Методическая статья

Используя антиген капсида-РЕГИСТРАЦИИ Стратегию развития подходов аденовируса серотипа 5-Vectored вакцин

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 мая 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим протокол для создания типа двухвалентный аденовирус 5 (Ad5) вектор доказательство из-принцип Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 с использованием стратегии антиген капсида-регистрации. Этот вектор был продемонстрирован демонстрируют качественное пригодность, возможность избежать Ad5-положительные сыворотки в пробирке, и антигенность, а также иммуногенность к объединенной антигенов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденовируса серотипа 5 (Ad5) была значительно изменена с традиционными методами трансгенных по разработке вакцин. Сокращение полезного действия этих традиционно модифицированных векторов Ad5 в клинических испытаниях может быть, прежде всего, коррелирует с Ad5 уже существующей иммунитета (PEI) среди большинства населения. Способствовать развитию вакцины Ad5-векторная по решению обеспокоенность Ad5 PEI, была использована инновационная стратегия антиген капсида-Включение. По заслугам этой стратегии, Ad5-векторная мы сначала построили трансфер Hexon плазмиды HVR1-Kwas-HVR5-6 / Его pH5S субклонированием гипервариабельный область (HVR) 1 из Hexon в построенной ранее трансфер плазмиды HVR5-6 / Его pH5S, который имел Его 6 тега включены в HVR5. Этот фрагмент ДНК, содержащий HVR1 ВИЧ эпитоп ELDKWAS был синтезирован. HVR1-Kwas-HVR5-6 / Его pH5S тогда линеаризуется и котрансформируют с линеаризованной плазмиды основой pAd5 / ΔH5 (GL),для гомологичной рекомбинации. Это рекомбинации плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 трансфицировали в клетки, чтобы генерировать вирусный вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-6 Его. Этот вектор был проверен, чтобы иметь качественный пригодность указанную вирусной физическое титра (VP / мл), инфекционный титр (IP / мл) и соответствующее отношение / IP VP. Оба эпитоп ВИЧ и его 6 тега были экспонированы на поверхности капсида на Ad5, и сохранил эпитоп конкретного антигенность самостоятельно. Нейтрализация анализ показал способность этого вектора двухвалентного обойти нейтрализации Ad5-положительные сыворотки в пробирке. Иммунизация мышей показали поколение надежной гуморальный иммунитет, специфичные для эпитопа ВИЧ и его 6. Это доказательство правильности принципа исследование показало, что протокол, связанный со стратегией антиген капсида-Регистрации может быть реально использованы для генерации Ad5-векторной вакцины, изменяя различные белки капсида. Этот протокол может быть даже Further модифицированы для генерации редких серотипа аденовирусов векторная вакцин.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденовируса человека (БА) является среднего размера, не охватило вирусов с икосаэдрического нуклеокапсиде содержащей двухцепочечной ДНК генома. Объявление принадлежит к семейству Adenoviridae, с классификацией в семи группах (A через G). Каждая группа содержит вирус различных серотипов. Из которых, аденовирус серотипа 5 (Ad5) из группы С был наиболее широко изучены и наиболее широко применяется для векторной подходов, таких как генной терапии и вакцинации.

Традиционная стратегия трансген были разработаны и применены для Ad5 модификаций, которая характеризуется смещением вирусных ранних генов с генами из интересов и целенаправленной экспрессии гена-из-интерес у хозяина. Примерами являются строительство pENV9 / Ad5hrΔE3 путем замены раннего гена 3 (E3) с геном оборотов в Simian вируса иммунодефицита 1, строительство AdCMVGag путем замены раннего гена 1 (Е1) с геном затычки иммунодефицита человекаВирус (ВИЧ) 2, и строительство ас объявление Z путем замены E1 с ас Z гена 3. Широкое применение в традиционной стратегии трансгенной на Ad5 зависит от следующих достоинств: широкий диапазон хозяев для Ad5, реализуемого генной инженерии на вирус и распространения вируса, большой размещения внешней гена вставки и безопасности Ad5 4,5. Тем не менее, снижение полезного действия Ad5-векторной клинической терапии с использованием этой стратегии была основным узким местом, которое было отображаются на в первую очередь связано с Ad5 PEI, так Ad5 настолько распространено среди большинства детей и взрослых 4,6.

Чтобы преодолеть основную узкое Ad5, основная цель заключается в разработке альтернативной стратегии в обход Ad5 PEI. Врожденный иммунитет 7, адаптивного иммунитета, такие как нейтрализующие антитела (NABS) 8-10 и CD8 + Т-клеточных ответов против 10 Ad5 как было показано, совместноntribute к Ad5 PEI, с Ad5 NABS появляться играть доминирующую роль в взносов Ad5 PEI 10,11. Кроме того, Ad5 NABS целевые эпитопы, локализованные в белков капсида, в том числе основной Hexon белка, волокна и Пентон базы. Из которых, Hexon является главной мишенью Ad5 NABS 8,11-13. Основываясь на этих выводах, инновационная стратегия антиген капсида-Включение была введена. Это новая стратегия подчеркивает замену или включение белков интересов, на Ad5 белков капсида, которые посменно маскирует Ad5 нейтрализующие эпитопы, приводит к пониженной признания в NABS и эффективных администраций векторных Ad5. Стоит отметить, что эта стратегия является конкурентоспособной, потому что она также может помочь выявить хозяева надежную гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет мощный непосредственно представляя антигены интересов, для иммунной системы 4,14,15. Основываясь на этой стратегии, молекулярное клонирование и рекомбинантный вирусный вектор объявления спасение может быть структурно разделенна четыре основных этапа: (а) подготовка гена интересов, либо фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или синтеза; (Б) перевязка фрагмента гена в челночный плазмиды, содержащей ген интересов, фрагмент и гомологичные руки к аденовирусной позвоночника; (С) гомологичной рекомбинации путем совместного преобразования трансфер плазмиду, содержащую ген, представляющей интерес фрагмент с линеаризованной плазмидой магистральной pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) трансфекции линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмидой, чтобы спасти рекомбинантный вектор объявление объединена с антигенами-на-интерес.

Наша группа и некоторые другие расширили эту альтернативную стратегию инкорпорации объявление для развития векторная вакцина против Ad различных инфекционных возбудителей. Мы сообщили поколение рекомбинантного вектора Ad Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 путем включения His-меченый ВИЧ-1 антиген V3 в HVR1 локали Ad5 Hexon (hexon5). Это вызвало вектор срабатывает улOng гуморальный иммунный ответ на конкретный эпитоп V3 4. Мы также сообщили о разработке Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 путем включения ВИЧ-1 мембранного проксимального эктодомена область (MPER) в HVR2 локали hexon5 2. Кроме того, группа доктора Чжоу использовал преимущества этой стратегии инкорпорации объявления развивать серотип объявление 3 (Ad3), переносимые вакцины, то есть., Поколение вирусный вектор R1SP70A3 путем включения нейтрализующий эпитоп SP70 энтеровирусной 71 в HVR1 из Ad3 Hexon (hexon3). R1SP70A3 генерируется сильные NABS и производство IFN-γ, характерные для эпитопной SP70, которые приводят к высокой скорости защиты от энтеровирусов 71 вызов 15.

Для технического руководства, наше исследование воспользовался качественной стратегии антиген капсида-Регистрации, чтобы сосредоточиться на генерации двухвалентного Ad5 вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 путем включения ВИЧ-1 антигена в HVR1да Его тег в HVR5 из hexon5. Генерируется вирусный вектор был также иммунологически оценены. Стратегия антиген капсида-Включение могут быть использованы на развитие Ad5-векторной подходов вакцинации против различных инфекционных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Университет Алабамы в Бирмингеме институциональной использования животных и ухода комитета одобрили использование мышей, как описано в настоящем документе в рамках утвержденного протокола числа 101109272.

1. Генетическая Строительство модифицированной плазмидой pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 с антигеном капсидоподобные Регистрации стратегии

  1. Строительство шаттла плазмиды HVR1-Kwas-HVR5-6 / Его pH5S
    1. Заказать плазмиды, содержащей ДНК-последовательность синтезировали HVR1-Kwas между сайты рестрикции AgeI в AccI гена hexon5.
    2. Дайджест 6 мкг синтезированного фрагмента (HVR1-Kwas) с ферментами AgeI (6 единиц) и AccI (6 единиц) в течение 3 часов при 37 ° С. Решение переваренной фрагмент в 2% агарозном геле методом электрофореза и очищают фрагмент с использованием набора для экстракции ДНК из геля в соответствии с протоколом производителя.
    3. На основании молярном соотношении вставки в вектор в 3: 1, используют ДНК-лигазы Т4 лигазы и бuffer лигировать 12 нг фрагмента (HVR1-Kwas) в 100 нг ранее построенной челночной плазмиды HVR5-His 6/17 pH5S в объеме 10 мкл при комнатной температуре в течение 2 ч, через сайты AgeI и AccI.
    4. Преобразование 1 мкл из 10 мкл продукта лигирования в 50 мкл электрокомпетентных клеток DH5 & alpha в электропоратора (1800 V). Добавить 950 мкл SOC среды трансформированных клеток DH5 & alpha и инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 ° С, 300 оборотов в минуту. Распространение 100-200 мкл смеси 1 мл на Лурии-Бертани (LB) агар, содержащий канамицин, и инкубируют O / N при 37 ° С.
      1. На экран ~ 10 колоний от ПЦР направленные фрагмент HVR1-Kwas, смешать прямого праймера (TATGTGTGTCATGTATGCGT), обратный праймер (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) и одну колонию DH5 & в раствор смеси ПЦР мастер (в соответствии с протоколом производителя). Запуск образцов на амплификаторе со ссылкой на руководство, поставляемое с решением ПЦР мастер смеси,
      2. Используйте прямой праймер (TATGTGTGTCATGTATGCGT) для секвенирования фрагмента HVR1-Kwas в клонах экранированных в разделе 1.1.4.1.
  2. Конструирование плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Дайджест 6 мкг HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S с ферментами EcoRI (6 единиц) и PmeI (6 единиц) в течение 3 часов при 37 ° С, и очистить фрагмент, содержащий гомологичные рекомбинации оружие и двойной модифицированный ген hexon5, как указано в пункте 1.1.2. Линеаризуем магистральную плазмиды pAd5 / ΔH5 (GL) 16 с SwaI.
    2. Со-преобразования 100 нг целевого фрагмента из челночной плазмиды и 100 нг линеаризованной pAd5 / ΔH5 (GL) позвоночника в 50 мкл электрокомпетентных BJ5183 клеток для гомологичной рекомбинации в электропоратора (1800 V). Добавить 950 мкл SOC среды трансформированных клеток и инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 ° С, 300 об. Распространение 100 - 200 мкл смеси 1 млна агаре LB, содержащей канамицин (конечная 50 мкг / мл) в течение O / N инкубации при 37 ° С.
      1. Pick ~ 10 крошечные колонии в 3 мл жидкой LB, содержащей канамицин (конечная 50 мкг / мл) в течение O / N инкубации на качалке (250 оборотов в минуту, 37 ° C). Экстракт плазмиды из культуры. Использование ПЦР-анализа на экран в 10 колоний путем воздействия на фрагмент HVR1-Kwas, как показано в шаге 1.1.4.1.
      2. На экран те же колонии от ПЦР анализа таргетирования пикс фрагмент магистральной генома, смешать прямого праймера (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), обратный праймер (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) и один BJ5183 колонию в раствор смеси ПЦР мастер (в соответствии с протоколом производителя). Запуск образцов на термоциклере, ссылаясь на руководстве, прилагаемом к решению Master Mix ПЦР.
      3. Назначить дважды положительные колонии ПЦР в качестве pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-6 Его.
    3. Transform 100 нг плазмиды pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-6 в Егов DH5 & клетки, как показано в шаге 1.1.4.
      1. Использование ПЦР-анализа на экран ~ 10 колоний путем охвата фрагмента HVR1-Kwas, как показано в шаге 1.1.4.1.
      2. Использование ПЦР-анализа на экран те же колонии путем воздействия на PIX фрагмент магистральной генома, как показано в шаге 1.2.2.2.
      3. Используйте прямой праймер (TATGTGTGTCATGTATGCGT) для секвенирования фрагмента HVR1-Kwas в pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.

2. Подготовка модифицированной Ad5 вирусный вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6

  1. Представляют собой полное среду, добавив FBS (конечная 10%), 100X Номера незаменимых аминокислот (конечная 0,1 мм), 200 мм L-глутамин (конечная 2 мм) и раствор пенициллина / стрептомицина (конечная 1%) в DMEM с высоким содержанием глюкозы , Поддержание человеческих эмбриональных почек (НЕК293) клеток в полной среде в культуре инкубаторе (37 ° C и 5% CO2 при 85% влажности условий).
  2. Спасение вирусной вет е р Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Семенной 3,0 х 10 6 клеток НЕК293 в одном Т-25 колбу, содержащую 5 мл полной среды и культуры O / N для достижения монослоя с 80% слияния.
    2. Линеаризовать 15 мкг pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 в объеме 100 мкл с использованием рестрикционного фермента PacI (15 единиц) при 37 ° С в течение 3 часов.
      1. Экстракт линеаризованный pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 центрифугированием реакцию дважды (10000 мкг в течение 1 мин) с равным объемом фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (соотношение при 25: 24: 1) в вытяжном шкафу и последовательным центрифугированием (10000 х г в течение 10 мин) с смешанным раствором (300 мкл 100% -ного этанола и 10 мкл ацетата натрия) и 700 мкл 70% этанола. Удалите супернатант в каждой стадии центрифугирования.
    3. Ресуспендируют в очищенной плазмидной ~ 40 мкл дистиллированной воды или Трис-ЭДТА (ТЭ) буфера. Количественного определения ДНК плазмиды путем измерения оптической деnsity (ОД) при 260 нм.
    4. Трансфекции 3 мкг линеаризованной плазмиды с коммерческой липосомальный трансфекции реагента в Т-25 колбу, в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Изменение трансфекции среду с полной среде в течение 6 часов после трансфекции и последующей инкубации в культуральной инкубаторе. Поддержание трансфекции клеток с помощью замены не полный среду каждые два-три дня, пока индивидуального вирусные бляшки форме.
    5. При бляшки развиваются до полного цитопатического эффекта (CPE), очистить оставшиеся клетки выключения колбу в стерильных капот, и урожай клеточный лизат центрифугированием среды при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Приостановка осадок клеток в ~ 1 мл среды, содержащей 2% FBS, и разорвать клетки путем замораживания-оттаивания в четыре раза. Собирают супернатант, содержащий вирус спасены после центрифугирования лизата при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  3. Масштаб распространения Большая часть вирусного вектора Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Размножаются йе вирус в Т-75 колбу, содержащую клетки HEK293 в стерильных капот, заражая 1/3 до полной лизата от Т-25 колбу. Разрешить полный CPE развивать в течение двух-трех дней в культуральной инкубатора. Урожай лизата супернатант, как указано в шаге 2.2.5.
    2. Распространять вирус в 2:59 Т-175 колб в стерильных капот путем инфицирования с 1/2 до полного лизата от Т-75 колбу, в зависимости от условий распространения вируса. Разрешить полный CPE развивать в течение двух-трех дней в культуральной инкубатора. Урожай лизата супернатант, как указано в шаге 2.2.5.
    3. Распространять вирус в одном или нескольких десятков Т-175 колб в стерильных капот путем инфицирования с 1/2 до полного лизата из предыдущего Т-175 колбы (ов). Определить количество использования колбу на основе условий распространения вируса и количество вируса в этом нуждается. Урожай лизата супернатант, как указано в шаге 2.2.5, когда полный CPE происходит в течение двух-трех дней в культуральной инкубатора.
  4. Purification из Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 хлорид цезия
    1. Приготовьте два плотности растворов CsCl в 5 мМ HEPES: 1,33 г / мл и 1,45 мкг / мл, в то время избегая контакта с CsCl.
    2. Загрузка 4 мл CsCl (1,33 г / мл) в стерильном ультрацентрифужную пробирку и осторожно загружают 4 мл CsCl (1,45 г / мл) против нижней части трубы. Нагрузка 4 мл лизата надосадочной жидкости медленно в верхней части градиентов в стерильных капот.
    3. Центрифуга трубки на 110000 х г в течение 3 ч при 4 ° С для отделения зрелого / нижний вируса группа из дефектного вируса / высшего диапазона. Соберите нижнюю полосу с помощью шприца 3 мл вооруженный 33 G иглы и разбавить группу с 5 мМ HEPES с объемом 4 мл в стерильных капот.
    4. Загрузка другую трубу с двух плотностей растворов CsCl и разбавленный полосы вируса, как описано в шаге 2.4.2. Центрифуга трубки на 110000 х г O / N при 4 ° С. Соберите группу вирусной, как описано в шаге 2.4.3.
    5. Вводите собранный вирус решение в dialysэто кассета с помощью шприца 3 мл вооруженный 33 G иглы в стерильной крышкой.
    6. Поместите кассету в 700 мл 1х буфера для диализа (1 л Рецепт: 100 мл 10х PBS, 100 мл 100% глицерина и 800 мл дистиллированной воды; фильтровать буфера через фильтр 0,22 мкм) и заменить диализного буфера каждые 3 ч в 4 раза. Аспирата из Диализованные решение вирусов с помощью иглами шприца.

3. Проверка спасенных вирусный вектор

  1. Вирусный вектор титрование
    1. Для вируса физической титра, развести как вирус и диализа буфера (фон контролю) на 1: 10 и 1: 20 в вирус буфера для лизиса (10% SDS в Трис-ЭДТА) в небольших трубок и инкубировать все трубы на 56 ° С в течение 10 мин.
    2. Включите в биофотометра и установите режим оптической плотности OD при 260 нм. Используйте разбавленный буфер диализа (1: 10), чтобы сбалансировать фонового сигнала, нажав кнопку "пустой" дно. Тип "10 + 90" в Биофотометре ЮКЖДееп, и читать сигнал разбавленного вируса (1: 10).
    3. Читайте сигнал разбавленного вируса (1: 20), следуя методу в шаге 3.1.2, а вместо этого ввести «5 + 95» на экране Биофотометре. Умножение двух чисел вирус считывания с помощью 1.1x10 12 и вычислить средний титр с блоком как VP / мл, в расчете на двух отдельных титров из двух разведений.
    4. Для вируса инфекционного титра (IP / мл), используйте Karber статистический метод TCID 50 14, чтобы определить глубину поражения на НЕК293 на 10 дней после заражения (точек на дюйм)
  2. Оценка антигенной индикатора экспозиции на вирусном векторе
    1. Пальто вирусный вектор в ELISA пластины и заполните остальные шаги в стандартном методе ELISA 14. Использование человеческого анти-gp41 (2F5) моноклональное антитело (Mab) и мышиное анти-His тегов МКА для обнаружения соответствующих антигенов включены 14.
    2. Решить вирусного вектора в denatuэлектрофорез красный белок гель (SDS-PAGE) и приступить к остальной части шагов в стандартном методе западного блоттинга 14. Использование человеческого анти-gp41 (2F5) моноклональное антитело (Mab) и мышиное анти-His тегов МКА для обнаружения соответствующих антигенов включены 14.
  3. В пробирке оценки вектора на способность обойти Ad5-positve сывороток
    1. Поддержание HeLa клетки в полной среде в культуре инкубаторе (37 ° С и 5% СО 2 при 85% влажности) условия. Представляют собой полное среды путем добавления FBS (конечная 10%), 200 мМ L-глутамина (конечная 2 мм) и раствор пенициллина / стрептомицина (конечная 1%) в минимальную поддерживающую среду Игла (MEME).
    2. Семенной HeLa клетки в 6-луночные планшеты при 1x10 6 клеток / лунку, и инкубируют планшеты в культуре инкубаторе (37 ° С и 5% СО 2 при 85% влажности условий) в течение 2 часов. Выдержите Ad5-положительные сыворотки (0,1 мкл или 0 мкл) с 5 IP / ячейки вирусного вектора (Ad5 или Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6) в культуральной инкубаторе в течение 1 часа перед добавлением смеси на 6-луночные планшеты, содержащие клетки.
    3. В 24 ч после инфекции (ИНН), промыть клетки один раз PBS и лизируют клетки в 0,5 мл буфера для лизиса. Центрифуга при 15000 х г в течение 5 мин и собирают супернатант. Смешайте 20 мкл супернатанта с 100 мкл субстрата люциферазы для чтения люциферазы сигнала, так вирусы содержат ген люциферазы.

4. Иммунологические оценка спасенных вирусный вектор

  1. Подготовьте две группы иммунизации: Ad5 и Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-6 Его.
    1. Вводите мышей (п = 8 / группа) внутримышечно вирусов на 1х10 10 VP / мышь, в гомологичной "премьер-наддува" режима иммунизации, с интервалом в 2 недели.
    2. В 2 недели после каждой инъекции, кровотечение мышей без анестезии щеке кровотечение ланцеты животных (5 мм длины наконечника) дособирать кровь в 1,5 мл пробирки.
  2. Смешайте кровь в пробирках путем инвертирования вверх и вниз, и инкубируют в крови при комнатной температуре в течение 30 мин. Спин трубки при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и передачи сывороток (верхний слой) к новым 1,5 мл пробирки.
    1. Спин новые трубок при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° С и передачи сывороток вновь отмечены в 1,5 мл пробирки для хранения при -80 ° С.
  3. Оценка антиген-специфического гуморального иммунитета сыворотками основе ELISA
    1. Развести Его пептид (акции на 1 мм) и ВИЧ-1 пептид (акции на 1 мм) отдельно в 100.
    2. мМ карбонатный буфер (рН 9,5), чтобы достичь концентрации пептида покрытия при 10 мкМ. Покрывают пластинки ELISA с разбавленных пептидов отдельно добавлением 100 мкл на лунку и инкубации планшетов O / N при 4 ° С.
    3. Промыть пластины с PBST четыре раза при 200 мкл / лунку и блока в течение 1 ч в 5% BSA в PBST. Применение сыворотки мышей к пластинам на разведение 1: 100 в блокирующем BUFфер, 100 мкл / лунку. Инкубируют в течение 2 ч инкубации при комнатной температуре.
    4. Вымойте тарелки с PBST четыре раза. Блок пластин путем инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин в блокирующем буфере при 100 мкл / лунку.
    5. Применение антимышиного IgG-HRP (1: 5000 в блокирующем буфере) в количестве 100 мкл / лунку, чтобы обеих пластинах, покрытых пептидом и его ВИЧ-1 пептида по отдельности. Инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Вымойте тарелки с PBST.
    6. Read пластин при OD450 нм после инкубации с HRP субстрат в течение 30 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегия антиген капсида-Включение (1А) была использована, чтобы генерировать двухвалентное Ad5 вирусный вектор Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Во-первых, трансфер плазмиды HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S был построен субклонированием HVR1-Kwas фрагмент в предыдущем построен трансфер плазмиды HVR5-Его 6/17 pH5S. Во-вторых, плазмиду pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 был построен в гомологичной рекомбинации между фрагментом "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Применение традиционной стратегии трансгенной о внесении изменений Ad5 для разработки вакцин была ослаблена в первую очередь из-за узкого связанного с Ad5 PEI 4,6. Это узкое может быть частично уменьшена путем применения альтернативных антиген капсида-Включение стратегии (рис 1А), так как это стратегия может уклониться от нейтрализации Ad5 NABS заменой нейтрализующие эпитопы Ad5 с антигенами интересов, и способствовать поколение надежной иммунитета к объединенной антигенов-на-интерес. В этом ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения предоставляет 5T32AI7493-20 и 5R01AI089337-03. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01для расщепления клеток 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02для диализного буферного препарата
глицеринSIGMAG5516-1Lдля диализного буферного препарата
SDSBIO-RAD161-0301для лизисного препарата
вируса Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo ScientificSH30910.03компонент питательной среды
100x Заменимые аминокислоты& НБСП;Thermo ScientificSH30238.01компонент питательной среды
200 мМ L-глутаминCellgro25-005-CIкомпонент питательной среды
раствор пенициллина/стрептомицина Cellgro30-002-CIкомпонент питательной среды
DMEM с высоким содержанием глюкозыThermo ScientificSH30081.01для культуры клеток HEK293
Minimum Essential Medium EagleSIGMAM5650для культуры клеток HeLa
фенол:хлороформ:изоамиловый спирт SIGMAP3803-100MLдля большого объема очистки ДНК
хлорида цезия Исследовательская международная корпорация «Ресерч продактс»C68050для очистки вирусов
HEPESCellgro25-060-CIдля приготовления раствора CsCl
HEK293ATCC51-0036для спасения вирусов и высококлассные
HeLaATCCCCL-2для анализа нейтрализации
T-25 колбаThermo Scientific156367для клеточных культур 
Колба Т-75CORNING430641для культивирования клеток 
Колба T-175Thermo Scientific159910для клеточных культур 
УльтрацентрифугаBECKMANNAдля очистки от вирусов
УльтрацентрифугаBECKMAN344059для очистки от вирусов
диализная кассета Thermo Scientific66380для вирусного диализа
ИФА планшетThermo Scientific442404для ИФА
человека анти-gp41 (2F5) mAbNIH СПИД Реагент Программа1475для иммунологических анализов
мышь анти-Гис метка mAbGenScriptA00186для иммунологических анализов
SOC средаCORNING46-003-CRдля трансформации
Мастер-микс для ПЦРQIAGEN201445для ПЦР
Ланцет для животных (длина острия 5 мм)MEDIpointдля мышей с кровотечением 
БиофотометрEppendorfдля титрования физического титра вирусов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

His6

Похожие статьи