$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: Мужской мышей C57BL / 6 (5-7 недель) взяты из Charles River Laboratories International, Inc. (Санкт-Констант, Квебек, Канада.) И манипулировать в соответствии с процедурами, утвержденными Сент-Жюстин комитета Чу Уход за животными мимо. Мыши бронхиальные ткани эксплантатов обеспечивают хороший источник первичных бронхиальных эпителиальных клеток для исследования влияния проапоптозных LMPs на эпителиальных клетках. Этот протокол описывает генерацию ин витро LMPs, а также способ обнаружения апоптоза эпителиальных клеток на LMPs обработанных эксплантатов бронхиальной ткани. Этот протокол состоит из 3 разделов.
1. LMPs производства и характеристика
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения загрязнения, убедитесь, что все материалы, используемые в этом эксперименте являются стерильными или в автоклаве. Выполнить все шаги при комнатной температуре в бокс биологической безопасности при стерильных условиях, если не указано иное.
1.1) Стимулирование и Коллекция депутатов9
- Оттепель аликвоту 10000000 CEM Т-клеток в C на водяной бане 37 °. Развести в 10 мл подогретого бессывороточной средой гемопоэтических такие как X-VIVO, в 15 мл стерильную пробирку и центрифуги в 200 GX 5 мин. Аспирата супернатант и ресуспендируют клеток в 5 мл предварительно нагретой среды.
- Передача клеток в культуральной колбе Т75 ткани (для суспензии клеток) с 15 мл предварительно нагретой гемопоэтических среде, такой как X-VIVO и инкубировать в течение 4 дней в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2.
- После 4 дней, передать всю культуральную среду и клетки в культуральной колбе T175 ткани, содержащей 100 мл свежей среды. Продолжить инкубации клеток в течение примерно 72 ч в тех же условиях, пока они не выращивали до плотности 2000000 клеток / мл.
- Поровну между четырьмя клетками T175 колб каждый из которых содержит 150 мл свежей среды, и культуры клеток продолжают до тех пор, пока клетки выросли (примерно 48 ч инкубации) с плотностью 2000000 / мл.
- 6 клеток в новую T175 колбу, содержащую 150 мл свежей среды, чтобы сохранить / мл плотность клеток 2000000.
- Добавить актиномицина D (растворенного в ДМСО в концентрации 2 мг / мл) в среде при конечной концентрации 0,5 мкг / мл и инкубируют в течение 24 ч.
- Перенесите все культуральной среды в 50 мл конические пробирки и спином вниз клетки при 750 мкг в течение 5 мин. Передача супернатант в 50 мл конические пробирки и центрифуги в 1500 мкг в течение 15 мин для удаления крупных фрагментов клеток.
- Передача супернатант в бутылку 250 мл и ультрацентрифуге при 12000 х г в течение 50 мин. Удалите супернатант и собрать шарики.
- Промыть LMPs обогащенного гранул с 40 мл стерильной PBS в 50 мл пробирку центрифугированием при 12000 х г в течение 50 мин. Повторите этот шаг дважды.
- Соберите последней промывки надосадочной жидкости; он будет использоваться в качестве контроля транспортного средства. Приостановить гранул LMPs в 1мл PBS и передачи в 1,5 мл стерильной микропробирку. Кратные и хранить изолированно LMPs при -80 ° С (чтобы избежать многочисленных циклов свободного оттаивания).
1.2) Характеристика депутатов с помощью анализа FACS 4
- Подготовка 2 образцы аннексином буфера, 1 с и другой без CaCl 2: Hepes 10 мМ, NaCl 140 мМ, плюс или минус 5 мМ CaCl 2.
- Фильтр буфер аннексина и FACS потока текучей среды оболочки с использованием 0,22 мкм фильтр для удаления частиц.
- Развести 1 мкл LMPs в 44 мкл аннексина буфера с 5 мМ CaCl 2 в FACS трубы. Подготовьте другую трубу с 1 мкл LMPs в 44 мкл аннексина буфере без CaCl 2 (отрицательный контроль).
- Добавить 5 мкл annexinV-Cy5 в каждой пробирке и хорошо перемешать. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Остановка реакции разбавлением смеси с 400 мкл FACS потока оболочки жидкости в каждой пробирке.
- Добавить 10 мкл (200000 бусы и бисер) подсчета BEA 7 мкмDS суспензию в качестве внутреннего стандарта в каждую пробирку, чтобы получить абсолютный подсчет.
- Создание ворота относительного размера (FSC-H, PMT E00, войдите шкала) и относительной зернистости (SSC-H, PMT 325, войти шкала) точка участка, на цитометра с использованием размера калибровку флуоресцентные шарики из 1 мкм (ворота 1) и считая шарики ворота на 7 мкм (ворота 2).
- Проанализируйте пробу LMPs на FSC-H / SSC-H печати с использованием установленных ворот и FL-4 канал для аннексин (ФЭУ 765, логарифмическая шкала) точка участок, путем приобретения сигнала до 20000 подсчета бусы не будут достигнуты в ворота 2.
- Определите положительные annexinV события LMPs в аннексином буфере, содержащем CaCl 2, а затем вычесть события LMPs в аннексином буфера без CaCl 2 (отрицательный контроль).
- Рассчитать абсолютное число MPs на основе следующего уравнения:
1.3) Определение MP Protein Концентрация (Bradford анализ)
- Подготовка 5 серийных разведений стандартного белка от 1,25 до 20 мкг / мл. Внесите 800 мкл каждого стандартного и анализируемого раствора в чистую пробирку в двух экземплярах. Добавить 200 мкл реагента красителя Брэдфорда в каждую пробирку. Все хорошо перемешать, затем инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Измерьте оптическую плотность при 595 нм. Определить концентрацию белка LMPs помощью линейной регрессии стандартной кривой.
2. Бронхиальная тканей эксплантов и LMPs Лечение
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите особое внимание на стерильной рабочей среды, и в асептических условиях приготовления растворов и среда, используемая в следующих экспериментах. Для подготовки полного заживления Medium, добавить 1 мл ткани Исцеление среднего добавки с сывороткой (оттаивали на льду) до 100 мл тканей исцеления средней и хорошо перемешать.
2.1) Подготовка бронхиальной тканей эксплантов
- Перед культивирования поцарапать 6 областей 1 см 2друг на краю поверхности каждой 100 мм блюдо культуры ткани с скальпелем. Шерсть друг поцарапан 100 мм культуре ткани блюдо с 2 мл раствора для нанесения покрытия культуральную чашку и инкубировать блюдо в увлажненной CO 2 инкубаторе O / N при 37 ° С. Вакуумная аспирация излишки раствора и заполнить блюдо с 15 мл ткани среды для промывки.
- Эвтаназии C57BL / 6 мышей (от 5 до 7 недель) СО 2 ингаляции в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по этике по уходу за животными.
- Соблюдая правила асептики, анализировать легочной ткани скальпелем, Дюмон супер тонкой пинцет и хирургические ножницы. Осторожно снимите паренхимы и сосудов. Поместите ткань легкого в ледяную тканей среды для промывки для транспортировки в лабораторию, если это применимо.
- Кроме того рассекают бронхов погруженной в ткани и среды для промывки отделить бронхов с диаметром от 1 до 2,5 мм из периферических тканей легких. Нарежьте бронхиальной ткани в ~ 5 мм толщиной бронхов колец с помощью скальпеля.
Используйте движение черпая со стерильным изогнутых microdissecting щипцов, чтобы забрать бронхов фрагменты и поместить их на поцарапанных областей блюд. - Снимите ткань промывочной среды, и инкубировать фрагменты при комнатной температуре в течение ~ 5 мин, чтобы позволить им придерживаться блюд.
- Добавить 10 мл полного заживления среднего в каждую чашку и поместите их в контролируемой атмосфере инкубатором камеры. Промойте камеру с высоким O 2 газовой смеси (70% O 2, 25% N 2 и 5% СО 2,). Поместите камеру в настольном орбитальном инкубаторе и встряхивают при 37 ° С. Встряхнуть камеру на 24 часа при 10 циклов в минуту, чтобы среда течь с перерывами в течение фрагментов.
- После 24 ч инкубации соблюдать ткани эксплантов под фазового контраста перевернутой оптического микроскопа. Выберите бронхов эксплантов полной, точной движения волос и живой бронхиального эпителия для последующей обработки LMPs.
2.2) LMPs Лечение
- Подготовить всю среду для роста следующим образом: рост оттепель среднего добавки с сыворотки и фибробластов ингибитора на льду. Добавить 1 мл среды роста добавки с сывороткой и 200 мкл фибробластов ингибитора в 100 мл ростовой среды; тщательно перемешать. Теплый полную среду для роста при 37 ° С в течение 10 мин перед использованием.
- Развести изолированных LMPs в новом стерильной пробирке Эппендорфа с PBS подготовить запас LMPs в концентрации 800 мкг / мл.
- Добавить 0,5 мл полной среды роста в каждую лунку планшета для культуры ткани 12-а.
- Передача выбранных бронхов эксплантов с изогнутыми microdissecting щипцов из предыдущего протокола (раздел 2.1) в каждую лунку планшета для культуры ткани.
- Этикетка культуры пластину надлежащим образом определить LMPs лечения скважин и контроля скважин. Добавить 25 мкл LMPs запас в каждой обработки LMPs также (при конечной концентрации 40 мкг / мл) и 25 мкл управления транспортного средства (см LMP с производство) в контрольных лунках.
- Продолжить инкубации в контролируемой атмосфере инкубатора модульной камеры при 37 ° C при осторожном встряхивании.
- После 24 часов, помыть ЭКСПЛАНТОВ 3 раза PBS и перейти к следующему шагу (4% параформальдегид [PFA] фиксации).
3. Гистопатологическая Экспертиза
3.1) подготовить следующие решения, прежде чем приступить к выполнению следующих шагов
- Приготовьте 1х буфер PBS путем смешивания 137 мм NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,76 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4.
- Для приготовления 4% PFA, растворяют 20 г PFA в 400 мл воды, нагревают при 60 ° С при перемешивании; добавить несколько капель 10 М NaOH, чтобы очистить решение. Затем добавьте 1x буфер PBS и отрегулируйте громкость до 500 мл и рН до 7,4. Фильтр и аликвоту; хранить при -20 ° С.
- Подготовьте следующие обезвоживания или регидратации реагентов; 100%, 90%, 70%, 50% этанола и ксилола.
e_step "> 3,2) эксплантата Фиксация и тканей Раздел Депарафинирование
- Место каждого эксплантов в меченого микроцентрифужных трубки с 1,5 мл 4% PFA и инкубировать O / N при 4 ° С. Промыть эксплантов дважды 1x PBS.
- Дегидрировать эксплантов через серии алкоголя (70% этанола: 3 раз 30 минут каждый; 90% этанола: 2 раз 30 мин каждый; 100% этанола: 3 раз 30 мин каждый; затем ксилол: 3 раз 20 мин каждый). Выполните все шаги при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
- Вложим ткани эксплантов в парафин на 58 ° С в печи. Подготовка 5 мкм Срезы толщиной ткани с использованием роторного микротома.
- Поплавок разделы в C на водяной бане 56 °, а затем смонтировать разделы на меченых гистологических препаратов. Поместите слайды в ручном окрашивания стоек и высушивают при 65 ° С в течение 1 ч. Разрешить слайды остыть при комнатной температуре.
- Опустите стойки в 4 последовательных блюд пятен, содержащих ксилол в течение 10 минут каждый, чтобы удалить парафин. Опустите стойки в серии этанола, чтобы удалить ксилол: 100%, то 95%, йEN 80%, то 70%, то 50% этанола (5 мин для каждого шага). Промыть стойки с водопроводной водой в течение 5 мин, чтобы удалить этанол.
3,3) гематоксилином и эозином (Н & Е) Окрашивание
- Продолжить работу с разделами основной ткани; разместить стойку в окрашивания тарелки, наполненной гематоксилином Майера в течение 15 мин. Промойте стойку с водопроводной водой, чтобы удалить гематоксилином в течение 20 мин.
- Место в дистиллированной воде в течение 30 sec.Place в 95% этаноле в течение 30 сек. Место в Eosin Y красящим раствором блюдо в течение 1 мин. Высушить с помощью 2 изменений 95% этанола, 100% -ного этанола и ксилола в течение 2 мин каждый.
- Выполните быструю проверку под микроскопом, чтобы убедиться, что избыток эозином удаляется. Поместите 2 до 3 капель гистологическая среда (Fisher SP15-100) на каждого слайда, затем накрыть покровным стеклом.
3.4) В Ситу Cell обнаружения смерти: TUNEL Анализ
- Перед началом, подготовить протеиназы К рабочий раствор: 20 мкг / мл в10 мМ Трис / HCl, рН 7,4.
- Повторите шаги с 1 по 5 раздела 3.2 (эксплантата фиксации и тканей разделе депарафинизации). Промыть слайды с деионизированной H 2 O.
- Погрузите слайды с 1x PBS в течение 10 мин. Слейте лишнюю PBS. Инкубируйте срезов ткани в течение 30 мин при комнатной температуре с протеиназой К рабочего раствора. Промыть слайды дважды 1x PBS.
- Выполните анализ TUNEL, как описано в руководстве по эксплуатации комплекта обнаружения гибели клеток. Установите с помощью монтажной среды и покровное вручную покровные стекла.
- Анализ образцов под световым микроскопом. Используйте Image Pro 4.5 для анализа апоптоза клеток в коричневый цвет.