уникальный ВИЧ-1 последовательности. Для этого доказательство правильности концепции анализа, использовать плазмиды pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr описанный Саттон и др., Который содержит последовательность-мишень ^16. Для QRPA экспериментов, плазмида хранили при 4 ° C в аликвотах, содержащих 1, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 и ⁴ копий в мкл в буфере, содержащем 10 мМ Трис, 0,1 мМ ЭДТА при рН 8,0, и 1 нг / мкл геномной ДНК человеческого носитель (360486). Эта концентрация ДНК-носитель эквивалентно концентрации ДНК, полученной из коммерческих наборов экстракции ДНК в сыворотке, используемых для ВИЧ-1 диагностики ^17. Эти ВИЧ-1разведения использовали в качестве матриц в QRPA реакций построить калибровочную кривую.

3. Соберите ВИЧ-1 QRPA стандартной кривой

1. Перед сборкой реакции QRPA, подготовить заранее амплификации рабочее пространство, как описано в стадии 2.1.1. Поместите 96-а холодный блок при хранении при 4 ° С.
2. Подготовка реагентов для 12 реакций:
   1. Перемещение ацетат магния, буфер регидратации и 12 РПА реакции гранул предварительно усиления рабочей области.
   2. Оттепель ацетат магния и буфер регидратации при комнатной температуре.
   3. Алиготе 32,5 мкл ацетата магния (2,5 мкл на реакцию) в микроцентрифужных трубки.
   4. Подготовка 13x мастер микс. Добавить 383,5 мкл буфера повторной гидратации (29,5 мкл на реакцию) в отдельную пробирку микроцентрифужных на мастер-смеси. Добавить 41,6 мкл нуклеазы свободной воды (3,2 мкл на реакцию) на мастер-микс. Vortex мастер микс.
   5. Вернуться к aceta магнияТе и регидратации буфером для хранения при -20 ° С.
   6. Перемещение праймеров и зондов аликвот из холодильника в области предварительного усиления, избегая чрезмерного воздействия света, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания.
   7. Добавить 27,3 мкл каждого из 10 мкМ прямого и обратного праймеров (2,1 мкл каждого праймера в реакции) к основной смеси.
   8. Добавить 7,8 мкл 10 мкМ HEX-меченных ВИЧ-1 ДНК-зондом (0,6 мкл на реакцию) на мастер-микс.
   9. Вернуться праймеров и зонда для хранения.
3. Соответствующие расположение пластины, описанной в разделе 1.2, разместить один фермент гранул в каждой из крайних левых трубок и один фермента гранул в каждой из 5 до нужных трубок 2 малоэтажных 8-а полос ПЦР трубки.
4. Осторожно добавляют 37,5 мкл основной смеси в каждую пробирку, содержащую фермент осадок, используя новый наконечник пипетки для каждой трубки и осторожном перемешивании в основной смеси и гранулы с наконечником, пока осадок не будет полностью растворится. Слегка помешивая, чтобы предотвратить пузырь formatiна, и снять наконечник осторожно, чтобы предотвратить потерю реакционного объема.
5. После того как все гранулы фермента были регидратации с мастер-смеси, получить 96-а холодный блок из 4 ° C хранения. Поместите полоски ПЦР-пробирку в холодную блока, чтобы охладить мастер микс.
6. В то время как мастер микс охлаждения, загрузите тепловой программного обеспечения ЦИКЛОВАТЕЛЬ с протоколом и к пластинке, описанной в разделе 1.
7. Вырезать 2 полоски прозрачной пластиковой клея микро-уплотнения, чтобы быть немного шире, чем пробирки для ПЦР, и получить 2 плоских ПЦР-пробирку полосы крышки.
8. Получить 6 аликвоты шаблона из хранилища (содержащие 0, 1, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^3, или 10 ⁴ копий ВИЧ-1 плазмиды в мкл).
9. Добавить 10 мкл каждого шаблона в пробирки, предназначенные для этой концентрации шаблона. Использование нового пипетки для каждой трубки, осторожном перемешивании раствора с наконечником для смешивания основной смеси и шаблона. Будьте уверены, чтобы добавить шаблон в нужном месте, чтобы мATCH макет табличке, описанной в разделе 1.2.
10. Убедитесь, что трубка полоса адаптера ПЦР для микроцентрифуге на месте.
11. Не включать 2,5 мкл ацетата магния в каждую крышку трубки, которые будут размещены на пробирку, содержащую реакцию QRPA.
12. Аккуратно крышки в верхней части пробирки ПЦР таким образом, что они не полностью закрытых и могут быть удалены. Ацетат магния будет придерживаться крышками и должны быть четко видны сверху.
13. Вставка каждую пробирку PCR полосу с крышками на каждой стороне держателя ПЦР трубки. Закройте крышку minifuge вращаться ацетат магния из крышек и в реакции РПА, инициируя реакцию РПА. Центрифуга, пока все пузырьки не будут устранены, и вся жидкость собирается в нижней части каждой трубы (10 сек).
14. Быстро удалить полоски ПЦР-пробирку и вернуть их в холодной блока, чтобы остановить реакцию QRPA.
15. Осторожно снимите крышки, чтобы предотвратить образование аэрозолей и печать каждую пробирку полоску ПЦР с разрезомкусочки прозрачного микро-уплотнения пленки.
16. Быстро ходить термоциклер и загрузить две полоски ПЦР трубки в термоциклер в местах, соответствующих расположение панели (колодцы A1-B8). Закройте крышку термоциклер, нажмите кнопку "Пуск Выполнить" и назначить имя файла для эксперимента.
    Примечание: Хотя производитель рекомендует перемешивание пробы через 5 мин инкубации, этот шаг не является необходимым для данного анализа и могут быть опущены.
17. После выполнения завершена, выберите "Настройки", "базовой линии", "Нет Вычитание", чтобы отобразить исходные данные флуоресценции. Экспортировать данные в программу электронных таблиц, выбрав "Экспорт", "Экспорт всех Паспорта для Excel." Файл с добавлениях "Количественное амплификации Результаты" будет создан, содержащий исходные данные флуоресценции в режиме реального времени.

4. Разработка положительного контроля внутреннего

1. Выбор ДНК-последовательность из вида, что вряд ли можно найти в целевом образца. Последовательность должна быть больше, чем целевой ампликона, так что генерация последовательности-мишени способствует.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого теста, Cryptosporidium parvum, паразит кишечника, была выбрана в качестве шаблона для генерации последовательности МПК, потому что этот организм вряд ли можно найти в крови и была доступна в лаборатории из другого проекта. Для создания последовательности IPC, извлечь и очистить ДНК из С. parvum ооцисты, как описано в другом месте ^18.
2. Покупка вперед (5'-TGG CAG ТАТ TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G / ATC ТАА GGA AGG CAG CAG GC-3 ') и обратном (5'-ССС GAA AAT ТТТ GAA ТТТ ТТГ ТАА ТТТ GTT ТТТ G / ТГК TGG AGT ATT CAA GGC АТА-3 ') праймеры из коммерческих источников. Праймеры ПЦР МПК, используемые в этом анализе, показаны на рисунке 1 и содержит одну область, которая является дополнением к шаблону МПК DNA (например, культуры C.parvum, фиолетовый на рисунке 1) и одном регионе, которую предлагается бесплатный организма-мишени (например, ВИЧ-1, синий на рисунке 1).
3. Выполнение ПЦР с использованием праймеров и матрицы ДНК IPC.
   1. Соберите 50 мкл реакции ПЦР с использованием набора реагентов Phusion High-Fidelity ДНК-полимеразы в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, за исключением полимеразы. Используйте 2 мкл ДНК-матрицы и Phusion буфера HF.
   2. Добавить полимеразу Phusion каждой реакции после горячей начала в 98 ° C, с последующим 60 сек при 98 ° С, с последующими 40 циклами по 15 сек при 98 ° С, 30 сек при 62 ° С, 30 сек и при 72 & deg; С с конечным удлинением при 72 ° С в течение 5 мин. После термоциклирования, удерживая температуру образцов 4 ° C.
   3. Анализ проб с помощью гель-электрофореза на 2% агарозном геле ТАЕ, а затем извлечь и очистить ДНК с использованием набора QIAquick Gel Extraction согласно протоколу микроцентрифужных входитКомплект.
4. Экран кандидатов МПК для их способность усиливать с помощью QRPA.
   1. Подготовка QRPA реакции, как описано в разделе 3, используя ВИЧ-1 праймеры, FAM-меченного зонда, специфического к МПК (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [ТГФ] T [DT-BHQ1 ] ГГТ ТТТ GTA АТТ GGA-3 '), и в общей сложности 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, 10 или ⁵ копий каждого МПК кандидата на реакцию, тестирование всех концентраций в дубликатах.
   2. Выберите кандидата IPC, который усиливает наиболее последовательно и имеет нижний предел-Of-обнаружения.
5. Co-амплификации ВИЧ-1 и МПК для определения оптимальной концентрации МПК ДНК.
   1. Как и в разделе 3, объединить следующие в каждой реакции 50 мкл: 29,5 мкл буфера повторной гидратации, 2,1 мкл РПА из прямого праймера [10 мкМ], 2,1 мкл РПА обратного праймера [10 мкМ], 0,6 мкл ВИЧ-1 HEX меченных зонда [10 мкМ], 10 мклВИЧ-1 ДНК при различных концентрациях, 2,5 мкл ацетата магния, и один фермент таблетки. Вместо добавления 3,2 мкл нуклеазы свободной воды, как это делалось на шаге 3.2.4, добавить 0,6 мкл МПК FAM-меченного зонда [10 мкМ] и 2,6 мкл ДНК МПК. Использование концентрации МПК, которое предельно из обнаружения (LOD) при QRPA выполняется с только ДНК МПК (LOD определяется как самую низкую концентрацию, где количество генерации сигнала флуоресценции, что больше, чем от флуоресценции, генерируемого образцов с нет ДНК-мишень).
   2. Выдержите образцы, используя протокол, описанный в разделе 1.1.
   3. Если IPC не усиливает в каждом образце, попробуйте повторить эксперимент с МПК концентрация на порядок выше. Оптимальная концентрация ДНК МПК для ВИЧ-1 анализа 10000 копий / мкл. В то время как образцы считаются действительными, если есть или IPC или ВИЧ-1 амплификации ДНК, в идеале IPC имеет обнаруживаемого усиление длякаждый реакция.

5. Построение стандартной кривой из нескольких экспериментов

1. Убедитесь, что данные для каждого эксперимента были экспортированы в программу электронных таблиц, как описано в разделе 3.13.
2. Открыть и запустить скрипт "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Все входы автоматически предлагается в окне командной строки. После того как сценарий инициируется, пользователь автоматически будет предложено назначить "Количество файлов данных" используется для построения стандартной кривой.
3. В окне командной строки введите число файлов, которые будут использоваться для построения стандартной кривой и нажмите клавишу ВВОД.
4. Введите в окне командной количество образцов и количество повторов в каждом учебном файла (нажимая клавишу ВВОД после каждой записи).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В макете пластины, описанной в разделе 1.2, было 6 образцов с различными концентрациями и 2 повторов каждого образца).
5. Введите в командной строке низкая DNКонцентрация используется для построения стандартной кривой (в log10 копий) и нажмите Enter (для расположения плиты, описанной в разделе 1.2, низкая концентрация шаблон '1' log10 копий).
6. Введите в окне командной строки разница в концентрации между каждого стандарта (в log10 копий), затем нажмите Enter (для расположения плиты, описанной в разделе 1.2, концентрационный интервал равен '1' log10 копий).
7. После запроса введите «Скат порог" в окне командной и нажмите клавишу ВВОД.
8. В окне командной строки введите "Номер (г) стандартных отклонения выше фона для позитивного порога", а затем нажмите клавишу ВВОД. Типичные значения для диапазона г от 1 до 5.
9. Укажите было собрано данных с использованием термоциклер ('1'), * .tiff микроскопе ('2'), или * .jpg микроскопе ('3'), набрав номер «1, '' 2 ' или "3", а рressing войти.
10. Выберите, чтобы установить новый порог IPC или использовать значение по умолчанию для порога, набрав 'Y' или 'N,' соответственно, при запросе.
11. Далее, выберите каждый из файлов электронных таблиц, используемых для построения калибровочной кривой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: скрипт будет автоматически импортировать данные HEX и флуоресценции FAM; определить, является ли каждая реакция была действительна (т.е. является ли сигналы флуоресценции превысили пороговые значения для шестигранных или ФАМ каналов); определить коэффициент R ² для экспоненциальной, линейной, а полином второго порядка нужным; Сюжет "log10 копий в сравнении с порога цикла" для каждого образца, используемого для создания стандартной кривой; и создать файл электронной таблицы, содержащий существенные переменные, чтобы восстановить стандартную кривую для экспериментов проверки не требуя от пользователя повторно ввести все входные параметры.

6. Анализ проверки и количественной оценки неизвестных образцов с использованиемСтандартная кривая

1. Используйте скрипт "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m", чтобы оценить точность и точность анализа с использованием образцов с известными концентрациями или использовать его для количественной оценки образцов с неизвестными концентрациями.
   Примечание: Поскольку ранее опубликованных исследований показали, что экспоненциальный подходит дали лучший R-квадрат коэффициента ^18, этот сценарий использует экспоненциальное, пригодный для стандартной кривой. Если другой тип посадки желательно, сценарий может быть изменен соответствующим образом.
   1. Открыть и запустить скрипт "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". После того как сценарий инициируется, пользователь автоматически ввести все входы в окне командной строки.
   2. Введите '1' для проверки по результатам анализа с использованием стандартной кривой с известными концентрациями образца или ввести '2', чтобы количественно неизвестных образцов.
   3. При появлении запроса либо выбрать сохраненный стандартную кривую или построить новый, введя йе информация, автоматически запросил в окне команд (та же информация, что требуется для "JoVE_qRPA_standard_curve.m" сценарий из раздела 5).
   4. Введите число экспериментов (то есть, файлы электронных таблиц), чтобы проанализировать для проверки / количественной оценке.

7. Подготовка к сбору данных с использованием флуоресцентного микроскопа и подогревом Chip

1. Убедитесь, флуоресцентный микроскоп имеет этап нагреватель и регулятор температуры 1-канальный высокой точностью стабильности на месте.
2. Убедитесь, что флуоресцентный микроскоп имеет куб фильтра для возбуждения и собирать флуоресценции от каждого флуорофора. Excite и собирать FAM флуоресценции генерируется в процессе амплификации IPC ДНК через GFP фильтр (возбуждение BP 470/40 нм, эмиссия BP 520/50 нм). Excite и собирать HEX флуоресценции, генерируемого во время ВИЧ-1 амплификации ДНК через HEX фильтра (возбуждение BP 530/30 нм, эмиссия BP 575/40 нм).
3. Используйте программное обеспечение для редактирования скрипт микроскопом, чтобы создать автоматизированную алгоритм для репликации данных для сбора на термоциклер.
   1. Во-первых вставить "Настройки" шаг, чтобы закрыть затвор. Затем добавьте в "экспозиции" шаг, чтобы установить экспозицию до 60 сек. Вставьте "Привязать", чтобы выполнить задержку 60 сек, который реализует 1-минутного периода предварительной инкубации. Добавить "Настройка" шаг, чтобы изменить рабочую группу с GFP фильтра. Вставьте другой «экспозиции» шаг, чтобы настроить экспозицию до 200 мс. Все экспозиции с помощью GFP или фильтр кубики HEX будет установлен в 200 мс.
   2. После «разоблачения» шагом, добавить "Привязка" и указать камеру, с которой будет принято изображения. Используйте другой "Настройка" шаг, чтобы закрыть затвор и "Сохранить изображение" шаг, чтобы сохранить изображение на временную папку, определенного пользователем.
   3. Следующая переключатель в кубе HEX фильтра с помощью другого "Настройка" шаг и еан добавить «экспозиции» на 200 мс, "Привязка", и "Сохранить изображение" шагом.
   4. Повторите эту процедуру 59 раз с первоначальной задержкой 20 сек, вместо 60 (закрывающегося затвора, подождите 20 сек, переключатель GFP фильтра куба, установите контакт с 200 мс, оснастки, недалеко затвора, сохранять, переключатель HEX фильтра куба, установить экспозицию 200 мс, оснастки).
4. Создать чип, который будет содержать QRPA реакции.
   1. Для экспериментов с использованием микроскопа, используйте файл JoVE_qRPA_base.ai вырезать прямоугольное основание 40 х 15 мм из листа толщиной 1/8 "черной акриловой помощью лазерного резака устанавливается на 100% мощности, скорости на 10%.
   2. Используйте файл JoVE_qRPA_well.ai сократить реакцию и состоящий из 10 х 10 мм площади в с диаметром 5 мм вырезать круглое отверстие из листа толщиной 1,5 мм прозрачный акрил.
   3. Прикрепите до трех скважин на единой базе, используя суперклей гель.
   4. Сухой ночь.

8. Сбор и ана данныхSIS с помощью флуоресцентного микроскопа

1. Подготовьте микроскоп для сбора данных при загрузке сценарий автоматической сбора данных JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. Установите этапа нагреватель до 48 ° С и подогрева чип реакции на стадии нагревателя около 20 мин. Установка температуры 48 ° С поддерживает температуру 39 ° С в реакции а (данные не показаны).
   2. Использование 10X, 0,45 NA цели, сосредоточиться на верхней части внутренней кромки реакции также с GFP фильтр на место. Края акрила autofluorescent после лазерной резки и может быть легко визуализировать. После фокусировки, не регулировать высоту столике микроскопа, пока все данные не будут собраны.
2. Сборка основной смеси QRPA в указанном предварительной амплификации рабочей как описано в стадии 4.5.1. Для каждого образца, смешать фермента гранул, основной смеси, а также ВИЧ-1 ДНК-матрицы в микроцентрифужных трубки. Добавить 2,5 мкл ацетата магния в первом reactioп и кратко вихрь.
3. Быстро транспортировки микроцентрифужную трубки, содержащей образец QRPA к флуоресцентным микроскопом.
   1. Тщательно пипетки 30 мкл реакционной РПА в реакции также без создания пузырьков. Поместите каплю ПЦР-минерального масла марки по поводу реакции РПА, чтобы предотвратить испарение.
   2. Расположите ну прямо под объектив микроскопа, заботясь, чтобы только изображение центра Ну, не любой из авто-флуоресцентный акриловых края. После хорошо позиционируется, запустите скрипт автоматизации 7. скрипт генерирует одно изображение в формате JPEG с использованием куб фильтра FAM и одно изображение в формате JPEG с использованием куб HEX фильтр через каждые 20 сек.
4. После сценарий будет завершен, передавать эти изображения из папки временного хранения перед запуском дополнительных образцов.
   1. Создание 2 папки: 1 для каждого флуорофора (т.е. "HEX" и "FAM"). Храните обе папки в том же родительской папки. В каждом флуорофорапапки, создавать папки, меченного числа копий ДНК, присутствующих в образце (например, 0, 10, и т.д.).
   2. Перенесите все файлы с префиксом "HEX" в соответствующую вложенную папку в папке "HEX". Перенесите все файлы с префиксом "GFP" в соответствующую вложенную папку в папке "FAM".
5. Повторите Разделы 8.2-8.4 для QRPA реакциях с 0, 10, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, и 10 ⁵ ВИЧ-1 ДНК-копий.
6. После сбора данных для всех образцов QRPA в эксперименте, загрузить сценарий "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." В ответ на сценарий, выберите родительскую папку, содержащую 2 флуорофорные папки, которые в свою очередь содержат изображения для каждой концентрации во вложенных папках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: скрипт будет автоматически генерировать файл электронной таблицы в родительском каталоге, в котором данные флуоресценции HEX будет сохранен в листовой ДНЭд 'HEX', и данные флуоресценции FAM будут сохранены в листе с именем "FAM". В каждом листе, номер цикла указан в столбце В, и данные флуоресценции в режиме реального времени для повышения концентрации шаблона приведены в столбцах C, D, и т.д.. Каждый реальном времени флуоресценции данное есть средняя интенсивность флуоресценции изображения, захваченного в тот момент времени.
7. Используйте функцию печати по умолчанию разброс в программе электронных таблиц для построения ячейки B2: H61 в "HEX" и "ФАМ" листов для визуализации флуоресценции в режиме реального времени и генерировать графики, аналогичные тем, на рисунках 2а, 2b, 3а, и 3В.
   Примечание: таблицы, полученной на этапе 8,6 могут быть также использованы в сценарии "JoVE_qRPA_standard_curve.m" и "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Representative Results

Discussion

Для того, чтобы получить значимые данные количественной с использованием алгоритма MATLAB, пользователь должен выбрать соответствующие значения входного сигнала, когда будет предложено. После начала каждого сценария в разделах 5 и 6, все входные переменные автоматически запросил в окне командной и выходы создаются автоматически. В разделе 5.7 пользователю будет предложено выбрать порог наклона. Значение порога наклона влияет на квадрат коэффициента корреляции (R ^2), фита. При использовании необработанных данных флуоресценции, экспортированные из термоциклер, значения между 2,0 и 5,0, как правило, дают высокий коэффициент R ^2. В разделе 5.8 пользователь должен указать количество стандартных отклонений над фоном, чтобы установить положительный порог. Чтобы оценка образец как положительным, так и отрицательным, скрипт автоматически определяет разница Δ _{образец} между максимальной и минимальной флуоресценции для каждого образца, используя исходные данные флуоресценции экспортируемые из Термал велосипедист. Он рассчитывает среднюю разницу Δ _фона и стандартное отклонение σ _фона для контрольных образцов все не-мишени. Проба считается положительной, если _{образец} Δ более чем г × σ _фоне выше Δ _фоне. В разделе 5.10 пользователь решает, следует ли использовать пороговое значение по умолчанию или установить новый порог. Если пользователь желает установить новый порог, определяет новый порог экспериментально путем выполнения 3 экспериментов каждый из которых содержит 12 RPA реакций без какой-либо ВИЧ-1 ДНК, присутствующей. Установите порог в среднем увеличение интенсивности флуоресценции от этих экспериментов плюс 3 стандартных отклонений. После заполнения Раздела 6, сценарий JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m автоматически возвращает Предполагаемая концентрация ДНК каждой реакции QRPA (в log10 копий). Если сценарий определяет, что ВИЧ-1 ДНК не присутствует в образце, по оценкам концентрации указаны либо как "Negative на ВИЧ "или" недействительно, "в зависимости от того флуоресцентного сигнала для внутреннего положительного контроля превысил порог (г × σ _фоне + Δ _фоне). Если пользователь проверки при помощи стандартной кривой известных концентраций образцов, сценарий будет также возвращать дополнительную таблицу, аналогичную таблице 1.

В целях развития в реальном времени РПА анализа, который обеспечивает точную количественную оценку, экспериментальная последовательность имеет решающее значение. Например, можно использовать одни и те же праймеров и зондов аликвот как для стандартной кривой и проверочные эксперименты. Также следует избегать циклов замораживания-оттаивания, сохраняя праймеров и зондов аликвот при 4 ° С между экспериментами, а не -20 ° С. Аликвоты шаблон, используемый для стандартной кривой и проверки экспериментов хранятся в том же порядке. РПА ферментов гранулы и реагенты из одной партии используются в соответствии с рекомендациями производителя. Наконец, Бекаиспользовать РПА не хватает истинных "циклов", чтобы точно контролировать скорость усиления, стандартизация пользователем шагов абсолютно необходимо. При сборке реакции, пользователь всегда должен выполнить те же действия в том же порядке, тратя примерно такое же количество времени на каждом этапе. Реакции всегда должны быть смешаны осторожно нового наконечника пипетки, и пузыри всегда должны быть устранены. Перед усиления реакции должны быть проведены при стабильной температуре и термоциклер или микроскоп программное обеспечение всегда должны быть готовы перед загрузкой реакции, чтобы избежать каких-либо усиление на неоптимальных температурах, которые могут повлиять на количественную. Любое изменение в начальных условиях реакции могут привести к несогласованности в экспериментальных результатов.

При использовании микроскопа для сбора данных, дополнительные переменные должны контролироваться, чтобы свести к минимуму изменение интенсивности флуоресценции. Все реакции должны быть размещены в том же регионе на сцене теплее, и microscoPE должно быть сосредоточено на том же регионе скважины для каждого образца. Даже если эти методы следуют данные флуоресценции, полученные на микроскопе могут проявлять изменчивость из-за местных ярких пятен, которые, естественно, образующихся при РПА реакций, образования пузырьков в реакционной камеры, или фотовыцветания в результате многократного воздействия возбуждающего света. Влияние этих переменных очевидно в данных флуоресценции собранных на микроскопе (фиг.4А и 4В), которые демонстрируют базовой изменчивость, пики и впадины,. Эти особенности отсутствуют данные флуоресценции собранных на термоциклере (Фигуры 3А и 3В). В конечном счете, сбор данных на микроскопе только для доказательства правильности принципа целях и окончательный анализ будет осуществляться на местах, в рабочем флуоресценции читателя с более точной геометрией и программного управления, которая минимизирует эти переменные.

Еще одним важнымаспектом процесса развития анализа QRPA является последовательность в обработке данных. Протокол, описанный в разделе Методы использует сценарии для обработки исходных данных флуоресценции (сохраненные в файле электронной таблицы), полученные от термоциклере или микроскопа. Все эксперименты, используемые для построения калибровочной кривой должен быть отформатирован идентично. При использовании амплификатор для сбора данных, то же самое расположение пластины должны быть использованы, и данные из скважин, которые не содержат РПА реакции не должна быть экспортирована. При использовании микроскопа для сбора данных, формат данных должен соответствовать формату данных автоматически экспортируются из термоциклер. Например, данные не-мишени управления должно находиться в клетках C2: C61, а также данные для повышения концентрации шаблона должно быть в клетках D2: D61, Е2: Е61 и т.д. Если имеется несколько повторов каждой концентрации в эксперименте, Серия разбавления ^2-й повторить заказываются слева направо ни от целевой контроля (NTC) до самой высокой концентрации исохранены в столбцах непосредственно справа от ^1-го репликации серии разведений. Например, в схеме пластины, используемой в разделе 1.2 с 2 повторяет для каждого образца, данные флуоресценции на первой повторности каждого образца в серии разведений должно быть сохранено в клетках С2: H61 и флуоресценции данных для второго репликации каждого образца в серийные разведения должны быть сохранены в ячейках I2: N61. Для компоновки пластины, используемой в разделе 1.2, это форматирование по умолчанию при экспорте данных из термоциклера программного обеспечения для электронной таблицы.

Представительства данные, предоставляемые ВИЧ-1 QRPA экспериментов показывают доказательство правильности концепции поддержки РПА может быть использована для количественного определения концентрации нуклеиновой кислоты в исследуемом образце. Клинически полезные ВИЧ-1 вирусной нагрузки у клинический спектр, по крайней мере на 4 порядка, точность 0,5 log10 копий и предельно-о-обнаружение, по меньшей мере 200 экземпляров ^19,20. ВИЧ-1 Анализ ДНК описано отвечает этим крiteria и наиболее точным при низких концентрациях, как показано в таблице 1. Таким образом, с включением в обратной транскриптазы стадии, эти результаты свидетельствуют о том, что анализ на ВИЧ-1-RT РПА может иметь потенциал для измерения ВИЧ-1 вирусной нагрузки в клинические образцы. При разработке анализа QRPA, настройке параметров алгоритм может настроить чувствительность и динамический диапазон линейной зависимости от клинических нужд. Рисунок 6 показывает, что регулирование г (параметр, который определяет порог положительных образцов) может влиять на чувствительность и точность при низких и высоких Целевые концентрации. Кроме того, это может быть возможным, чтобы увеличить разрешение и точность определения количества путем инкубации реакцию при более низкой температуре или с использованием меньшего ацетат магния, тем самым уменьшая скорость амплификации.

Это доказательство концепции QRPA анализа могут быть использованы для количественной оценки концентрации образцов, содержащих ДНК ВИЧ-1. QRPA анализа, описанного в этом маnuscript включает в себя подробные инструкции о том, чтобы собрать реакции РПА в режиме реального времени, разрабатывать и экранировать IPC, и обрабатывать исходные данные флуоресценции для построения стандартной кривой, которая может быть использована для количественной оценки неизвестных образцов. С подробные инструкции включены, этот протокол может быть адаптирован для количественного концентрацию ДНК в различных образцов.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI