Методическая статья

Lepr

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52632

⸱

11 мая 2015 г.

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем здесь протокол выделения островков из мышиной модели диабета 2 типа, Leprdb и детали анализа живых клеток для измерения секреции инсулина из интактных островков, который использует 2-фотонную микроскопию.

Аннотация

Сахарный диабет 2 типа является хроническим заболеванием, поражающим 382 млн человек в 2013 году, и, как ожидается, возрастет до 592 млн к 2035 году 1. В течение последних 2 лет, роль дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа был четко определен 2. Исследования прогресс требуется методов выделения панкреатических островков. Протокол выделения островков, представленные здесь много общих шагов с протоколами от других групп, с некоторыми изменениями, чтобы улучшить урожайность и качество отдельных островков как из дикого типа и диабетической Lepr дБ (дБ / дБ) мышей. Способ визуализации 2-фотонов живых клеток затем представлены, которые могут быть использованы для исследования контроль секреции инсулина в течение островков.

Введение

Роль дисфункции бета-клеток при болезни была широко признана 3,4. Клеточные линии, такие как MIN6 и INS-1 являются полезными инструментами, чтобы понять биологию поведения бета-клеток. Тем не менее, физиологический контроль секреции инсулина происходит в островках Лангерганса. Эти островки содержат тысячи плотно упакованных бета-клеток, а также кровеносные сосуды и другие эндокринные типы клеток. Эта среда в островок влияет секрецию инсулина и, вероятно, будет важным при диабете. Поэтому, чтобы понять физиологический контроль секреции инсулина и патофизиологии болезни, важно, чтобы изучить интактные островки.

Изоляция Островок

Живые человеческие островки и, в частности, человека островков от пациентов с диабетом типа 2 трудно получить. Кроме того, человека островки имеют ограниченные возможности для экспериментального молекулярной манипуляции. Исследователи поэтому используется впозволяет от животных и животных моделях диабета 2 типа. Одной из таких моделей болезнь дБ / дБ мыши. Это спонтанных мутаций, что модели сахарного диабета 2 типа с прогрессированием фенотипа, что тесно параллели болезни человека 5,6. Протокол, представленные здесь для изоляции островок с сахарным диабетом дБ / дБ мышей имеет много шагов, общих с другими группами с некоторыми уточнениями для лучшего урожая, очистки и расширения выживания островков.

Изображения 2 фотона

Живых клеток 2-фотон анализа, описанного здесь позволяет исследователям определить число и оценить характеристики отдельных инсулина гранул, содержащих от многих клетках диабетическая 7 и дикого типа островков 8,9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все присутствующие были проведены эксперименты в соответствии с местными этики животных процедур в Университете Квинсленда (утвержденных в Университете Квинсленда, комитета по этике биологических наук Анатомические).

1. Островок Изоляция

  1. Подготовка реагентов
    1. Смесь ферментов
      1. Для поджелудочной пищеварение, использовать смесь Liberase и коллагеназы типа IV. Развести Liberase TL (низкий) термолизин 1 флакона 5 мг с 26 мл DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко).
      2. Подготовьте коллагеназы типа IV в буфере Хенкса до концентрации 0,5 мг / мл, с добавлением 5 мМ HEPES, 0,5 мМ CaCl 2, 0,1 мг / мл ДНКазы и 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина.
      3. Смешайте Liberase TL и коллагеназу решения в соотношении 4: 1 (по объему), т.е., 4 мл Liberase TL + 1 мл коллагеназы. Алиготе смесь ферментов 2,5 мл каждая и хранить при температуре -20 ° C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации ткани VАры немного между партиями фермента (разница 30 сек до 1 мин). Таким образом, пробная партия может потребоваться.
    2. RPMI Выделение СМИ
      1. Растворите один флакон RPMI 1640 порошка в 1 л воды при комнатной температуре и дополнить 2 г NaHCO 3, 4,02 г HEPES.
      2. Смешайте изоляции носитель RPMI в большом коническую колбу, смешать с магнитной мешалкой, доведения рН до 7,4 с помощью NaOH, фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С.
    3. RPMI Культура Медиа
    4. Использование культуральной среды RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотиков (т.е., пенициллин 100 ед / мл, стрептомицин 100 мкг / мл).
  2. Островок изоляции и культивирования
    1. Жертвоприношение животных
      1. Жертвоприношение мышей от рака шейки дислокации или CO 2 удушья в соответствии с процедурами, этики местного учреждения. Спрей тело мыши тщательно с 70% этанола.
    2. Поджелудочной перфузии
      1. USE 2 длинных сокращений сбоку через кожу живота и брюшину, чтобы сделать V-образный клапан. Потяните лоскут кожи до раскрыть всю полость живота, отложить в сторону кишечника и держать печень в месте сложенном папиросной бумаги, чтобы раскрыть общий желчный проток (рис 1 и 2). Положите животное так, чтобы голова к хирургу и хвост от хирурга.
      2. Нанесите сосудистой зажим на ампулы на стене двенадцатиперстной блокировать ферменты инъекционные въезд в двенадцатиперстную кишку (рисунок 1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг, поскольку он определяет, будет ли введенные ферменты идти в проток поджелудочной железы и заливать поджелудочной железы или рефлюкс в месте инъекции (более зажим) или перейти в двенадцатиперстной кишке (при зажиме).
      3. Иглу общего желчного протока с 31 G иглой недалеко от перекрестка общего печеночного протока и пузырного протока (рис 1) и оставить место для второй инъекции, если йе поджелудочная железа не заливать в первый раз. Медленно (в течение ~ 10 сек) вводят около 2 мл холодной смеси ферментов в мыши общий желчный проток.
        ПРИМЕЧАНИЕ: поджелудочная железа будет озарен быстро, если зажим в нужном положении.
      4. Отрегулируйте положение зажима, если игла находится внутри общего желчного протока, но не может заливать поджелудочной железы (т.е.., Двигаться вверх зажим немного от печени, если в течение зажат или переместить его немного в печени, если под зажат).
        Примечание: Игла иногда переходит в окружающей капсулу, а не в просвет протока. Полезно знак, чтобы проверить игла находится внутри общего желчного протока является расширение протока при введении. Если поджелудочная железа не заливать, альтернативой является смесь ферментов может быть введен в нескольких участках поджелудочной железы с низким выходом ожидаемого. Перфузии левого участка поджелудочной железы (селезенки доли) имеет важное значение для максимизации выхода островков.
      5. После поджелудочной железы рerfused, быстро удалить поджелудочную железу, положить его в пробирку (~ 20 мл, стеклянный) и инкубировать в течение ~ 19 мин в водяной бане при 37 °.
        ПРИМЕЧАНИЕ: время инкубации может немного отличаться в зависимости от штамма мыши и возраста.
      6. После инкубационного периода, остановить процесс пищеварения, добавляя ~ 20 мл холодной изоляции сред. Встряхнуть флакон нежно сорвать поджелудочную железу и залить его через обычный чай сито (диаметр пор 1 мм) в стерильную пробирку 50 мл. Пополните трубку с изолирующими средствами массовой информации и центрифуги при 400 мкг в течение 1 мин при 4 ° С с тормозом выкл.
      7. Растворить осадок в изоляции сред снова и передать до двух 15 мл пробирки, затем центрифуги при 400 мкг в течение 1 мин при 4 ° С с вынул. После аспирации супернатант, смешайте две гранулы хорошо с 6 мл разделения градиента плотности клеток СМИ (Histopaque 1077 раствор) в трубке встряхиванием или пипетки вверх и вниз. Затем осторожно добавить ~ 6 мл изоляции сред к стороне трубки сверхуСМИ разделения градиент плотности и центрифуги при 100 мкг в течение 15 мин при 4 ° С с тормозом выкл.
      8. Соберите супернатант в верхнем (изоляции), средств массовой информации средний и нижний (градиент плотности клеток СМИ разделения) слой в 3 отдельных блюд. Handpick островки в этих 3 блюд, с помощью пипетки при вскрытии микроскопом.
        Примечание: средний слой содержит большую часть островков. Островки признаются компактных структур ~ 50 до 500 мкм в размере (рисунок 3). Мы получим ~ 200 островков у мышей дикого и 300- <100 островков в БД / DB мышей.
    3. Островок Культивирование
      1. Чтобы помочь островки восстановиться после ферментативного расщепления, культуры группы 40 островков в 25 см чашки Петри с 6 мл культуральной среды RPMI (10 мМ глюкозы) при 37 ° С, 5% / 95% СО 2 / О 2 в течение 2 дней перед живой -клетка 2-Фотон изображений. Изменение питательных сред в день.

2, Живая ячейка 2-Фотон изображений

  1. Подготовка реагентов
    1. Внеклеточной буфера
      1. Подготовка натрия богатых внеклеточного буфера для 2-фотонного анализа с 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 5 мМ NaHCO 3 и 10 мм HEPES.
    2. Внеклеточной красителя
      1. Для 2-фотонного анализа, подготовки акций SRB 8 мм внеклеточного буфера, Алиготе в трубочки и хранить при температуре -20 ° C. Развести фондовом SRB 1:10 в свежем внеклеточного буфера, чтобы получить рабочую концентрацию 0,8 мм.
  2. Фотон изображений
    1. Во-первых, предварительно инкубируют 2-дневные культивируемые островки в 3 мМ глюкозы внеклеточного буфера в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем островки между 2 и 5 дней в культуре.
    2. Затем поместите предметное стекло на термо-контрольной камеры установленного на столике микроскопа. Использование смазки, чтобы предотвратить утечку раствора.
    3. Обложка камеру с 500 мкл extracellулар буфер, содержащий 0,8 мМ SRB с различными концентрациями глюкозы (3 мм, 6 мм, 15 мм и 20 мМ глюкозы).
    4. Далее, поместите предварительно инкубировали островок в середине камеры и фокус на 3-4 слоев клеток в островке, где, в грызунов островков, иммунным к инсулину показывает, что большинство клеток в бета-клетки.
      Примечание: SRB будут изложены все клеточную мембрану островок быстро и островок готов изображения.
    5. Используйте 2-фотонной микроскопии с 60X иммерсионным объективом (NA 1,42) и изображений (например., ScanImage 11). Рисунок 4 иллюстрирует типичное расположение микроскопии. Image exocytic события, используя SRB в качестве мембраны impermeant флуоресцентный маркер внеклеточного возбуждается фемтосекундных лазерных импульсов на 880 нм, с флуоресценции обнаружена на 550-650 нм. Запишите островковых ответов на стимуляцию.
    6. Определить отдельные exocytic события внезапным появлением небольшого флуоресцентного месте (разрешение 10 пикселей /1; м) и подтвердить с помощью быстрый рост фазы флуоресцентного сигнала по области интереса (~ 0,78 мкм 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Островок выход и очистка

Для нормальной мыши дикого типа, около 200 островков, как ожидается. Здоровые островки выглядят ярко, круглой формы и иметь гладкую границу. Над усваивается изоляция партия, как правило, имеет небольшие островки и нечеткие, а под усваивается партия имеет меньше островков и островков клеток прилагается ацинарные (рисунок 3). Для диабетических дБ / дБ мышей, выход островок и внешний вид зависит от прогрессирования заболевания с лучшими гликемический мы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важным фактором в изоляции островков является начальным перфузии поджелудочной железы; под перфузии поджелудочной железы приводит к значительно более низким выходом островков. Другие факторы также влияют на качество изоляции, таких как время варки и уровнем встряхивании, которые могут частично компенсировать уровень перфузии. Например, полностью перфузии поджелудочной железы необходимо будет инкубировали при 37 ° С в течение ~ 18 мин 30 сек при встряхивании осторожно, в отличие под переваривается поджелудочной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Австралийского исследовательского совета DP110100642 (PT) и грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям APP1002520 и APP1059426 (PT и HYG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Liberase TL 5 мгRoche-5401020001
Коллагеназа типа IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 млSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1LSigma AldrichR1383для приготовления изоляционных сред
RPMI 1640 (1x) 500 млGibco-Life Technologies21870-076для приготовления кисломолочных сред
Пенициллин-Стрептомицин 100 млGibco-Life Technologies15140-122для приготовления культивируемых сред 
Фетальная бычья сыворотка 500 млGibco-Life Technologies10099-141для приготовления культивируемых сред
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco-Life Technologies11966-025для разбавления либеразы
Metamorph программаMolecular Devices, СШАдля анализа 2-фотонных изображений

Ссылки

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lepr dbSRB

Похожие статьи