Мезенхимальные стволовые клетки обычно получают из костного мозга и требуют культивирования для расширения. Когда образцы сворачиваются перед обработкой, может быть применен протокол с использованием (ферментативного) тромболитического препарата урокиназы для разрушения тромба. Таким образом, клетки высвобождаются и становятся доступными для культивирования экспансии. Этот протокол представляет собой быструю и недорогую альтернативу ресэмплингу.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ферментативный метод для того чтобы спасти мезенхимальных стволовых клеток из запекшейся образцы костного мозга
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), обычно получаемые из костного мозга, часто требуют культивирования для расширения. В нашем протоколе используется урокиназа клинического класса для разрушения тромбов в костном мозге и высвобождения МСК для дальнейшего использования. Этот протокол представляет собой быструю и недорогую альтернативу повторному забору образцов костного мозга. Костный мозг является основным источником МСК, которые представляют интерес для тканевой инженерии и терапии аутологичными стволовыми клетками. При выводе костный мозг может сворачиваться, так как он включает в себя всю кроветворную систему. Образующиеся сгустки также содержат МСК, которые теряются для культивирования экспансии или прямой терапии стволовыми клетками. Мы обнаружили, что 74% образцов костного мозга собак содержали сгустки и дали менее половины ожидаемого количества стволовых клеток, полученного из несвернутых образцов. Таким образом, мы разработали протокол ферментативного расщепления этих сгустков, чтобы избежать трудоемкой и дорогостоящей ресамплизации костного мозга. Урокиназа – клинически одобренный и легкодоступный тромболитический препарат – практически полностью удаляет тромбы костного мозга. Как следствие, обработанные аспираты костного мозга дают такое же количество МСК, как и несвернутые образцы. Кроме того, после лечения урокиназой клетки сохранили свою метаболическую активность и способность дифференцироваться в хондрогенные, остеогенные и адипогенные линии. Наш протокол позволяет сохранить свернувшуюся кровь и образцы костного мозга, не влияя на качество клеток. Это позволяет отказаться от повторного отбора проб, значительно снизить затраты на отбор проб и использовать свернувшиеся образцы для исследований или терапии.
Введение
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) играют важную роль в восстановительной медицины и тканевой инженерии. Они могут мигрировать, дифференцироваться в различные типы клеток 1 и привить, что делает их идеальным кандидатов на аутологичных терапии 2,3. В последнее время, клинические испытания с использованием МСК для восстановления костей и хрящей, привитые против хозяина или болезни сердца были запущены 4. Эти МСК могут быть собраны из пуповинной или жировой ткани, но наиболее обнадеживающие результаты были получены из костного мозга стволовых клеток, полученных 5.
Гребень подвздошной кости позволяет собрать значительное количество костного мозга и, следовательно, служит основной сайт стремления 6. Тем не менее, качество аспирата уменьшается с увеличением объёма костного мозга сняты. В то время как первые 5 мл аспирата костного мозга содержат МСК высокого качества, вывод больших объемов приводит к размыванию аспирата с периферической крови FПЗУ насыщена сосудами кости 7. Из-за существующих мегакариоцитов и тромбоцитов, клетках костного мозга склонны к свертыванию, если не используются антикоагулянты. Но даже с антикоагулянтами, может возникнуть сгустки.
В костном мозге, МСК представляют собой лишь небольшую долю от общего пула клеток 8 и должны быть расширены в культуре в течение большей тканевой инженерии или терапевтических применений 4. Качество такой культуры во многом зависит от исходного пула клеток, т.е.., Разнообразие и высокий пусковой число 9. Низкое число МСК из изъятий может быть частично объяснено изменчивости доноров. С другой стороны, МСК от низкой образцов качества требуют более длительного времени в культуре и расширенный пассирования, чтобы достичь желаемого количества клеток. В любом случае, расширить пассирования является источником клеточного старения и может привести к потере потенциальной дифференциации 10. Таким образом, оптимизируется протоколы, которые могут максимально клеток уIELD и предотвратить нежелательные эффекты должны быть разработаны 11,12.
Когда мы начали работать с собачьими МСК, мы были удивлены увидеть, что около трех из четырех собак образцы костного мозга содержатся сгустки, в то время как, к счастью, со сгустками человека образцы (один из десяти) были менее частыми. С другой стороны, это не было неожиданностью, что мы наблюдали гораздо меньший выход МСК из запекшейся образцов. Для решения повторяющихся вопрос о сгустками образцов, мы разработали протокол, используя тромболитической урокиназы наркотиков, а ресэмплирования.
Тромболитические терапии может противодействовать ситуациях, угрожающих жизни, таких как окклюзии кровеносных сосудов, вызывая инфаркт, инсульт или эмболии из-за нежелательного свертывания. Они работают путем деградации тромбов с помощью ферментативного расщепления фибрина плазмином и ферментативного активаторов плазминогена. Несмотря на широкое использование для лечения больных, только очень немногие публикации существуют, которые использовали тромболитическими деятельностьдля лабораторных применений, чтобы спасти сгустками образцы, в основном сосредоточив внимание на лимфоциты. В 1987 году Нику и др. описано применение стрептокиназы для растворения сгустков крови, получаемые в функциональных лимфоцитов 13 и четыре года спустя, De Vis и др. продлить срок использования стрептокиназы, чтобы изолировать лейкозных клеток из крови и костного мозга для проточной цитометрии приложений 14. Более недавняя публикация предполагает использование Alteplase для диагностики рака 15. При использовании же ферментативной подход, наш протокол фокусируется на изоляции мультипотентной МСК форма костного мозга, чтобы обеспечить средства для исследователей в области стволовых клеток.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: клетках костного мозга человека от гребня подвздошной кости были собраны из согласие доноров с одобрения комитета по этике кантона Люцерн. Собачьи клетках костного мозга от гребня подвздошной кости были собраны с consent.Human владельца собаки (ок. 20 мл) и собак (ок. 10 мл) клетках костного мозга были анти-коагулируют добавлением 15 мл 3,8% цитрата натрия сразу после отмены в операционной. Образцы были переданы в лабораторных условиях для обработки тот же день, изъяты.
1. Подготовка урокиназы (До 1-го использования)
- Развести урокиназа, используя стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) в соответствии с инструкциями изготовителя: Добавить 10 мл PBS с перегородкой всасывания колбу с помощью 10 мл шприц. Растворите сухое вещество, вращая, чтобы получить 50 000 единиц инъекций (U) на мл.
- Подготовка 500 мкл аликвоты (25000 U каждый), в сterile трубы. Магазин аликвоты -20 ° C и использовать его при необходимости, по крайней мере, 6 месяцев.
2. Подготовительные шаги (перед каждым костного мозга Лечение)
- Оттепель один аликвоту урокиназы (25000 U) в запекшейся аспирата костного мозга (аспирата объемы до 25 мл успешно лечили с помощью одного аликвоту 25000 U).
- Разогрейте на водяной бане или встряхивания инкубатор до 37 ° C.
3. Ферментативный Дайджест Сгусток
- Выполните все работы в ламинарном шкафу поток биобезопасности, чтобы избежать микробного загрязнения образцов костного мозга в процессе обработки. При работе с потенциально инфекционными человеческого материала, использование защитных перчаток, а также бережного обращения рекомендуется.
- Поместите 100 мкм клеточный фильтр сверху стерильную пробирку на 50 мл. Осторожно вылейте аспирации костного мозга через ячейки сетчатого фильтра, наклоняя фильтр или перемещение вокруг сгустка материала. Используйте стерильный наконечник пипетки длялучше поток через сетчатый фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разбавления сгустка, например, путем промывания сгусток с PBS. Urokinase действует косвенно и требует компоненты сыворотки (т.е.. Плазминогена) от биопсии для эффективного дайджеста. Продолжая процедуру с сгустка материала, фильтрат не может быть при комнатной температуре до дальнейшего использования на стадии 3.6. - Трансфер сгусток материала костного мозга в пустую ячейку культуры блюдо использованием стерильного пинцета. Сокращение мусора на мелкие кусочки приблизительно 2 мм 3 с использованием стерильным скальпелем.
- Передача небольшие кусочки тромба в 50 мл реакционной трубки с помощью стерильного пинцета. Убедитесь, что фарш сгусток имеет влажный внешний вид. Если это, кажется, быть сухой, использовать некоторые из фильтрата со стадии 3.1, чтобы увлажнить.
- Растирают сгусток с помощью пипетки вверх и вниз по 5 раз с помощью 5 мл микротитровальный пипетки. Добавить 1 аликвоты урокиназы в образце. Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С либо в водяной бане или впожимая (мягко) инкубатор.
- Triturate с помощью пипетки вверх и вниз по 5 раз с помощью 5 мл пипетки. Выполните этот шаг в шкафу биобезопасности. Инкубировать в течение еще 30 мин при 37 ° С. После инкубации растирают снова в 5 раз с помощью 5 мл пипетки. Пойдите свежий фильтр 100 мкм клеток для объединения с фильтратом со стадии 3.2.
- Центрифуга клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 10 мин при 500 х г. Удалите супернатант. Повторное приостановить осадок клеток в средствах массовой информации, как описано ниже или в соответствии со стандартной процедурой в вашей лаборатории для МСЦ расширения культуры.
4. Посев для расширения клеточной культуре и КОЕ Плиты
- Ресуспендируют клеток (состоящая из эритроцитов и мононуклеарных клеток) в 50 мл базальной среды: Альфа-MEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 2,5 мг / мл амфотерицина . Граф клеток разбавленный 1:10 в трипанового синего раствора с использованием Chambe Нейбауерар.
- Пластина клеток в культуре клеток колбах при плотности 5 х 10 7 клеток / см 2 и инкубировать в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Если возможно, используйте гипоксию (5% кислорода) условиях. Для контроля анализа КОЕ, пластина 10 9 клеток в клеточной культуральной чашке диаметром 10 см.
- После 3 дней культивирования, мезенхимальные стволовые клетки прикреплены к клеточной культуральной чашке, а другие клетки остаются в суспензии. Изменение среды с базальной среде, дополненной 5 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Для пробирного контроля КОЕ, лечить блюдо культуре клеток также.
- Продолжить клеточной культуры в общей сложности 2 недель, обмен средствам массовой три раза в неделю. Если клетки превышать 80% слияния, расщепляется трипсином. Для пробирного контроля КОЕ, обменять СМИ также, но не разделить клетки для течение двух недель.
5. Гимза для CFU Пробирной
- Подготовка 10 мл Гимза-решения на чашку: DILЮт раствор (7,6 г / л Гимза в глицерине: метанол) 1:10 в стерильной воде (всегда свежеприготовленной Рабочее разведение).
- Выньте материал из культуры клеток блюдо и мыть клетки с PBS. Будьте очень precautious при применении жидкости в чашку Петри и избежать смывания клетки.
- Исправить клетки в чистом метаноле в течение 5 минут при комнатной температуре. Отменить метанола. Добавьте Giemsa-раствор и инкубируют в течение 60 мин в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Промыть два раза с PBS. Воздух сухой плиты головой на бумажное полотенце. Граф колонии вручную. Это лучше всего достигается с помощью маркера ручку на задней пластине.
6. MSC Дифференциация
- Собачьи МСК дифференциация
ПРИМЕЧАНИЕ: Собаки МСК были дифференцированы в Хондрогенные, остеогенного и адипогенных линий путем стимуляции с соответствующим СМИ в течение четырех недель. - Для Того Adipogenic дифференциация, культура МСК в монослое на 4 х 10 5 в.п.заполняет / см 2 переменного две различные условия культивирования, как следует;
- Культура обслуживания адипогенез среде, содержащей DMEM + GlutaMAX, 3% FBS, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина В и 170 мМ инсулина.
- Культура адипогенеза индуцирующего средах с поддерживающей среде, содержащей 3% FBS, 5% сыворотки кролика, 1 мкМ дексаметазона, 500 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина, 33 мкМ биотин, 5 мкМ розиглитазон и 17 мкМ пантотенат 16.
- Ревель липидных капель с помощью окрашивания масляным красным-O. Короче говоря, исправить клеток с 10% формальдегида, промывают PBS и окрашивают 0,35% масла красного O в изопропаноле.
- Для Остеогенной дифференциации культуры МСК в монослое на 7 х 10 3 клеток / см 2 и стимулирования в следующем:
- Расширенный DMEM (GIBCO) + GlutaMAX, 5% FBS, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина В, 501; M L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата, 10 мМ бета-глицерофосфат и 100 нМ дексаметазона.
- Определить минерализации месторождения от Von Косса пятно (5% AgNO 3). Вкратце, клетки фиксируют 10% -ным формальдегидом, промывают PBS и пятна с 5% AgNO 3 в дистиллированной воде.
- Хондрогенные дифференциация
- Нарезать кубиками (3 мм с каждой стороны) из губки в форме медицинского устройства, составляется от лиофилизированного коллагена типа I, и используется в качестве каркасного материала, чтобы поддерживать клетки 17.
- Семенной МСК на верхней части кубиков в концентрации 4 × 10 6 клеток / мл (~ 70000 клеток / куб).
- Перед добавлением информации, позволяют клеткам прилипать к кубиков в течение 30 мин.
- Поддержание MSC-коллагена конструкции в хондрогенной сред, состоящих из DMEM / F12 + GlutaMAX, 2,5% FBS, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина В, 40 нг / мл дексаметазона, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата,50 мкг / мл L-пролина, 1x Инсулин-трансферрина-Селен Х и 10 нг / мл трансформирующий фактор роста-β1.
- Используйте альциановым синий окрашивание визуализировать накопление протеогликанов в конструкциями разделах. Короче говоря, пачкают разделы O / N с 0,4% альциановым синий, растворенного в 0,01% H гуанидингидрохлорида 2 SO 4 и 0,5 М. Далее, мыть срезы промывали в течение 30 мин в 40% ДМСО и 0,05 MgCl 2. Клетки контрастно с ядерным быстрыми эритроцитов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Тот факт, что 74% собак образцов костного мозга (п = 54), содержащиеся сгустки, когда они прибыли в нашей лаборатории (рис 1а) наряду с снижение урожайности MSC из этих образцов, заставил нас поверить, что значительное число МСК был пойман в ловушку в пределах сгустков , В самом деле, простой DAPI-пятно секционного сгустка материала подтверждает наличие ядерных клеток с высокой плотностью (Фиг.1В). В конечном итоге это приводит к низкой численности МСК, доступных для расширения культуры...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Регулярно мы пробы костного мозга в то время как пациент проходит операцию (в нашем случае в основном хирургии позвоночника), с тем преимуществом, что только немного дополнительной работы будет осуществляться персоналом в операционном зале. Даже при том, что образцы смешивают с цитратом натрия сразу после выхода, много образцов были частично со сгустками, когда они прибыли в лабораторию для обработки. На данном этапе, ресэмплинг заменить сгустками образцов будет отдельный дополнительное вмешательство потребовало вновь м...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Швейцарского национального фонда CR3I3_140717/1 и Швейцарским фондом параплегиков.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Базальные средние компоненты | |||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 | |
| человека FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| MEM Альфа с нуклеозидом, со стабильным глутамином | Амимед | 1-23S50-I | |
| FBS Термоинактивированный | Амимед | 2-01F36-I | |
| Амфотерицин B | Апличем | A1907 | |
| Адипогенные средние компоненты | |||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I | |
| Инсулин | Sigma | I5500 | |
| Сыворотка для кроликов | Gibco | 16120099 | |
| Аппличем дексаметазона | D4902 | ||
| 3-изобутил-1-метилксантин | сигма | i5879 | |
| биотин | Sigma | B4639 | |
| Росиглитазон | Sigma | R2408 | |
| Пантотенат | Sigma | P5155 | |
| Масло красное | Sigma | O0625 | |
| Остеогенные средние компоненты | |||
| L-аскорбиновая кислота 2-фосфат | Sigma | A8960 | |
| ß-глицерофосфат | Sigma | G9422 | |
| Нитрат серебра (AgNO3) | Sigma | S6506 | |
| Хондрогенные компоненты среды | |||
| Биопад - медицинский прибор в форме губки | Euroresearch | ||
| L-пролин | Sigma | P5607 | |
| Инсулин-трансферрин-селен X | Gibco | 51500056 | |
| Трансформирующий человека фактор роста-&бета; 1 | Peprotech | 100-21 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 | |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 | |
| Дженерик | |||
| три-натрия цитрат дигидрат | Applichem | A3901 | |
| PBS | Applichem | 964.9100 | |
| Urokinase | Medac | 1976826 | |
| 0,5% Трипсин-ЭДТА | Краситель Gibco | 15400054 | |
| Гимзе | Апплимен | A0885 | |
| Формальдегид | Апплимен | A0877 | |
| Серная кислота (H2SO4) | Апплимен | A0655 | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Апплименем | A1584 | |
| Магния хлорид (MgCl2) | Апплименем | A3618 | |
| Гуанидина гидрохлорид | Applichem | A1499 | |
| Расходные материалы | |||
| 50 мл реакционная пробирка | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 мл шприц | Braun | 4606108V | |
| игла Sterican (22G) | Braun | 4657624 | |
| 1,7 мл Микропробирки | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μ m клеточное ситечко | Falcon | 6.05935 | |
| стерильные щипцы | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| стерильный скальпель | Braun | 5518059 | |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 | |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 | |
| колба для клеточных культур - Flask T300 | TPP | 90301 | |
| Оборудование | |||
| Шкаф микробиологической биобезопасности класса II | Skan | 82011500 | |
| водяной баней | Memmert | 1305.0377 | |
| Stripettes Серологическая пипетка 5мл | Corning | 4487-200ea | |
| микроскоп | Olympus | CKX41 | |
| увлажненный инкубатор Heracells 240 | Thermo научный | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo Scientific | 75004331 |
Ссылки
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28(2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14(2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, Suppl 6. S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research--bench to bedside and back--myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
