Method Article

Простой основе полиакриламида многолуночные Жесткость Анализ по изучению жесткости зависимых клеточных ответов

DOI:

10.3791/52643

⸱

March 25th, 2015

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описывается метод, который позволяет быстро, эффективно и недорого получать полиакриламидные гели в формате многолуночных планшетов. Метод не требует специального оборудования и может быть легко принят любой исследовательской лабораторией. Это было бы особенно полезно в исследованиях, направленных на понимание реакций клеток, зависящих от жесткости.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время большая часть исследований клеток in vitro выполняется на полистироле с жесткой культурой тканей (~1 ГПа), в то время как большинство клеток в организме прикреплены к матрице, которая эластична и намного мягче (0,1 – 100 кПа). Поскольку такое несоответствие жесткости сильно влияет на реакцию клеток, существует большой интерес к разработке гидрогелевых материалов, которые охватывают широкий диапазон жесткости и служат в качестве клеточных субстратов. Полиакриламидные гели, которые являются недорогими и охватывают диапазон жесткости всех мягких тканей в организме, являются гидрогелем выбора для многих исследовательских групп. Однако приготовление полиакриламидного геля является длительным, утомительным и подходит только для небольших партий. В данной статье мы описываем анализ, в котором за счет использования постоянной гибкой пластиковой пленки в качестве структурной основы для гелей можно получать полиакриламидные гели в формате многолуночных планшетов. Этот метод быстрее, эффективнее и дешевле существующих методов и позволяет получать гели нестандартных размеров, которые в противном случае недоступны. Поскольку он не требует какого-либо специализированного оборудования, метод может быть легко принят любой исследовательской лабораторией и будет особенно полезен в исследованиях, направленных на понимание реакций клеток, зависящих от жесткости.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство тканей в организме мягкие вязкоупругие материалы с модулем Юнга в диапазоне от 0,1 кПа в течение мозга до 100 кПа для мягкой хряща, не менее, большинство в исследовании клеток пробирке осуществляется на тканевой культуры полистирола (TCP), который имеет модуль ~ 1 ГПа . 1 Это жесткость несоответствие значительно влияет на способ клетки реагируют на их среду. Все больше исследований, таким образом, посвященный выяснению влияния подложки жесткости на судьбу клеток разных типов, 2,3 в том числе стволовых клеток. 4 В результате, несколько гидрогели были разработаны, чтобы помочь в понимании жесткости в зависимости от клетки биологии, включая полиакриламид (РА), 5-7 полиэтиленгликоль (ПЭГ), 8,9 полидиметилсилоксана (ПДМС), 10 и альгината. 11 В то время как свидетельство того, что субстрат жесткости имеет существенное влияние на судьбы клеток растет, большинство исследований проводятся на малого масштаба с небольшим количеством секamples. Систематические, многомерные исследования о влиянии подложки жесткости для массива типов клеток и условий окружающей среды редки. 12

Несколько перспективных технологий гидрогелевые высокой пропускной были разработаны, в том числе на основе ПЭГ-микрочипов, 13 микрофлюидных устройств для производства агарозы гидрогеля микросфер, 14 или микро и нано-стержней, в которой жесткость модулируется по диаметру и высоте microrods. 15 Однако , технологии для подготовки таких субстратов являются сложными и доступны для ограниченного числа лабораторий. Многие исследования с участием жесткости модулируется клеточные реакции использует полиакриламид (ПА) гели, которые являются не только недорогим и простым в реализации, но также обладают физиологически соответствующем диапазоне модуля Юнга, а именно 0,3 -. 300 кПа 16-22 Однако, существующие методы для изготовления PA гели для клеточной культуры являются трудоемкими и, следовательно, подготовительныеared небольшими партиями. Некоторые из трудностей, связанных с подготовкой PA гелей как клеточных субстратов вытекают из требований, что гели должны быть подготовлены: 1) в отсутствие кислорода, чтобы позволить полную полимеризацию, 2) с плоской и гладкой поверхностью, чтобы обеспечить равномерное клетку Крепление и распространение, и 3) постоянно прикреплена к нижней части клетки культуральной чашке, чтобы предотвратить плавающей.

Несколько групп пытались производить PA гели для клеточной культуры в больших партиях. Semler и др. Подготовленные листы толщиной ПА гелей, которые были тогда "вырезать" с дыроколом и размещены в 96-луночных планшетах. 23 Тем не менее, этот метод ограничен жесткими гелей, т.е.> 1 кПа модуля Юнга, потому что мягче гели "липкий", трудно резать, и легко повреждены. Mih др. Разработали более сложный метод, который позволяет гели быть непосредственно полимеризованы в стеклянным дном многоямного пластины. 6 Это было достигнуто путем заливки решения геля в функционализованных стеклянным дном тарелки и формирования гелей с "сэндвич" их с массивом пользовательских покровного стекла. 6 Даже, хотя и очень перспективные, небольшие краевые эффекты по-прежнему наблюдается с этой техникой. Кроме того, методика требует специально разработанный массив не сразу доступной для многих лабораторий, а также дорогостоящих стеклянным дном луночные планшеты.

Эта статья описывает простой и недорогой способ собрать PA гели многоямного пластины, которые могут быть легко принятой любой лаборатории. Здесь гибкого пластика поддержка использовать, который имеет две стороны - гидрофобный один, который отталкивает PA гелей, и гидрофильного, которые ковалентно связывает гель PA при осаждении. После того, как гель листов PA оседают и постоянно прикреплен к гибкой пластиковой поддержки, что позволяет обработки гелей любой толщины или жесткости и резки их в любой желаемой форме. Это октренере не только производит на заказ пластиковые "покровные" в размерах не иначе имеющиеся в продаже, но и устраняет необходимость предварительной обработки стеклянных поверхностей, либо покровные стекла или лунки дорогостоящих стеклянным дном луночные планшеты, со связующим PA решения, которое является утомительным и трудоемким этапом. Наконец, однородные PA гели листов, могут быть получены в больших количествах и хранить де-гидратированных в течение нескольких месяцев.

Таким образом, по результатам анализа, представленные здесь, улучшение по сравнению с существующими методами в нескольких аспектах. Во-первых, процесс многоямного монтажной пластины является эффективным, и общая стоимость необходимых материалов низка. Во-вторых, гидрогели производятся большими партиями в одной однородной гелевой пленки. Наконец, только материалы, которые имеются в продаже, необходимо. Полезность анализа иллюстрируется изучения влияния подложки жесткости на клеточной морфологии и площади распространения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Гидрогель-ассоциированных растворов и аликвоты

  1. Приготовление раствора предшественника геля полиакриламида.
    1. Подготовка полиакриламидном геле раствор предшественника путем смешивания акриламида (A) (40% вес / объем, M R 71,08 г / моль), сшивающий агент бис-акриламида (В) (2% вес / об, M R 154,17 г / моль), и обозначим ионизированной воды в процентах объема, указанных в таблице 1.
      Примечание: Эти растворы могут быть получены в больших количествах и хранили при 4 ° С в течение нескольких месяцев.
      1. ВНИМАНИЕ: Акриламид является токсичным при вдыхании или проглатывании, особенно, когда в виде порошка: Таким образом, предпочтительно использовать 40% вес / объем раствора, чтобы снизить риски, связанные с токсичностью. Обращайтесь только тогда, когда ношение защитной одежды, такие как перчатки, защитные очки, и халате. Хранить в свет устойчивостью, плотно закрытом контейнере в холодильнике (<23 ° C, хорошо проветриваемом месте).
      2. ВНИМАНИЕ: Бис-акриламид является токсичным при вдыхании или проглатывании, особенно,Когда в виде порошка: Таким образом, предпочтительно использовать 2% вес / об раствора, чтобы снизить риски, связанные с токсичностью. Обращайтесь только тогда, когда ношение защитной одежды, такие как перчатки, защитные очки, и халате. Хранить в свет устойчивостью, плотно закрытом контейнере в холодильнике (<4 ° C, хорошо проветриваемом помещении).
  2. Получение и использование N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноата (сульфо-SANPAH, M R 492,40 г / моль) аликвоты. ВНИМАНИЕ: сульфо-SANPAH вызывает сильное раздражение глаз; ручка с перчатками и соответствующей очки или маску. Хранить при -20 ° C при получении и перед аликвоты.
    1. Чтобы сохранить сульфо-SANPAH: растворить сульфо-SANPAH в dimethylsulfoxane (ДМСО) при 50 мг / мл. Алиготе маточного раствора в 50 микро трубки центрифуги 20 мкл на пробирку. Флэш замораживание сухим льдом или жидким азотом (не обязательно, но предпочтительно, шаг, чтобы сохранить максимальную эффективность сшивающего) и хранят при -80 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: аликвоты окп храниться в течение нескольких месяцев.
    2. Для использования сульфо-SANPAH: растопить на короткое время кратный и разбавить в 480 мкл деионизированной воды. Используйте немедленно. Сульфо-SANPAH быстро гидролизуется в воде: поэтому с осторожностью, чтобы выполнить все вышеперечисленные шаги быстро.
  3. Получение персульфата аммония (м г 228,18 г / моль) аликвоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: персульфат аммония вызывает раздражение глаз, кожи и дыхательных путей. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты во время эксплуатации. Ручка персульфата аммония порошок в химическом вытяжном шкафу. Магазин порошок в сухом, хорошо проветриваемом месте. После того, как на аликвоты, разбавленный раствор может быть использован на верстаке.
    1. Растворить персульфата аммония в деионизованной воде до конечной концентрации персульфата аммония в 10% вес / объем. Аликвоты и хранить при -20 ° С. Оттепель непосредственно перед использованием.
  4. Приготовление раствора коллагена типа I.
    1. Подготовка 0,2 мг / мл раствора коллагена путем разбавления состава, такразложения в 1x фосфатным буферным раствором (PBS) с рН 7,4. Храните на короткое льда или использовать сразу после разведения.

2. Гидрогель Подготовка (Обратитесь к рисунку 1)

  1. Получение гидрофобных стеклах.
    1. Поместите несколько капель гидрофобного раствора на стеклянную пластину и использовать бумажные салфетки, чтобы распространить по всей поверхности. Пусть воздух сухой и протрите папиросной бумаги снова, чтобы выровнять гидрофобного покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить гидрофобный раствор в горючей шкафу при комнатной температуре. Носите защитную одежду при использовании. Работа в хорошо проветриваемом помещении.
  2. Получение гибкой пластиковой поддержки.
    1. Вырезать гибкий пластмассовый держатель в соответствии с размером гидрофобного покрытием стеклянной пластины.
    2. Отметить гидрофобный стороне гибкой пластиковой поддержки слегка царапать поверхность с острым инструментом, таким как скальпелем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как гель - который полностью прозрачным - сушит, То царапины поможет определить, какой гибкий сторона пластмассовая опора содержит гель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: гибкий пластиковый носитель имеет гидрофобный и гидрофильный сторону. После осаждения, полиакриламид, постоянно прилипает к гидрофильной стороне пластмассовой поддержки, что упрощает последующую обработку гидрогеля.
  3. Гель Подготовка (объемы пример приведены для 5 мл решений предшественника геля).
    Примечание: 5 мл будет достаточно, чтобы произвести ~ 40 гели, когда гель исходная толщина составляет 0,5 мм. Другие гели могут быть получены, если толщина гель уменьшается.
    1. Поместите 4972,5 мкл раствора полиакриламида предшественника желаемой конечной концентрации (таблица 1) в 50 мл коническую трубку. Место в камере дегазации в течение 30 мин с открытой крышкой.
      Примечание: Кислород действует как ловушка свободных радикалов и, когда он присутствует, он ингибирует полимеризацию.
    2. Добавить 25 мкл 10% вес / об персульфата аммония (см указывают 1,3) до достижения конечнойконцентрацию персульфата аммония в 0,05%.
    3. Добавить 2,5 мкл N, N, N ', N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED, M R 116,24 г / моль) к раствору дегазированной гель до достижения конечной концентрации TEMED 0,5%.
      Примечание: Храните TEMED в горючей шкафу при комнатной температуре. Обращаться в химической вытяжкой при ношении соответствующие средства индивидуальной защиты. Хранить плотно закрытым в атмосфере инертного газа, как это высоко воздуха и влаги чувствительной.
    4. Смешайте решение мягко пипетки вверх и вниз 3 - 5 раз. Не вихрь, чтобы избежать диффузии кислорода в раствор предшественника геля.
    5. Внесите гель раствора на гидрофильной стороне гибкой пластиковой поддержки и бутерброд с гидрофобным покрытием стекло. Отделите два слайда с силиконовыми прокладками желаемой толщины (например, 0,5 мм). Оставьте небольшое количество (~ 100 мкл) раствора полимера-предшественника в 50 мл коническую трубку, чтобы использовать в качестве индикатора гелеобразования.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Любой прокладка может быть использована. Например, один полоса парафильмом дает конечную толщину набухший гель 100 - 120 мкм.
    6. Поместите другой стеклянную пластину поверх гибкой сэндвич пластиковой поддержка / гель для выяснения еще гидрогеля поверхность, на полимеризации.
    7. Пусть гель полимеризации в течение 45 мин, хотя меньше времени, при желании могут быть использованы для гелей высшего% мас. Чтобы убедиться, что гель полимеризуется, наблюдать за оставшийся раствор в 50 мл коническую трубку; если оставшийся раствор гель, то есть вероятность, что гелеобразование на стеклянной пластине была начата, а также. Тем не менее, обратите внимание, что преждевременное открытие формы будет препятствовать полной полимеризации.
    8. После того, как образуется гель, снимите гибкий пластмассовый держатель с ковалентно связанного полиакриламидном геле на вершине, и установить геля стороной вверх высохнуть на воздухе.
      Примечание: конвекции тепла или сушки также может быть использован, чтобы ускорить этот шаг. После сушки на гибкой пластиковой поддержки, гель можно хранитьD на неопределенный срок.
      1. Отметить любые голые пятна гибкой пластмассовой подставке, где полиакриламидном геле не образуют связи с пузырьками. Марк в то время как гель-прежнему увлажненной, так как это будет гармонировать с гибкой пластмассовой подставке раз гель высохнет.

3. многолуночные Plate Ассамблея, коллаген покрытия и стерилизация

  1. Многолуночные пластина в сборе.
    1. После того, как высушить, отрезать PA гели желаемые формы.
      1. Для 96-луночного планшета, использовать дырокола сверхпрочный с диаметром ~ 6 мм. Используйте сверхмощный резак для бумаги, чтобы сократить гели в квадратные или прямоугольные формы. Кроме того, используйте ножницы.
    2. Подготовка примерно 500 мкл PDMS в 96-луночного планшета в соответствии с инструкциями изготовителя. Приклеить гели на дно многоямного пластины, поместить маленькую капельку (~ 5 мкл) полидиметилсилоксана (ПДМС) в центре каждой лунке. Использование щипцов, положите одну полиакриламидноме гель в каждую лунку, гибкой пластиковой поддержки стороной вниз. Чтобы вылечить PDMS, оставить собранный пластину при 37 ° С в течение как минимум 4 часов.
  2. Коллаген покрытие полиакриламидном геле.
    1. С пипетки, поместите небольшое количество (7 - 8 мкл) из сульфо-SANPAH (смотрите пункт 1.2.2) в каждую лунку и вихрем из стороны в сторону, чтобы покрыть поверхность геля равномерно. Работа оперативно, так как сульфо-SANPAH не является стабильным в воде.
    2. Место пластины также при высокой интенсивности УФ-лампы (интенсивность = 37 мВт, λ = 302 - 365 нм) в течение 5 мин. Промыть гели с PBS, чтобы удалить избыток сульфо-SANPAH.
    3. Пипетка 50 мкл 0,2 мг / мл коллагена I типа раствора (смотрите пункт 1.4) в каждую лунку. Оставьте пластину, покрытую при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч или O / N при 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ускорить процесс коллагена покрытием, пипетки может быть использован для добавления раствора коллагена. Как правило, 1 - 2 капли раствора должна быть достаточно, чтобы завершитьлы покрывают поверхность геля.
    4. Оставьте пластину а при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 часа, чтобы дать коллагена склеивание.
    5. Промыть PBS, чтобы удалить избыток раствора коллагена и стерилизуют под УФ (λ = 200 нм) в капот культуры ткани в течение 2 часов.
    6. Замочите гели в полной среде (обратитесь к разделу 4.1 для среднего состава) O / N для увлажнения и уравновешивают. Используйте для посева клеток непосредственно или магазин в холодильнике до 2 дней.

4. посева клеток на ПА жесткости Пробирной

Примечание: Несмотря на то, типичные для обычных клеточных линий млекопитающих, протокол описано в данном разделе, в частности, используется при раке молочной железы клеточной линии MDA-MB-231 (см фиг.4 и 5).

  1. Сбор клеток из тканевой культуральной колбы посредством воздействия 5% трипсина / EDTA в течение 5 мин при 37 ° С. Используйте ~ 80 мкл трипсина / ЭДТА в каждый см 2 культуральной области колбы; Например, используют 2 мл трипсина / EDTA FOра T25 культуры клеток колбу. Повторное приостановить клетки, собранные в полной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина при желаемой концентрации конечного элемента. Принимая во внимание время удвоения клетки, а также период времени клетки будут высевали на анализе, выбрать соответствующий суб-вырожденная концентрации клеток. Убедитесь, что добавили среда достаточно, чтобы полностью погрузить в воду гидрогели.
    Примечание: Так как гидрогели были предварительно уравновешенную в средствах массовой информации (обратитесь к шагу 3.2.6) 100 мкл объем должен быть достаточным. Типичные объемы среды, используемой для луночные планшеты, должно быть достаточным, так как гели были предварительно уравновешенную в средствах массовой информации на предыдущей стадии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: анализ будет подходит для любого крепления зависит от типа клеток.
    1. Количество количества клеток под инвертированным микроскопом с использованием гемоцитометра. Нагрузка 10 мкл клеточной суспензии в каждый порт гемоцитометра и в среднем число клеток, по меньшей мере 8 квадрантов. Чтобы получитьКонечная концентрация клеток, умножьте количество клеток на 10 4.
      Примечание: Наилучшие результаты подсчета клеток получают, когда количество клеток в каждой гемоцитометра квадранте есть 20 - 50.
  2. Культуры клеток на анализе жесткости ПА в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Изменить среды каждые 2 - 3 дня. Собирают клетки в случае необходимости под воздействием 5% трипсина / EDTA при 37 ° С в течение 5 мин. Используйте ~ 80 мкл трипсина / ЭДТА на см 2 ткани колбу культуры. Во всех этапов манипулирования клеток, проявлять особую осторожность, чтобы не нарушить поверхность гидрогеля: аспирация или пипетки среду, слегка наклонив Multiwell пластину в сторону и касания кончиком пипетки на боковой стенке каждой лунки, в отличие от прикосновения к гидрогель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: для особой заботы, чтобы не повредить поверхность гидрогеля во время стандартной обработки ткани культуры исключением, клетки высевали на жесткость анализ можно манипулировать так же, как если бы они были посеяны нав очередной многоямного пластины.

5. Визуализация клеток, посеянных на ПА жесткости Пробирной

  1. Клетки изображение непосредственно на жесткость анализа ПА.
    Примечание: Все микроскопа - перевернутый, флуоресцентные или конфокальной, могут быть использованы для визуализации клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: гибкий пластиковый носитель, используемый для построения жесткости анализа полностью прозрачен и не autofluoresce или мешать визуализации клеток. Тем не менее, несмотря на то, гибкой пластиковой самой опоры прозрачна, возможности визуализации будет ограничено рабочее расстояние объектива. Гибкий пластиковый носитель имеет толщину 0,23 мм и типичной рабочее расстояние в цель 10X ~ 4 мм, резко убывает при большом увеличении.
    1. Для получения изображений живых клеток, должность PA жесткость анализ в держателе микроскопа пластины и изображения. Держите сессий изображений при 2 ч, или использовать микроскоп, оснащенный климатической камере в течение более длительного времени визуализации.
    2. Когда жить им клетокстарение не цель, исправить клеток в 4% раствором формальдегида с добавлением 0,1% моющего средства. Замачивание клеток в фиксаторе при комнатной температуре в течение как минимум 2 ч. Промыть PBS в два раза. Отменить фиксирующий отходов в специально отведенных контейнер для отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть отображены немедленно или хранили погруженными в PBS при 4 ° С в течение 2 недель. ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен при вдыхании и попадании на. Обращаться с перчатками в химическом вытяжном шкафу.
      Примечание: Протокол фиксации клеток должен быть выбран на основе последующих окрашивания клеток и обработки протоколов, поскольку некоторые фиксаторы повредить некоторые клеточные белки.
    3. Для флуоресцентных изображений, пятно фиксированные клетки с нужной ячейке пятна непосредственно в многоямного пластины. Изображение немедленно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полиакриламид (ПА) гидрогели широко используются для проверки жесткости в зависимости от клеточного ответа. 17,24 При смешивании различных концентраций акриламида (А) и бис-акриламида (B) можно сделать PA гели, которые охватывают диапазон жесткости большинстве мягких тканей в Тело - 0,3 -.. 300 модуль кПа Юнга 1 Тем не менее, подготовка полиакриламидном геле является утомительным и трудоемким, часто ограничивая их полезность в «высокой пропускной" приложений, таких как для скрининга пример наркотик...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полиакриламидном геле, первоначально разработанные для электрофореза, в настоящее время обычно используется 28, культур клеток субстратов для изучения влияния субстрата жесткости на морфологии клеток, подвижности и общения 3,24,29 среди других характеристик клеток. Полиакриламид позволяет манипулирование подложкой жесткости, чтобы охватить жесткость всех мягких тканей в организме (0,3 - 300 кПа) 1 с простым изменением концентрации полимера-предшественника (фиг.2, таблица 1,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована за счет стартовых средств, предоставленных доктору Сильвии Зустиак Университетом Сент-Луиса, а также гранта Президентского исследовательского фонда (PRF), присужденного доктору Сильвии Зустиак Университетом Сент-Луиса. Благодарим Навида Ахмеда и Кеваля Шаха за техническое содействие.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
40% АкриламидBio-Rad161-0140
2% Бис-акриламидBio-Rad161-0142
Персульфат аммонияBio-Rad161-07000
TEMEDSigma AldrichT9281
Sulfo-SANPAHThermo Scientific22589
Коллаген 1-го типа, из крысиного хвоста, 3,68 мг/млBD Biosciences354236
диметилсульфоксид (ДМСО)Fisher ScientificBP231-100
Гидрофобный раствор — Repel SilaneGE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4HyCloneSH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]Elsworth Adhesives3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)Sigma Aldrich44174
RPMI-1640 Medium (1x)HyCloneSH30027-02
Фетальная бычья сывороткаHyCloneSH30073-03
Пенициллин стрептомицинMP Биомедицинские 1670046
Моющее средство: Triton-XSigma AldrichT8787
Формальдегид 37% растворSigma AldrichF1635
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Sigma AldrichA2153
Комплект для блокировки адгезии клеток на основе БСА — Набор для адгезионной матрицы клеток ECMChemicon InternationalECM540
Одноразовое лабораторное оборудование
>гибкая пластиковая поддержка — Пленка GelBond PAG для полиакриламидных гелейGE Healthcare Bio-Sciences309819
стеклянные пластиныSlumpysGBS4100SFSL
50 мл конические пробиркиFisher Scientific3181345107
15 мл конические пробиркиFALCON352097
микроцентрифугиFisher Scientific2 мл: 02681258
96-луночный планшет (плоское дно)Fisher Scientific12565501
Одноразовые пипетки (1  мл, 2  мл, 5  мл, 10  мл, 25  мл, 50  ml)Fisher Scientific1 мл: 13-678-11B, 2  мл: 05214038, 5  мл (СОКОЛ): 357529, 10  мл: 13-678-11E, 25  мл: 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
Стеклянные переводные пипеткиFisher Scientific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Наконечники для пипеток (1-200  μ л, 101-1000  μ l)Fisher Scientific2707509
Пластиковые стандартные одноразовые переводные пипеткиFisher Scientific13-711-9D
ParafilmPARAFILM PM992
Неопудренные смотровые перчаткиQuest92897
Силиконовые прокладки — Силиконовый лист, толщина 0,5 мм/13 см x 18 смGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
<сильный>Большой/одноразовый лабораторное оборудование
световой и флуоресцентный микроскоп (Axiovert 200M)Программное обеспечение для3820005619
микроскопаZeissAxioVision Rel. 4.8.2
УФ-печьUVITRONUV1080
Вакуумная камера/дегазаторBelArt999320237
Вакуумный насос для дегазатораKNF Lab5097482
Тканевой культурный шкафNUAIRENU-425-600
Химический вытяжной шкафKEWAUNEE99151
Инвертированный микроскоп (Axiovert 25)Инкубатор Zeiss663526
NUAIRENU-8500
Пипетка AidDrummond Scientific Co.P-76864
ГемацитометрBright-Line383684

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929(2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107(2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905(2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polyacrylamide Gel PreparationMultiwell Plate FormatStiffness dependent Cell ResponsesHydrogel Substrate PreparationFlexible Plastic SupportGel Polymerization ProcessCollagen Coating ApplicationCell Morphology AnalysisYoung s Modulus MeasurementMicroscopy Imaging Techniques

Related Articles