Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественное нейрососудистой защите После Серийное гипоксического прекондиционирования и переходных средней мозговой артерии Окклюзия у мышей

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52675

⸱

4 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает повторяющееся гипоксическое прекондиционирование или кратковременное воздействие системной гипоксии, которые уменьшают объемы инфаркта и нарушение гематоэнцефалического барьера после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у мышей. В нем также подробно описана двойная количественная оценка объема инфаркта и нарушения гематоэнцефалического барьера после инсульта для оценки эффективности нейроваскулярной защиты.

Аннотация

Экспериментальные модели на животных инсульта являются бесценными инструментами для понимания хода патологии и разработке более эффективных стратегий лечения. 2 недели протокол для повторного гипоксического прекондиционирования (RHP) индуцирует долговременную защиту против центральной нервной системы (ЦНС) травмы в мышиной модели координационного ишемического инсульта. ПРЗ состоит из 9 стохастических воздействий к гипоксии, которые изменяются в обоих длительности (2 или 4 ч) и интенсивности (8% и 11% O 2). ПРЗ уменьшает объемы инфаркта, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) нарушения, и постинсультной воспалительную реакцию в течение недель после последнего воздействия гипоксии, предлагая долгосрочные индукции эндогенного ЦНС защитного фенотипа. Методология двойной количественного объема инфаркта и нарушения BBB является эффективным при оценке нервно-сосудистого защиту у мышей с ПРЗ или других предполагаемых нейропротекторами. Взрослых самцов мышей Swiss Webster были обусловлена ​​ПРЗ или продолжительность эквивалент воздействия до 21% O (т.е. воздуха в помещении). 60 мин временной окклюзии средней мозговой артерии (tMCAo) индуцировали 2 недели после последней гипоксии. Оба окклюзии и реперфузии были подтверждены транскраниальной лазерной доплеровской флоуметрии. Двадцать два часа после реперфузии, Эванс синий (EB) вводили внутривенно через инъекции в хвостовую вену. 2 ч позже, животные были принесены в жертву изофлурановой передозировки и срезах мозга окрашивали 2,3,5- трифенилтетразолинхлорида хлорида (TTC). Инфаркты объемы затем количественно. Далее, ЕВ экстрагировали из ткани более 48 ч, чтобы определить разрушение ВВВ после tMCAo. В целом, RHP является простой протокол, который может быть воспроизведен, с минимальными затратами, чтобы вызвать долгосрочное эндогенного сосудисто-нервный защиту от травм инсульта у мышей, с поступательным потенциала для других ЦНС на основе системных и провоспалительных болезненных состояний.

Введение

Как ведущий дело взрослых инвалидности и четвертой ведущей причиной смерти, инсульта является одним из самых изнурительных болезненных состояний, стоящих перед взрослое население Соединенных Штатов. 1 животных моделях инсульта позволяют экспериментального исследования новых методов снижения ишемического повреждения и улучшение восстановление после инсульта. Один роман проспект для такого поступательного исследования предварительной подготовки. Предварительная это умышленное использование безвредных стимулов для снижения ущерба от последующего, более тяжелой, травмы. 2 гипоксического прекондиционирования было показано, чтобы произвести плейотропные изменения в головном мозге, которые обеспечивают защиту от инсульта в как в естественных условиях и в пробирке исследования . 3 Тем не менее, при однократном воздействии гипоксии предлагает только краткосрочную нейропротекцию, вызывая меньше 72 ч толерантности в отношении ишемии у взрослых мышей. 4 Даже после четырех недель 14 ч ежедневно воздействия на гипобарической гипоксии, Лин и др. FOунд что нейропротекция лишь поддерживается в течение одной недели. 5 повторяющихся гипоксического прекондиционирования (RHP) характеризуется стохастических изменений в частоте, продолжительности и интенсивности гипоксических воздействий. В отличие от одного вызова предварительной подготовки, ПРЗ индуцирует церебропротективное фенотип, который длится до восьми недель у мышей. 6 ПРЗ сократили объемы инфаркта, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), нарушения сосудистого воспаления, и лейкоцитов диапедез неделями после окончательного гипоксии , RHP частности уменьшается воспаление в ишемической мозга за счет снижения Т-клеток, моноцитов, макрофагов и популяции, сохраняя популяции В-клеток в ишемической полушарии. 7 В самом деле, RHP индуцированной иммунодепрессивное фенотип у мышей до любого повреждения ЦНС, в том числе инсульта. ПРЗ обработанные В-клетки, выделенные из ПРЗ обработанной здоровых мышей выставлены уникальные противовоспалительное фенотип, с подавлением как презентации антигена и продукции антител.общее снижение провоспалительных адаптивных иммунных механизмов делает ПРЗ отличную методику, чтобы вызвать эндогенный иммунитета не только для ЦНС конкретных воспалительных заболеваний, но и системные травмы или болезни, которые включают модели про-воспалительной патологии.

ПРЗ снижает как объем инфаркта и нарушения ВВВ следующий переходного окклюзии средней мозговой артерии (tMCAo). Животные модели инсульта, такие как обычно используемые tMCAo, значительно улучшить понимание патофизиологии инсульта, а также разработку более эффективных neurotherapeutics. Во-первых, разработанная Коидзуми и др., В 1986 году, 8 процедура tMCAo это широко используемый метод индукции инсульта у грызунов и одним из предпочтительных методов исследования воспаление после реперфузии. В качестве способов tMCAo развиваться, более недавнее использование силиконовых покрытием волокон дополнительно снизить риск субарахноидального кровоизлияния по сравнению с другими моделями 9,10 </ SUP> и повышения надежности, хотя, к сожалению, часто tMCAo производит широкий разброс в объемах инфаркта. 11-13 Большинство из этих исследований разграничить миокарда регионы корональных срезах мозга с помощью окрашивания 2,3,5- трифенилтетразолинхлорида хлорида (TTC), считается золотой стандарт для количественного инфаркта, потому что это простой и недорогой способ позволяет получать яркие, воспроизводимых результатов. TTC служит субстратом дегидрогеназ, присутствующих в митохондриях. При срезах мозга подвергаются раствора TTC, TTC избирательно принимать во живых клеток, где его нерастворимые продукт восстановления, формазана, выпадает в осадок в глубокий красный цвет в жизнеспособных митохондрий. Из-за дисфункции митохондрий в ишемической ткани, эта ткань остается белым, что позволяет дифференциации поврежденной и здоровой ткани. 14

ПРЗ также уменьшает ВВВ нарушения в ишемической полушарии. 6 Таким образом, двойное количественное целостности BBB в той же бДожди, как ТТК основе объема инфаркта определений 15 будет предоставлять полезную информацию о полной эффективности эндогенного защиты, и потенциальные причинно-следственных связей между BBB нарушения и миокарда в необработанных и обработанных животных. Приток периферической крови через нарушается BBB, вторичной по отношению к инсульту, увеличивает популяции лейкоцитов, провоспалительных цитокинов, оксидативный стресс, Вазогенный отек и геморрагической трансформации в ишемической полушарии, в конечном счете, повышения ставок инфекции и смертности у пациентов с ишемическим инсультом . 16,17 распространенным методом измерения нарушения ВВВ на животных моделях через количественного Эванс синий (EB) утечки красителя в мозг. 15,18-21 EB селективно связывается с сывороточным альбумином, шаровидную белок (молекулярная масса = 65 кДа) что не проникает через ГЭБ в неповрежденных животных. 22 После ишемического инсульта, Е.Б. инфильтраты мозг, и флуоресцирует при 620 нм, что позволяет для измерения плотности оптического withiп перфузии паренхимы ранения. 22 Оптическая плотность прямо пропорциональна проницаемости ГЭБ при ЕВ была вымываются из посмертного коркового сосудистой путем transcardiac перфузии. С непосредственной обработки TTC-окрашенных мозга у животных с администрацией Б., как объем инфаркта и нарушение BBB может быть эффективно количественно. Следует отметить, однако, что повреждение нейронов и нарушение BBB не сопутствующие процессы в постинсультной мозга, 23,24, так выбор время умерщвления является важным фактором.

Протокол, который следует подробно метод RHP, метод tMCAo для индукции временного артериальной окклюзии, что модели среднего окклюзии мозговой артерии у больных человека, и двойные гистологические методы определения нейронных и сосудистые конечные точки травмы инсульт. ТТК измеряет гибель клеток и повреждение тканей совокупный, что позволяет для количественного определения общего инфаркта обрычажок, а EB обеспечивает полушария количественного BBB повреждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в UT Юго-западного медицинского центра, который пребывает Национальными Институтами для Здоровья (NIH) политики для экспериментального использования животных в.

1. Повторяющиеся Гипоксическая Предварительная

  1. Пользовательский дизайн четыре расходомеры на газовых регуляторов и прикрепить к стандартным 15 л индукционных камерах с трубами из ПВХ, чтобы сжатый газ из кислорода (O 2) танки течь в камерах через впускной порт. См оборудования и материалов для более подробной информации о нестандартной конструкции.
  2. Разделите мышей на 2 группы: Серийное Гипоксическая Предварительная (ПРЗ) группа, которая получит воздействия до 8% и 11% O 2, и контрольная группа, которые получают воздействия до 21% O 2 (воздух помещения) одновременно. В Таблице 1 вариаций частоты, интенсивности (8 и 11% O 2, или 21% O 2), и продолжительность (2 или 4 ч) экспозиции ПРЗ.
  3. Снимите верхнюю крышку фильтра в каждую клетку и поместите в клетку, с пищей и водой бутылки нетронутыми, в камерах, подключенных к их танков соответствующий O 2. Закрыть и закрепить крышку камеры.
    1. Открыть главный газовый клапан для резервуаров и установить начальный поток для каждого индукции камеры до 2 л в минуту (LPM) в течение первых 5 минут после контакта. Уменьшите расход до 1 LPM для остальной части экспозиции.
    2. В конце экспозиции, уменьшить поток, чтобы до 0 LPM и закройте газовый клапан для резервуаров.
    3. Откройте крышки камеры и заменить фильтр верхнюю крышку на каждую клетку. Поместите клетки, в стандартном корпусе до следующего гипоксии.
  4. Спрей вниз каждой индукционной камеру с НДП (Steris) или эквивалентной дезинфицирующим / дезодорант после каждого использования.
  5. Expose как 21% и RHP мышей, в то же время суток на протяжении двух недель, как описано в таблице 1.

2. ПереходныйСредней мозговой артерии Окклюзия (tMCAo)

  1. См Обсуждение для более подробной информации о сроках инсульта после окончательного воздействия RHP.
  2. Подготовка асептических хирургии рабочее место. Чистый окружающий рабочее с 70% этанол или эквивалентного дезинфицирующих и автоклав всех хирургических инструментов.
    1. Настройте лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) прибор для измерения относительных изменений в мозговой кровоток (CBF). Включите грелку до 37 ° C. Включите инкубатор на 34 ° С.
  3. Обезболить мышей с кратким воздействия смеси 4% изофлуран / 70% NO 2/30% O 2 в небольшом индукции камеры. Подтвердите надлежащие анестезии, слегка зажимая лапу. Если мышь отказывается лапу, вернуть курсор к индукции камеры и продолжают ИФ экспозиции.
  4. Удалить из мышей индукции анестезии камеры и быстро вставить нос мыши в носовом конусе. Откройте подачу газа в носовом конусе, закрывая поток в Anesthesia индукции камера.
    1. Без изменения 70% нет 2/30% O 2 газовой смеси, исправить изофлурана на 1,8%, так как доза для оставшейся процедуры технического обслуживания. Дыхание должно оставаться медленным и регулярно в течение всей процедуры, но если дыхание становится быстрым и поверхностным, увеличить дозу ИФ. Поддерживающая доза может варьировать от изготовления оборудования и животных, используемых в эксперименте.
  5. Использование microshaver, брить волосы на височной области между углом глаза и уха, а также вентральной срединной линии шеи. Удалите излишки меха и применять глазной смазки со стерильным ватным тампоном, чтобы сохранить роговицы от высыхания во время процедуры. Протрите разрез зона с алкоголем колодки и мазок провидон-йода с стерильной ватным тампоном, чтобы сохранить асептические условия.
  6. Администрирование анальгетиков в соответствии с руководящими принципами грызунов хирургических.
  7. Сделать надрез через кожу височной между глазом и ухом.Expose височной мышцы. Использование хирургических микро-ножницы, разрезать височной мышцы связки в височной хребта в районе белого мышц страты.
    1. Аккуратно надавите на мышечную массу в боковом щипцами для визуализации средней мозговой артерии (MCA) через череп. После разреза височной мышцы, область может заполняться кровью. Осторожно используйте ватный тампон, чтобы остановить любого потенциального кровотечения.
    2. Цель кончик зонда СОЛ в области MCA. Запишите выбранный судно, поскольку эта область меняется между мышами.
    3. Держите LDF на месте и на одном уровне с черепом, пока стабильна поток красных кровяных клеток не читать и записывать это значение в качестве базового БФК. Идеально базовый БФК на лазерной доплеровской флоуметрии в> 600 поток, но это будет варьироваться в зависимости от производителя. Если базовый НБВ <400 флюс, запись потока, скорее всего, из соседнего вену, или неполного размещения зонда над целевого сосуда.
  8. После базовой БФК установлено, repositiмыши, чтобы шея подвергается. Поддержите свою голову и держать мышь в стационарном анестезии с головная.
  9. Сделайте срединный разрез брюшной от чуть ниже нижней челюсти к ключице.
    1. Использование щипцов, тупым рассекают все поверхностной фасции, чтобы разоблачить левую общую сонную артерию (CCA). Отделите CCA от соединительной ткани и блуждающего нерва.
    2. Постоянно перевязывать ОСО с 6,0 шелковой нити. Поместите лигирования шов проксимального, как это возможно, чтобы достаточно места для закупорки размещение нити.
    3. Петля и свободно завязать второй шелк 6.0 шов вокруг дистальной ОСО в окклюдируя шва. Будьте осторожны, чтобы не закупоривать артерии, как поглощающий нити впоследствии будет продет через сонную артерию.
    4. Используйте 8 х 2 мм светло-микро serrafine areterial зажим, чтобы зажать дистальных CCA в свободно-связанного шелковой нити. Аккуратно поднимите CCA с пинцетом и сделать небольшой продольный разрез, проксимального к лигирования шва какможно с 3 мм Vännäs.
    5. Автор 12 мм кремния покрытием 6,0 калибра нейлон окклюзии нить через разрез, чтобы войти в просвет артерии, а затем продвигать его несколько мм. Свободно затянуть вторую свободную шелковую нить вокруг кончика окклюзионного нити, чтобы обеспечить кровоток не толкает нить из CCA и удалить артериальной зажим.
    6. На первом бифуркации ОСА в внутренней сонной артерии (ВСА) и наружной сонной артерии (ЭКА), резьба окклюзии нить в правой ветви первого бифуркации, чтобы войти ICA.Advance Окклюзионный нить 9 до 10,5 мм прошлого Второй шов шелковой нитью в левой внутренней сонной артерии (ВСА).
    7. Вскоре после ввода в ICA, продвигать окклюзии нить в левой ветви на втором бифуркации между МКА и pterogopalantine артерии (PPA). Визуализация PPA вряд поэтому продолжайте, пока не почувствуете легкое сопротивление при полном размещении окклюдируя нити.Подъем ICA щипцами может помочь нити, чтобы нить легче в левой ветви второго бифурка ционной. Затяните вторую шелковый шов.
    8. Переверните мышь так разрез над MCA видна. С LDF оборудования, убедитесь, что БФК заблокирован через показания LDF. Успешно окклюзия сокращение от базовой БФК> 80%.
    9. Полностью затяните и дважды узел второй шелковый шов вокруг окклюдируя нити, когда правильное положение достигается. При необходимости, слегка нажать или вытянуть нить окклюзии для достижения критериев CBF для успешного окклюзии (например, сокращение по сравнению с исходным БФК> 80%).
    10. Закройте шеи и головы отверстие с 6,0 нейлоновых швов.
  10. Место мышей в 34 ° C инкубаторе в течение всего срока окклюзии. Рекомендуемая длина окклюзии 60 мин, но это зависит возрастных, процедить зависит от различий в анатомии сосудов головного мозга, 25 и степени injurу лучшего (легкая, умеренная, тяжелая). Убедитесь, что животные в сознание в течение минут от сходит анестезии.
  11. Повторное анестезию животных с изофлуран, как описано на стадии 2.3, 5 мин до конца заранее определенного периода окклюзии, открыть головы разрез и подтвердить, что перфузии MCA до сих пор восстанавливают с использованием транскраниальной показания LDF. Если CBF не достаточно снижается (например, <20% базовой БФК), МСА имеет реперфузии в некоторый момент во время окклюзии и мышь должны быть исключены из дальнейших экспериментов.
  12. Открытие средней линии шеи разрез и свободно связать третий шелковым швом вокруг ОСО, дистальнее второго шелковой нити, но проксимальнее бифуркации CCA для того, чтобы наружную сонную артерию (ECA) остаются жизнеспособными после нить удаляется.
    1. Вырезать или развязать узел, который держит окклюзии нить (то есть второй шелковой нити) и вывести окклюзии нить медленно. После удаления, быстро закрытьТретий шелк нить вокруг ОСО, чтобы минимизировать обратный поток крови из сонной артерии. Дважды узел это шов и закрыть разрез с 6,0 нейлоновых швов.
    2. Расположите мышь, чтобы количественно уровень БФК через 5 мин реперфузии. Успешное реперфузии, как правило, определяется как БФК> 50% от базовой CBF, но, как и окклюзии потока, исследователи могут создать свою собственную критерий. Если животные обладают МК ниже 50% от их базового уровня, то, скорее всего, MCA является «постоянно» окклюзии, и, таким образом, представляет собой еще один критерий исследования исключения.
    3. Закрыть оба разрезы с 6,0 нейлоновых швов. Обеспечить физиологический раствор, обезболивающее (лидокаин), и антибиотики в соответствии с руководящими принципами грызунов. Однако некоторые небольшие дозы антибиотиков (3 мг / кг миноциклин) были признаны нейропротекторное следующего хода. 26
  13. После приходя в сознание в инкубаторе с подогретым после операции, место мышей в чистой стерильной клетке. Обеспечить смоченной FooD или пищевые биологически активные добавки гидратации гелевых и Петри воды, как животные будут ограничены мобильности следующие инсульта. Монитор животных тесно во время восстановления для чрезмерного послеоперационный боли и смерти.

3. Эванс синий (EB) для инъекций

  1. Вводите EB 22 ч после реперфузии и должны циркулировать в крови в течение 2 часов до умерщвления и окрашивание ТТС.
  2. Согласовать решение EB для инъекций (2% EB в физиологическом растворе) и осторожно смешивают при комнатной температуре. Фильтр решение через фильтровальную бумагу или толкать через фильтр 0,2 мкм, прикрепленной к небольшой шприц удаления нерастворенного EB и хранить при комнатной температуре.
  3. Подготовьте количество EB, необходимое для инъекций (4 мл / кг массы тела) обращают нужное количество краски в 0,3 куб.см инсулиновый шприц с иглой 29 и гарантировать, что решение при комнатной температуре
    1. Задержите курсор с помощью плоскую нижнюю фиксатор. Держите хвост так, чтобы боковая вена УППermost. Боковые вены расположены по обе стороны от осевой линии хвостовой. Держите кончик хвоста, чтобы держать мышь устойчивый для инъекций.
    2. Вставьте иглу в вену около 3,5 мм, стараясь не перфорировать вену. Убедитесь, что игла находится в вене, опираясь обратно на шприц и глядя на следы крови.
    3. Вводят все красителя в течение 1 мин. Если раствор собирается в вену должно быть минимальное сопротивление, как давление приложено к шприцу. Подтверждение успешного системного венозного администрации EB по немедленному изменению цвета в хвосте, конечностей и глаз мыши.
    4. Снимите иглу из хвоста и осторожно применять давление с помощью чистой марлей, чтобы остановить кровотечение.
  4. Начните времени, когда кожа мыши превращается синий. Разрешить EB циркулировать в течение 2 часов, чтобы проникнуть в ослабленной BBB.

4. 2,3,5- трифенилтетразолия хлорид (ТТС) Окрашивание

  1. Перфузии и окрашиванию TTC должно происходить через 24 ч после реперфузии.
  2. Подготовьте 2% раствор TTC до назначенного времени жертвоприношения. Добавьте 10 г порошка TTC к 500 мл 0,01 М фосфатным буферным раствором (PBS), рН 7,4. Тепло решение до 37 ° С на водяной бане, чтобы облегчить солюбилизирующих в TTC. ВНИМАНИЕ: порошок ТТК и решение кожи, легких и раздражение глаз. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с этими материалами.
    1. После того как порошок полностью не растворится, немедленно передать к бутылке, крышка в фольгу, и хранить при температуре 4 ° С. ТТК и ткани окрашивали ТТК являются светочувствительными.
  3. В 24 ч после tMCAo и 2 ч после введения EB, пожертвовать животное с ИФ передозировки в небольшом индукции камеры. Перфузии должны начать сразу же после sacricice для того, чтобы минимизировать автолиза, который начинается в отсутствие кислорода после смерти.
  4. Быстро обеспечить животноена платформе пенополистирола с предплечья, закрепленных через лапы. Вырезать боковую разрез через брюшную стенку от средней линии чуть ниже грудной клетки. Аккуратно вырежьте через диафрагму выставить сердце.
    1. Начните перфузии насоса при 5 мл / мин скорости потока с 60 см шприц с ледяной 0,01 М PBS, и подключен к 27 GUAGE крылатый инфузионной иглой. Поместите кончик иглы около 0,5 см в левом желудочке сердца и сократить правое предсердие. Постепенно до венозная кровь не появляется бесцветный разбавляют венозной крови должно течь из предсердия во время перфузии. Транскардиальную заливать 30 мл 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS) через сердце.
  5. Добавьте 5 мл раствора TTC в прозрачные бутылки 20 сцинтилляционных.
  6. Сразу же после перфузии, обезглавить животных и анализировать из мозгов, используя маленькие ножницы и шпателя, если необходимо. Изучите мозги, чтобы исключить животных, которые подверглись субарахноидальное hemorrhaGE в круг Уиллиса, вторичной по отношению к размещению шовного. Убедитесь, что полушарие контралатеральной закупоренной MCA выглядит бледным, без заметного EB утечки или отека.
  7. Налейте PBS в акриловой матрицы мозга разработан, чтобы сделать толщиной 1,0 мм корональные разделы мозга мыши. Поместите мозг, спинной стороной вверх, в матрицу и сразу же залить PBS всему мозгу. Держите мозг влажным.
    1. Удалить обонятельной луковицы путем вставки из нержавеющей стали 0,21 мм толщиной лезвия во второй слот от ростральной части матрицы.
    2. Удалить мозжечок, вставив лезвие в четвертом интервале от хвостового стороны матрицы.
    3. Вставьте лезвие в средней слот остальных слотов в матрице. Вставьте остальные ножи, равномерно деля пополам оставшуюся ткань, чтобы обеспечить наиболее равномерное распределение ткани во время нарезки.
    4. После того, как все ножи были вставлены, добавить 1 до 2 капель PBS в мозг, чтобы увлажнить его.
    5. Снимите ножс по одному из матрицы, начиная с ростральной области. Держите первые 7 ломтики для анализа TTC после tMCAo. Используйте маленькую лопаточку, чтобы тщательно передачи ломтики от лезвия к ТТК-заполнены флаконе.
  8. После того как все разделы во флаконе, крышка и поместить в теплую ванну воды до тех пор, пока разделы розовеют. Осторожно поверните бутылку в ванной, если это необходимо, чтобы избежать дублирования раздел, который может привести к неравномерному окрашиванию. Затем утилизировать TTC и залить 4% -ный раствор параформальдегида во флакон, чтобы покрыть срезы головного мозга прекратить TTC химическую реакцию.
  9. Сразу организовать разделы по чистой 1 "х 3" стекло и ориентировать разделы из ростральнее хвостового.
    1. Когда секции расположены на слайде, сканирование слайдов с использованием стандартного сканера. Установите разрешение в минимум 600 точек на дюйм для анализа изображений. Будьте уверены, чтобы включать в себя имя животного и метрической линейкой в ​​отсканированном изображении.
    2. Переверните слайди сканировать обратную сторону, чтобы обеспечить все данные, собранные.

5. Инфаркт Объем Количественное

  1. Количественно объем инфаркта с помощью программного обеспечения для анализа изображений стандарта (например, ImageJ).
  2. Сканирование изображений с высоким разрешением (например, 600 DPI) для адекватного анализа. Кадрирование изображений. Стандартизация масштаб для всех изображений с использованием метрики правителя входит в отсканированном изображении.
  3. Вычислить общий объем контралатерального полушария, используя следующую формулу. Повторите эту формулу для вычисления общего объема ипсилатерального полушария.
    Сумма общего контралатерального полушария каждого среза толщиной х ломтик
  4. Рассчитать косвенный объем инфаркта. . Контроль за ипсилатеральном отека от инсульта с помощью здорового, контралатеральной полушарии в качестве контроля 27 Используйте следующую формулу для расчета косвенное объем инфаркта:
    Общий объем контралатерального полушария -
    (Всего Volumе ипсилатеральном полушарии -Средняя объем 3 измерений инфаркта)

6. гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) Честность Количественное

  1. Чтобы подготовиться к EB количественного сначала взвесить 2,5-дюймовый весит лодки. Запишите вес и маркировать две лодки весят для каждого животного: один для ипсилатеральном полушарии и один для контралатеральной полушарии.
  2. После сканирования TTC-окрашенных участков, пополам каждую секцию с одноразовой бритвой в ипсилатеральных и контралатеральной полушарий. Поместите ипсилатеральные полушария из всех 7 секций в весовой лодке и записывать вес. Повторите для противоположной полушарии.
  3. Сразу перенести вес лодки в сушильном шкафу в течение 56 ° С в течение 48 ч.
  4. Взвесьте высушенные участки. Перевести оба полушария в отдельных 1,5 мл микропробирок.
    1. Рассчитать количество формамида, необходимого для каждого полушария (8 мл / г сухого ткани), и добавить к их соответствующим microcentrifugе трубы. Формамид светочувствительных и охватывают все образцы формамида лечение в фольге с этого момента.
    2. Передача микроцентрифужных пробирок, чтобы инкубатор до 56 ° С в течение еще 48 ч.
  5. После 48 ч, пипетки из синий супернатант в другой набор меченых микроцентрифужных пробирках. Нажмите ткани в нижней части трубки, чтобы увеличить объем извлеченного супернатанта. Держите трубки супернатанта и распоряжаться всем ткани.
  6. Подготовьте экспоненциальные серийных разведений EB в формамиде для стандартной кривой. Включайте 1 пустые (формамида только), а затем 10 экспоненциальные решения от 0,125 мкг / мл через 64 ​​мкг / мл EB в формамидом.
    1. Пипетировать 300 мкл разведений, сделанных для стандартной кривой в 96-луночный планшет. Пипетировать 300 мкл супернатанта в соответствующие лунки.
    2. Измеряют поглощение на спектрофотометре при длине волны 620 нм.
    3. Сравнение стандартной кривой разведений EB с поглощения Oе надосадочной образцов. Оптическую плотность прямо пропорциональна целостности BBB.
    4. Предположим, оптическую плотность контралатеральной полушария в качестве фона и использовать формулу (ипсилатерального-контралатеральной) / контралатеральной определить кратное изменение. Для получения более подробной информации о статистическом анализе см Мартин и др., 2010 18

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В исследование было включено 25 мужчин мышей Swiss Webster, которые были 10-недельного возраста в начале рандомизации в ПРЗ (п = 10) или 21% O 2 (п = 15) группы. Через две недели после последней экспозиции RHP, хирургические процедуры проводились с группами слепым и уравновешенный между дней. После tMCAo, 1 мышь умерла во время послеоперационного восстановления и 1 мышь исключены из исследования, поскольку она не отвечает критерию реперфузии CBF. Оба исключены мышей от 21% O 2 группы. В соответстви...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одноразовое воздействие системной гипоксии (то есть, 2 ч 11% O 2) у мышей "временно" защищает мозг от tMCAo, 29 означает эпигенетические ответ на вызов гипоксического прекондиционирования является кратковременным, и базовый фенотип восстанавливается в течение дней. Повторяющиеся презентации гипоксического стимула предварительной подготовки резко увеличить продолжительность нейропротективного фенотипа. 6 Многие исследования показали, что частота, величина и продолжитель...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Особая благодарность лаборатории Gidday за их работу по разработке протокола RHP, а также Neuro-Models Facility (UTSW) за их помощь в операциях tMCAo. Эта работа была поддержана грантами Американской кардиологической ассоциации (AMS), Центра травм и восстановления головного мозга Хаггерти (UTSW; AMS) и Фонд исследования спастического паралича округа Иллинойс-Восточная Айова компании Kiwanis International (JMG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Расходомеры, регуляторыVetEquip, IncСпециальный заказЧетыре расходомера крепятся к гибкой трубке из ПВХ толщиной 6,0 мм, которая подключается к входному порту на каждой индукционной камере с помощью пластикового гнездового соединителя. Эти расходомеры крепятся болтами к металлическому стержню размером 6,5 x 1 x 1 дюйм. Этот металлический стержень крепится болтами к манометру МИ-246-с выпускным отверстием ДИСС. Это оборудование для манометра и расходомера можно прикрепить к каждому новому газовому баллону с помощью гаечного ключа.
21% O2 бакAirGasOX USP200
11% O2 бакAirGasСпециальный заказ
8% O2 бак AirGasСпециальный заказ
15 л индукционные камерыVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Moor Instruments moorVMS-LDF1-HPЗонд диаметром 0,8 мм 
Осветитель высокой интенсивности NikonNI-150
Зум-стереомикроскоп NIkonSMZ800Можно использовать другие хирургические микроскопы.
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationСнято с производстваРекомендуемой заменой является PhysioSuite с RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT).
Инкубатор HovabatorStromberg's2362-EНаша модель - 2362N. 2362E - это более поздняя модель, которая включает в себя электронный термостат.
V010 Система анестезии VetEquip901807Включает в себя: десятифутовый кислородный шланг высокого давления, раму, расходомер, узел промывки кислорода, испаритель, дыхательный контур, камеру, носовые конусы, трубку для отвода отработанных газов и два фильтра VapoGuard
250 мл изофлурана;Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Аккумуляторный триммер для животных Андис #23905Запасные лезвия можно приобрести у Andis (#23995)
Betadine Научный центр Фишера19-898-867 
Советыпо работе с несколькими продавцами Каталожный номер отсутствует 
Марлевые салфеткиFisher Scientific67622
Хирургическая простыняFisher ScientificGM300 
Шелковые шовные материалы Look/Div Хирургические специальностиSP115
Нейлоновые шовные материалыLook/Div Хирургические специальностиSP185
Durmont #5 щипцы (2) Инструменты для изобразительной науки 11251-35Угловой 45&�;
Хирургические ножницыFine Science Tools 14028-10
3 мм VannasKent Scientific CorporationINS600177Прямое лезвие
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Окклюзионные нитиВашингтонский университетСпециальный заказНити покрываются силиконом в Вашингтонском университете и поставляются в учреждения UTSW за плату.
Эванс БлюСигма ОлдричE2129-10G
Фильтровальная бумага Sigma AldritchWHA1001150150 мм, круги, Grade 1 
Весовые лодкиFisher Scientific02-202-101диаметр 2,5 дюйма
0,9% Впрыск хлорида натрия USP Фармацевтика компании «Бакстер» 2B1321
Инсулиновый шприц 0,3 мл с иглой 29 калибраBecton Dickinson Labware309301
Ограничитель с плоским дном Braintree Scientific FB  M2,0 дюйма диаметр
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7,4Fisher ScientificBP399-20
Водяная баняНесколько продавцов Каталожный номер отсутствует Сцинтилляционные трубки с TTC можно вручную удерживать под проточной теплой водой в качестве альтернативы водяной бане.
Пенополистирольная плитаНесколько продавцов Каталожный номер отсутствует 
Большой набор шприцевPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Перфузионный насосPumpSystems IncNE-300 
Шприц 60 млFisher ScientificNC9203256
27 калибр крылатый инфузионный наборKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
20 мл сцинтилляционный флаконFisher Scientific50-367-126
Шпатель из нержавеющей сталиFisher Scientific14-373-25A
Alto акрил 1,0 мм мозг мыши, корональныйCellPoint Научные Каталожный номер отсутствует 
Лезвия из нержавеющей стали 0,21 мм, 25 шт.CellPoint Scientific Каталожный номер отсутствует Многоразовые лезвия для криостата являются недорогой альтернативой.
4% параформальдегидSanta Cruz Biotechnology SC-281692
Предметные стекла для микроскопа Superfrost Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Несколько продавцов Каталожный номер отсутствует Другие коммерческие сканеры подходят для этого этапа протокола.
ИзображениеJ Национального института здравоохраненияотсутствует 
Аналитические весыMettler Toledo XSE 205U
Прецизионная компактная печь   Термо Научный 
Микроцентрифужные пробирки 1,7 мл (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
ФормамидFisher ScientificBP228-100
96-луночные планшетыFisher Scientific07-200-9
Epoch микропланшетный спектрофотометр BioTek Каталожный номер отсутствует 
Номер в каталоге PR305225M

Ссылки

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
  3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
  4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
  5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
  6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
  7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22(2014).
  8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
  11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561(2013).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
  14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
  15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
  16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
  18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
  19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
  20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019(2012).
  22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
  23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
  24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
  25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
  26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7(2004).
  27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
  28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517(2010).
  29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
  30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
  31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065(2013).
  32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
  33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
  34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
  38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
  41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
  42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
  44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
  45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
  46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
  47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
  48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
  49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Количественное нейрососудистой защите После Серийное гипоксического прекондиционирования и переходных средней мозговой артерии Окклюзия у мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.