Методическая статья

Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52685

⸱

17 апреля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается автоматизированный подход к выбору размера геля для очистки фрагментов ДНК для секвенирования следующего поколения. Технология Ranger обеспечивает полную автоматизацию всего процесса загрузки агарозного геля, электрофоретического анализа и восстановления целевых фрагментов ДНК, что позволяет создавать высокопроизводительные и высококачественные библиотеки секвенирования нового поколения.

Аннотация

Секвенирование образцов окружающей среды нового поколения может быть сложной задачей из-за переменного количества и качества ДНК в этих образцах. Высококачественные библиотеки ДНК необходимы для получения оптимальных результатов секвенирования нового поколения. Образцы окружающей среды, такие как вода, могут иметь низкое качество и количество ДНК, а также загрязняющие вещества, которые выпадают в осадок вместе с ДНК. Механические и ферментативные процессы, связанные с экстракцией и подготовкой библиотеки, могут еще больше повредить ДНК. Выбор размера геля позволяет очищать и восстанавливать фрагменты ДНК определенного размера для применения в секвенировании. Тем не менее, эта задача является одним из самых трудоемких этапов в процессе подготовки библиотеки ДНК. Описанный здесь протокол позволяет полностью автоматизировать загрузку агарозного геля, электрофоретический анализ и восстановление целевых фрагментов ДНК.

В этом исследовании мы описываем высокопроизводительный подход к подготовке высококачественных библиотек ДНК из образцов пресной воды, которые также могут быть применены к другим образцам окружающей среды. Мы использовали косвенный подход для концентрации бактериальных клеток из образцов пресной воды; ДНК экстрагировали с помощью коммерчески доступного набора для экстракции ДНК, а библиотеки ДНК готовили с использованием коммерческого протокола на основе транспозонов. Фрагменты ДНК размером от 500 до 800.н. были выбраны по размеру геля с помощью автоматизированной рабочей станции для электрофореза Ranger Technology. Секвенирование выбранных по размеру библиотек ДНК продемонстрировало значительное улучшение длины чтения и качества чтения секвенирования.

Введение

Метагеномика включает в себя секвенирование всего генетического материала в образце для характеристики присутствующих микробных сообществ. Это сложный и дорогостоящий процесс, который включает в себя преобразование экстрагированных нуклеиновых кислот в библиотеки ДНК с последующим секвенированием нового поколения. Высококачественные библиотеки необходимы для максимального вывода данных и точного метагеномного анализа. Образцы окружающей среды, такие как пробы воды, часто создают значительные трудности для создания высококачественных библиотек из-за низкого количества ДНК, которая также может быть разложенана 1-3, и присутствия ингибиторов ПЦР4-6.

Высококачественные библиотеки идеально состоят из более длинных сегментов ДНК в узком диапазоне длин. Для того чтобы максимизировать объем полезных данных, генерируемых за один прогон секвенирования, длина ДНК в библиотеке должна быть по крайней мере такой же, как максимальная длина чтения используемого метода секвенирования. При использовании технологии секвенирования путем синтеза, такой как Illumina MiSeq, размер фрагментов ДНК влияет на эффективность, с которой кластеры генерируются в проточной ячейке. Например, когда библиотека содержит как более короткие, так и более длинные фрагменты ДНК, более короткие из них будут чрезмерно представлены в данных секвенирования7,8. Напротив, библиотека с фрагментами ДНК аналогичного размера будет пропорционально представлена в данных секвенирования. Во многих наборах для подготовки библиотек используются методы, основанные на лигировании, для добавления адаптеров к фрагментам ДНК, а для удаления димеров адаптеров, не содержащих вставку9,10, необходим подбор размера. Для достижения этой цели существует множество методов11,12, но единственным методом, который дает наиболее стабильные результаты, является электрофоретическое разделение ДНК с последующим восстановлением желаемой длины ДНК13,14. Этот процесс может быть выполнен вручную для небольшого количества образцов, но когда сталкиваешься с обработкой сотен образцов, требуются автоматизированные решения. Доступные в настоящее время платформы для автоматизированного выбора размера геля имеют низкую пропускную способность, и необходимы новые платформы для обработки большого количества образцов для секвенирования. Технология Ranger может быть интегрирована с существующими рабочими станциями по работе с жидкостями, что позволяет использовать электрофорез в агарозном геле для выбора размера и аналитических целей в масштабе, который удовлетворяет современным условиям с высокой пропускной способностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Вода Сбор и фильтрация

  1. Соберите образцы пресной воды с различных сайтов (рисунок 1). Проход образцы через серию фильтров: 1 мкм фильтр, 0,2 мкм фильтр, и 30 кДа среза фильтра тангенциального потока систематически отдельные эукариотической, бактериальные и вирусные частицы размера, соответственно.
    Примечание: только очищение и анализ материала извлеченного на фильтрах 0,2 мкм (свободно живущие бактерии) описано в этом докладе, но аналогичные подходы могут быть использованы для других частиц, извлеченных из фильтров.

2. концентрация бактерий, ДНК Выделение и очистка

  1. Извлеките мембранный фильтр (ы) 0,2 мкм от системы фильтрации воды (схеме, рис 2). Сложите фильтр 0,2 мкм диска пополам и поместите его в 50 мл пробирку с открытым стороной вверх. Добавить 5 мл 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и 0,01% Tween, рН 7,4 вТрубка. Если более чем один фильтр используется в процессе используют различные трубки на фильтр. Магазин трубка (и) с фильтром при 4 ° С до обработки. В противном случае перейдите к шагу 2.2.
  2. Извлеките 0,2 мкм мембранный фильтр с 50 мл пробирку с стерильным пинцетом. Место фильтр (ы) на чашку Петри (оставить буфер PBS в трубку).
    1. С стерильным пинцетом и стерильными ножницами, вырезать фильтр на мелкие полоски (1 см х 1 см). Лечить щипцы и ножницы путем замачивания в 70% изопропанола, вытирая с ДНК поверхности дезинфицирующим и промывки сверхчистой воды типа 1 между различными образцами.
  3. Поместите фильтр разрезают на полосы обратно в ту же пробирку на 50 мл. Добавьте 10 мл 1x PBS и 0,01% Твин, рН 7,4 с фильтром, так что в общей сложности 15 мл буфера в 50 мл пробирку.
  4. Добавить 6 чистые шарики вольфрама (диаметром 3 мм) в каждую 50 мл пробирку, закройте пробирку с парафильмом и вихрь энергично в течение 20 мин (используйте 50 мл пробирки вихревой адаптер). Если мультниям фильтры обрабатываются от одного образца, передачи и бассейна всего гомогената в чистую пробирку на 50 мл. Центрифуга трубки на 3300 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
  5. Ресуспендируют осадок и аликвотных бактериальных клеток (~ 1 мл аликвоты) в 1,7 мл микроцентрифужных пробирках. Следует отметить, что там будет 5 микроцентрифужных пробирках в образце.
  6. Спин вниз микроцентрифужных пробирок на 10 000 мкг в течение 10 мин, и удалить большинство из супернатанта до ~ 200 мкл метки.
  7. Храните образцы при -80 ° С, или перейти извлечь бактериальной ДНК с помощью имеющихся в продаже набор для выделения ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя. В бактериальной использованием экстракции ДНК либо PBS или воды в качестве отрицательного контроля экстракции и Е. палочки в качестве положительного контроля экстракции.
  8. Потому что ДНК из нескольких трубок извлечении, бассейн параллельных суб-аликвот из одной и той же пробы в одном 2 мл пробирку. Затем провести осаждение N / O с использованием раствора, состоящего из 0,1Объемы 3 М ацетата натрия, 2 объемами 100% -ного этанола и 5 мкл 5 мкг / мкл линейной акриламид. Все хорошо перемешать и хранить образцы при -80 ° C.
  9. Центрифуга на максимальной скорости (17000 х г) в течение 30 мин при 4 ° С. Вымойте гранул с 1 мл ледяной 70% этанола, сухой воздух в шкафу биобезопасности не более чем на 5 мин и ресуспендируют осадок ДНК в 34 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
    Примечание: Линейный акриламида поможет визуализировать ДНК гранул после O / N осадков.
  10. Определить количество ДНК и качество с высокой чувствительностью люминесцентные нуклеиновой количественного кислота анализа и микрообъема спектрофотометр, соответственно, следуя инструкциям изготовителя (табл материалов).
    Примечание: Если несколько образцов готовятся в то время, сверхчувствительные флуоресцентный анализ нуклеиновой кислоты для количественного дц и пластины на основе флуорометр / спектрофотометр может быть использован вместо.

3. ДНК Подготовка Библиотека

  1. Нормализация геномной бактериальной ДНК, выделенной из образцов воды до концентрации ~ 0,2 нг / мкл.
  2. Ферментативно фрагмент один нанограмм бактериальной ДНК с использованием способа на основе транспозона (tagmentation). Добавить адаптер и индекса последовательности на фрагментированной ДНК, следуя инструкциям изготовителя. Тема tagmented образцы до 12 циклов ПЦР, как указано в инструкциях изготовителя, и в этот момент индексы секвенирования Incorporated.

Выбор размера 4. Автоматизированная гель

  1. Перейти стандартную после ПЦР очистке шаг, описанный в инструкции завода-изготовителя (табл материалов). Выбрать размер образцов после ПЦР непосредственно с помощью автоматизированной гель на основе выбора формата платформы.
    1. Добавить 3,5 мкл загрузочного буфера к каждому образцу.
    2. В соответствии с протоколом производителя, загрузить образцы на станции электрофореза, определяющая цель размер отбор 500-800 б.п., в экстракте 300 мклионный объем, с использованием сборных 1,5% агарозном кассету.
    3. Концентрат сырой выходного материала (300 мкл) до 25 мкл с помощью осаждения этанолом.
      Примечание: Также можно использовать рабочую станцию ​​электрофореза для автоматизации концентрации для большего числа образцов через пластину фильтра и вакуумного коллектора.
      1. Осадок объем сырой элюции с использованием 0,1 объемов 3 М ацетата натрия, 2 объемами 100% -ного этанола и 5 мкл 5 мкг / мкл линейной акриламид. Все хорошо перемешать, место образцов при -80 ° CO / N. Центрифуга образцов при 17000 х г в течение 30 мин.
      2. Отменить супернатанты и приступить к мыть ДНК гранул с 1 мл охлажденного льдом 70% этанола.
      3. Центрифуга образцов снова при 17000 х г в течение 30 мин, отбросить супернатанты, сухой воздух, и, наконец, ресуспендируют осадок ДНК в 25 мкл 10 мМ Трис-Cl, рН 8,5.
  2. (Необязательно) Используйте 1 мкл размер библиотек ДНК, выбранного с помощью автоматизированной выбора размера гель платформы, чтобы сделать пять-кратной разбавления с использованием буферного раствора трис-ЭДТА, рН 8,0. Анализ библиотеки, используя чип на основе капиллярного электрофореза инструмент для анализа двухцепочечной ДНК качества в соответствии с инструкциями изготовителя.

5. Библиотека Нормализация и секвенирование

  1. Перейдите к нормализации образцов с использованием библиотеки бисер нормализации (входящих в состав препарата библиотека комплекта транспозонов основе), как описано в Руководство по подготовке производителя.
    1. Кроме того, мера дцДНК библиотеки с использованием высокой чувствительности флуоресцентного нуклеиновой количественный кислота анализа, а затем путем объединения в эквимолярных соотношениях, чтобы достичь конечной концентрации дц 2 нм. Перейдите к денатурации библиотеки, используя 10 мкл объединенных библиотек и 10 мкл 0,2 N NaOH, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Развести денатурированные библиотек с использованием гибридизации буфер (поставляется с комплектом подготовки транспозонов основе) до конечного объема 1 мл и концентрации 11:05 вечера.
  2. Образец нагрузкис в секвенирования платформы следующего поколения, следуя стандартным протоколам секвенирования производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Концентрация ДНК и оценки качества

Бактериальные концентрации ДНК в диапазоне от 0,01 до 0,11 нг / мл в пробе воды из различных сайтов водосборных (таблица 1). ДНК, выделенная из бактерий фракции было 260/280 и А 260/230 отношения от 1,4 до 1,8 и от 0,3 до 1,6, соответственно. В то время как некоторые из 260/230 соотношения были относительно низкими, никаких видимых ингибирования не наблюдалось в подготовленном библиотекой и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наличие адаптера димеров и кластеров малых размеров вставки преимущественно быть упорядочены в современных платформах представляют собой уменьшение пригодные для использования выходами и недоиспользование мощность аппарата, в 15. Использование бортовых методов биений в сочетании с подход транспозонов основе подготовить библиотеки может привести к дополнительной сдвига ДНК по сравнению с другими методами экстракции 4,5. Тем не менее, все способы добычи и библиотеки подготовки потенциально ввести пре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Джаред Р. Слободан и Мэтью Дж Несбитт и держать акции прибрежных геномики, частная корпорация Британской Колумбии, предлагающий Ranger Technology.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Genome BC, Genome Canada и Coastal Genomics. Авторы благодарят Кирби Кронина и Майкла Чана за помощь в сборе и обработке образцов. Мы также выражаем признательность Теа Ван Россум и доктору Фионе Бринкман за помощь в области биоинформатики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Перистальтический насос Masterflex P/S серии 1400Thermo Scientific 1400-1620
0,2 & микро; m Supor MembraneVWRCA28143-969Pall Corporation, Энн Харбор, Мичиган
Шарики карбида вольфрама 3 мм (200)Qiagen69997
Изопропиловый спирт 70%Jedmon Products825751Healthcare Plus DNA
awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. Сан-Диего, Калифорния
Система очистки воды Milli-QFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Эта система была снята с производства.
20x PBS pH 7,5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher химикаты
Vortex адаптер для 2 (50  мл) трубкиVWR13000-V1-50MoBio, Carlsbad, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (модель G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Beckman CentrifugeRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModel J-6B
PowerLyzer Powersoil DNA isolation kitVWR12855-100MoBio, Carlsbad, CA
Vortex адаптер на 24 (1,5-2 мл) пробиркиVWR13000-V1-24MoBio, Carlsbad, CA
Microfuge 18 центрифугаBeckman Coulter367160
Nimbus Select рабочая станция с Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Включает в себя рабочую станцию для работы с жидкостями и интегрированный Ranger Tech (оборудование для электрофореза)
Набор реагентов RangerCoastal GenomicsCG-10600-150-12-21Включает загрузочный буфер и кассеты
Этиловый спирт (безводный)Коммерческие спиртыP016EAANGreenfield Этанол
Ацетат натрияSigma-AldrichS2889-250G
Линейный акриламид (5  мг/мл)Life TechnologiesAM9520Ambion
Eppendorf рефрижераторная центрифугаRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Buffer EB (250 мл)Qiagen19086
NanoDrop 1000 СпектрофотометрThermo ScientificND-1000
Qubit ФлуориметрLife TechnologiesQ32857Invitrogen. Данный продукт был снят с производства.
Набор для анализа Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Высокочувствительный реактивДНК Agilent Technologies5067-4626
Высокочувствительные ДНК-чипыAgilent Technologies5067-4626
Биоанализатор Agilent 2011 AgilentTechnologiesG2938B
Nextera XT набор для подготовки образцов ДНКIlluminaFC-131-1024
Индексный набор Nextera XTIlluminaFC-131-1001
Набор реагентов MiSeq v2 (500 циклов)IlluminaMS-102-2003
Система MiseqIlluminaSY-410-1003

Ссылки

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320(2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18(2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18(2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ranger500 800

Похожие статьи