Классический анализ передней конечности асимметрия испытания цилиндров обычно используется для оценки поведения дефицит у крыс после черепно-мозговой травмы или инсульта; Однако, это не удается обнаружить последовательные дефицита у мышей. Это исследование показывает, что поведение количественная лапы перетаскивание более чувствительны анализ мозговой травмы у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лапы-Перемещение: Роман, Чувствительный анализ Mouse Test цилиндр
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тест цилиндра обычно используется для прогнозирования локальной ишемии повреждение передней конечности в моторной коре грызунов. При размещении в цилиндре, грызуны исследовать по воспитанию и касаясь стенок цилиндра с их передних конечностей лапами за постуральной поддержки. После ишемического повреждения в передней конечности сенсомоторной коры крыс в большей степени опираться на их передних конечностей незатронутой лапы для осанки поддержки, в результате меньшего количества прикосновений с их пораженной лапой которая называется передних конечностей асимметрию. В противоположность этому, фокусное ишемического повреждения головного мозга мыши терпит неудачу, чтобы привести в сопоставимых последовательных дефицитов в передних конечностей асимметрии. В то время как дефицит передней конечности асимметрия наблюдается нечасто, мыши вы продемонстрировать новый поведение после инсульта называют "лапа-перетаскивание". Лапы-перетаскивание тенденция к мыши, чтобы перетащить его пострадавшего лапу по стенке цилиндра, а не непосредственно оттолкнуться от стены, когда демонтаж от задней к четвероногим позиции. Ранее нами было показано, чтолапа перетаскивания поведение весьма чувствителен к малым корковых ишемических повреждений в передней конечности моторной коры. Здесь мы предлагаем подробный протокол для лапы перетаскиванием анализа. Мы определяем, что лапы перетаскивания и продемонстрировать, как количественно лапу перетаскивания поведение. Тест цилиндр простой и недорогой тест, чтобы управлять, и не требуют предварительной подготовки или-стратегии лишение пищи. При использовании лапки перетаскивания анализ с тестом цилиндра, он заполняет нишу для прогнозирования корковых ишемических травм, таких как фототромбоза и эндотелина-1 (ET-1), индуцированного ишемией - двух моделей, которые когда-либо увеличивающихся в популярности, и производят меньше координационные травмы чем окклюзии средней мозговой артерии. Наконец, измерения лапу перетаскивания поведение в тесте цилиндров позволит исследования функционального восстановления после травмы, используя корковой широкий когорту трансгенных линий мышей, где предыдущий анализ передней конечности асимметрия не удалось обнаружить последовательной дефицита.
Введение
Цель нейронных стратегий регенерации, чтобы продемонстрировать как восстановление тканей и функциональное восстановление. Функциональное восстановление обычно оценивается с поведенческими тестами, которые измеряют функционального дефицита, в этом случае с участием двигательных навыков, которые связаны с повреждением определенных областях головного мозга. Травматическое повреждение головного мозга или ишемическое повреждение сенсомоторной области передних конечностей коры может быть продемонстрировано с помощью ряда поведенческих тестов. Один такой тест, тест цилиндр широко используется в крыс для оценки функционального дефицита в передних конечностей деятельности 1. Тест имеет низкую наладки стоимость требующий только цилиндр, камеру и стол с прозрачной верхней. Это легко управлять, поскольку она основана на естественном исследовательское поведение грызунов, так предпродажную подготовку и лишение пищи или награды не требуется. Несмотря на эти многочисленные преимущества, тест цилиндр малоиспользуемых оценить дефицит передних конечностей у мышей после координационных травмы передних конечностей сensorimotor мозга, которые мы относим к анализу поведения мыши в тесте цилиндров. Передних конечностей асимметрия классическая мера анализа для теста цилиндра. При размещении в цилиндре, грызуны, естественно, исследовать стены цилиндра воспитания на их задних конечностей и касаясь стенок цилиндра с их передних конечностей лапами за постуральной баланса. Лапы прикосновений номер со стеной с каждым передних конечностей легко количественно съемок грызунов во время этого исследования цилиндра. Передних конечностей асимметрия возникает, когда затронуты передняя конечность лапа делает меньше штрихи к стене, чем непораженной передних конечностей лапы и указывает повреждения противоположной сенсомоторной коры. У крыс, внутри коры инъекции сосудосуживающего агента, эндотелина (ET-1), в передней конечности сенсомоторной коры приводит к локальной ишемии повреждение в результате чего нарушений поведения в контралатеральной передней конечности. Дефицит противоположной использования передних конечностей легко обнаружить, как изменения в Forelimb асимметрию в тесте цилиндров у крыс 1-3. В отличие от крыс однако, изменения в передних конечностей асимметрии являются переменными и менее последовательны в мышей после сопоставимых ET-1 инъекций 4-6. Здесь мы показываем, новый анализ поведения передних конечностей в тесте цилиндров - анализ лапы перетаскиванием поведения. Ранее мы показали, что лапы перетаскиванием анализ является более чувствительной мерой повреждения передних конечностей сенсомоторной коре у мышей, чем классического анализа асимметрии передней конечности и, следовательно, применима к различным корковых координационных моделей травмы.
Экспертиза того, как лапы контактов стенки цилиндра при ишемическом повреждения передней конечности сенсомоторной коры показало новый поведение у мышей - лапы тащит 4. Лапа перетащите происходит, когда мышь стоит на своих задних ногах, чтобы исследовать стенки цилиндра, то тащит его пораженный (Contra-поврежденной лапой) вдоль стенки цилиндра к его средней линии или вниз к стене,его неизменным лапка обеспечивает поддержку постуральной к стене. Лапы-драг редко встречаются в неповрежденных мышей поэтому появление лапы-перетаскивания положительным показателем повреждения передних конечностей сенсомоторной коры 4. Ранее мы уже количественно лапу перетаскивания поведение у мышей после ЭТ-1 ишемического повреждения в передних конечностей сенсомоторной коры и показали устойчивый лапу перетаскивания поведение у мышей до двух недель после инсульта 4. Здесь мы показываем, что лапа перетаскивания поведение поддерживается до четырех недель после инсульта. Анализ лапы перетаскивания поведения обеспечивает новый и чувствительный инструмент для оценки локальной ишемии повреждение передней конечности сенсомоторной коре у мышей. Его недорогой набор вверх, простота администрирования и забил сделать это простой, но полезный инструмент, чтобы быстро оценить передних конечностей поведенческие дефициты в мышах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Заявление по этике: Все эксперименты были одобрены Мемориального университета Комитета по этике ухода за животными Ньюфаундленда в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными.
1. Мыши
- Используйте взрослых мышей. В этом исследовании были использованы взрослый мужчина FVBN мышей (п = 10) между 2-4 месяцев. Дом мышей на 12:12 часов обратного цикла свет-темнота и обеспечивают стандартный корм для грызунов и воду без ограничений.
2. Необходимые материалы для испытания цилиндров
- Получить таблицу с прозрачным верхом, чтобы снять тест цилиндров. Размеры таблице значения, верх должен быть из плексигласа или стекла, и должно быть достаточно места, чтобы расположить зеркало ниже таблице. Это позволяет мыши, чтобы быть на видеопленку снизу. Используйте зеркало ниже таблице, чтобы отразить изображение через цилиндр. В качестве альтернативы, используйте перевернутый камеру, если имеется. Размеры стола, используемые в настоящем Протоколе 54 х 56 х 66.5cm (ШхДхВ) с 51 х 51см (верхней WXL).
- Получить зеркало. Размеры зеркала, используемые в настоящем Протоколе 34 х 58см (ШхД).
- Получить прозрачный плексиглас / цилиндр для мыши для выполнения в. Размеры цилиндра, используемые в настоящем Протоколе 17,5 высокой, 8.8cm ID, 9.5cm ОД с толщиной стенки 0.35cm. Выше цилиндра может потребоваться для более активных штаммов мыши.
- Поместите цилиндр на стол и снять свое отражение в зеркале ниже.
- Видеокамеры и штатив не требуется. Запись видео в примерно 650Kb / с, что примерно 190Mb за 5 мин цилиндра видео. Убедитесь, что камера имеет функции масштабирования, чтобы убедиться, что цилиндр охватывает все поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: видеокамера используется в данном протоколе является Sony DCR-SR42, 40x оптический зум, цифровой зум 2,000x, 680kpix который использует стандартное определение, NTSC видео с чересстрочной разверткой). - Получить программное обеспечение для анализа - медиа плАйер с поддержкой видео и скорости воспроизведения модуляции. Медиа-плеер используется в данном протоколе является v2.1.2 VLC Media Player.
- Получить компьютер с операционной системой, способной работать в медиа-плеер и монитор.
- Электронное хранение видео требуется. Скачать видео на внешний жесткий диск или скопировать его на DVD-диски для долгосрочного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В 190Mb на видео, 84 сессий будет соответствовать на GB SD карты 16 и 168 сессий будет соответствовать на SD карту 32 ГБ. Из-за относительной дешевизны УР СМИ, и неопределенность в том, как много времени некоторые мыши требуют, чтобы завершить 20 тылы, 32 Гб карта рекомендуется. В текущем исследовании, видео были скопированы с камеры на 2 Тб внешний жесткий диск, а затем переписал на DVD-диски в качестве резервного.
3. Экспериментальная установка Теста цилиндров
- Закрепите зеркало ниже таблице под углом 45 градусов к поверхности стола. Сделать это, используя две скобы поддержки, прикрепленные к ногам стол для Supporт верхнюю и нижнюю часть зеркала, соответственно. Места для кронштейна отмечены в боковой вид на таблицы (рис 1А) и номинальной-обозрения таблицы (рис 1B).
- Поместите цилиндр на центре стола. Нарисуйте четыре равноудаленные линии, где цилиндр сидит на столе с черным маркером (Шулера), так что цилиндр может быть поднят и вернулся на то же место (рис 2). Рисунок их на нижней стороне прозрачной столешницей позволяет настольный быть очищены от тестов на животных без растворения маркера чернила.
- Прикрепите камеру и штатив. Направьте камеру на зеркало так, чтобы картинка, глядя прямо через ствол цилиндра. Убедитесь, что полный внутренняя стенка цилиндра видна и беспрепятственно от основания (рис 3). См вид сбоку-на настройки, в том числе относительного угла установки камеры и зеркала, сверху (рис 4А) и отУровень таблицы, в том числе мыши выращивания (фиг.4В).
- Подготовьте ключевые карты для идентификации каждого мышь до съемок. Убедитесь, что карты, как правило, включают в себя идентификационный номер для каждой мыши, время-точка испытания (например., Через 3 дня после лечения) и дату съемки сессии. Не включать группу лечения на бильярдном карты, чтобы гарантировать экспериментатор ослеплен.
- Фильм в стандартных внутренних условиях освещения, как этого уровня света требуется четко видеть движения мыши вокруг цилиндра.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии съемок в темноте с камеры красного света может быть достаточно, однако можно было бы в первую очередь необходимо проверить, является ли лапа штрихи и тащит явно открыты для количественного определения.
4. Выполнение
- Начало съемок. Отображение соответствующего мыши кий карту перед объективом камеры.
- Опустите курсор в цилиндр с открытым верхом сразу после съемок кий карту.
- Начните съемок мыши. Минимизировать шум в течение этого времени, а мыши могут потерять интерес в изучении, если поражен.
- Соблюдайте мышей тыл, чтобы исследовать цилиндр. Захват видео, пока мышь не выполняет минимум двадцать тылам.
ПРИМЕЧАНИЕ: задний происходит, когда оба передние лапы теряют контакт с полом и мыши стоит на задних лапах. - Протрите столешницы и цилиндр с соответствующим чистящим раствором между каждой мыши, чтобы дезинфицировать и удалить запахи мыши.
- Замораживание, когда мыши остановить изучение и остаются спокойно сидеть на четвереньках течение примерно 5 минут. Если мышей заморозить до возникновения двадцать задние, это может быть необходимо, чтобы удалить их из цилиндра в течение 10-20 мин перед возобновлением тест. Если мыши не выполнять двадцать тылы, они удаляются из исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем опыте, мышей никогда не нужно быть исключены из-за отказа посетить цилиндр.
5. Оценка Теста цилиндров с помощью перетаскивания PawАнализ
- Воспроизведение видео со скоростью между 0.25X и 0.67x обычной скоростью в зависимости от того, как быстро мыши исследует цилиндр. Используйте медиа-плеер, который предлагает более низкую скорость воспроизведения.
- Количественно общее количество лап прикосновений. Подушечки штрихи возникают, когда задние мыши (фиг.5А), прикасается к стороне цилиндра (фиг.5В), затем отключает с обеих лап одновременно (5С) и земель (рис 5D). Лапа может или не может связаться со стенкой цилиндра с полным ладони, но некоторые контакта со стенкой цилиндра должно происходить. Оценка лапы штрихи от не подсчета количества раз мышь вступает в контакт (независимо от того, как краткое) со стенкой цилиндра с одного или обоих передних лапах, стоя на задних конечностей во время сзади.
Обратите внимание, что контакт со стенкой цилиндра Обновляется как "лапы ощупь" или "лапа-сопротивления", если мышь находится в заднем положении - стояна задних конечностях с обеих передних лап офф столешницы. Если мышь остается в 3-точка позиции в - обе задние конечности и один переднюю лапу на столе и продолжается коснуться стены со свободным лапы - это не считается лапы ощупь. Мыши могут задней и коснуться стенки цилиндра с одной передней лапы, и это засчитывается как лапы ощупь. Примечание: мышь также может двигаться свое тело вокруг цилиндра во время сзади, что делает более двух контактов. Эти контакты подсчитаны - по одному для каждой передней лапы ощупь левой и один для каждого правой передней лапы ощупь. - Количественно число лапы тащит. Лапы перетаскивания поведение отличается от обычных лап прикосновений.
- Если лапы контактов стенки цилиндра с полным открытой ладонью (рис 6В), он будет медленно падать от стены, часто с небольшим тремором. Движение начинается с цифр перетаскивания против стенки цилиндра или в медиальной или вниз (рис 6C), прежде чем упасть от CompletЭли (рис 6D). Мышь будет демонтировать с незатронутой лапы (рис 6E) до посадки на четвереньках (рис 6F). Это считается лапы и перетащить должны учитываться в подсчете.
- Если лапа не касалась стенки цилиндра с полностью открытой ладонью, он будет пасти стенки цилиндра с его цифр, прежде чем упасть от стенки цилиндра. Точно так же, возможно, мышь перетащите его лапу к стене цилиндра, но не освободить его полностью прежде, чем демонтаж. Они оба считаются лапы тащит, а также затрагивает и должны учитываться и как в подсчет.
- Лапа может перетащить на стенки цилиндра, а мышь исследует цилиндр. В этом случае, лапа будет следовать скручивание туловища мыши, как она исследует влево или право от своего первоначального положения (рис 7А-D) перед разборкой (рис 7E). Это не считается лапу-сопротивления, так как это зависит от случайного выбора мышиНаправление, чтобы исследовать и не зависит от которого была повреждена кортикальной полушарии.
- Подушечки-тащит выражены в процентах от лапы-за таскает общего количества лап прикосновений во время сеанса. Экспресс число лапы тащит в процентах от общего объема лапы контактов для каждого отдельно передней конечности.
- Прикосновения результате в лапы-сопротивления считаться лапы-сопротивления и одновременно оттенком. Таким образом, если мышь тащит лапу каждый раз лапой контакты стенки цилиндра, лапа-перетаскивания процент выражается как 100%.
6. Дополнительные предложения Экспериментальный дизайн
- Чтобы свести к минимуму посторонние переменные:
- Испытание мышей одновременно на каждый день тестирования. Проверьте мышей во время бодрствования цикла. Ведение мышей на 12 ч фара цикла облегчает работу.
- Мыши могут неохотно исследовать цилиндр, если подчеркнул либо шумов или новой среде. Тестирование мышей в своей животной выдержки комнате или комнате они бееп ознакомился с уменьшает стресс. Это может произойти, если номер шумно, если мышь была толкались перед входом в цилиндр или из-за привыкания.
Примечание: Тестирование следует проводить один раз перед экспериментальной манипуляции, чтобы служить в качестве базового чтения. После манипуляций, тестирование дни по усмотрению экспериментатора, хотя это рекомендуется, чтобы избежать чрезмерного количества экспозиций в цилиндр в течение короткого периода времени. - Мыши могут стать неохотно задней через 6-7 экспозиций в цилиндре. В текущем исследовании, мыши были протестированы в цилиндре в общей сложности семь раз, до ишемии и на 3, 7, 14, 21 и 28 после операции дни 1,.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали штамм FVBN мыши. Ранее мы тестировали мышей C57BL / 6 в цилиндре и наблюдаемой лапы перетаскивания поведение после ЕТ-1 ишемического повреждения (данные не показаны). C57BL / 6 мышей были более активны, чем FVBN мышей при выращивании и часто прыгнули на обод цилиндраперед восхождением из. Taller цилиндры должны быть использованы, если мышей пытаются убежать, прыгнув.
7. эндотелина-1 Хирургия и инфаркта Объем Измерения
- Выполните эндотелина-1 операцию и измерения объема инфаркта согласно ранее опубликованным протоколам 4. Чтобы настроить таргетинг на передней передней конечности двигателя мозга, каждая мышь должны получить три ET-1 инъекции в следующих координатах: (я) 0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 медиальной-боковой (мл) / - 1,2 спинной-вентральной (DV), ( II) 0,4 AP / 1,25 мл / - 1.2 Д.В. и (III) 0,1 AP / 1,75 мл / -1.2 Д. 4.
8. Статистический анализ
- Двусторонний повторные измерения дисперсионного анализа (ANOVA) рекомендуется проанализировать процентов лапы перетаскивания для пострадавших и не пострадавших лапы в различных временных точках.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ранее мы показали, что лапы перетаскивания поведение появляется после локальной ишемии повреждение передних конечностей сенсомоторной коры и является положительным показателем повреждения 4. Intra-кортикальные инъекции ET-1 в передней конечности сенсомоторной коры были использованы для индуцирования ишемического поражения (фиг.8А, В). Это исследование изучило, распространяется ли лапа перетаскивания поведение дольше, чем 14 дней после травмы для его потенциальное использование для оценки функ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ключевые моменты, чтобы установить, когда количественного лапу перетаскивания поведение в тесте цилиндра следующее: я) определить число лапы-тащит против общего лап штрихи для каждой лапе перед черепно-мозговой травмой, чтобы установить базовый; II) определить число лапы тащит против общего лап штрихи для каждой лапе после ишемического повреждения; и III) различать лапу-сопротивления и бокового движения лапы вдоль стенки цилиндра во время вращения боковой части туловища мыши.
Лапы-перетаскив...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Мы благодарим г-на Джона Кроу и Терри Upshall их технической экспертизы и помощи с фотографией и видеосъемка. Эта работа была поддержана операционной гранты JLV из Канадского института исследований в области здравоохранения и научных исследований и разработок корпорации Ньюфаундленда и сердце и инсульта Фонда Канады канадского партнерства для хода восстановления катализатора гранта. RBR был получателем Кейт Гриффитс Мемориал сердца и инсульта Фонд Высшей стипендии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| оргстекла | высотой 17,5 см, внешний диаметр 9,5 см, внутренний диаметр 8,8 см, толщина стенки 0,35 см (или 3,5 мм) | ||
| смотровой стол | 54x56x66,5 см (ширина х длина х высота), верх стола лист оргстекла 51x51 см. | ||
| зеркальная | 34x58 см зеркальная | ||
| видеокамера | Sony | DCR-SR42 | Видеокамера со встроенным накопителем, функционалом SD, 40-кратным оптическим зумом |
| компьютера | Dell | Optiplex 760 | Процессор: Intel, 3.0 ГГц, Память 4.00GB (RAM) |
| компьютерный монитор | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | LAN | v2.1.2 | Медиаплеер с модуляцией скорости воспроизведения и поддержкой видео |
| Внешний жесткий диск | Western | WDBAAU0020HBK-01 | 2 ТБ |
Ссылки
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al. Growth factor-stimulated generation of new cortical tissue and functional recovery after stroke damage to the motor cortex of rats. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 983-997 (2007).
- Windle, V., et al. An analysis of four different methods of producing focal cerebral ischemia with endothelin-1 in the rat. Exp Neurol. 201 (2), 324-334 (2006).
- Roome, R. B., et al. A reproducible Endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
- Tennant, K. A., Jones, T. A. Sensorimotor behavioral effects of endothelin-1 induced small cortical infarcts in C57BL/6 mice. J Neurosci Methods. 181 (1), 18-26 (2009).
- Wang, Y., Jin, K., Greenberg, D. A. Neurogenesis associated with endothelin-induced cortical infarction in the mouse. Brain Res. 1167, 118-122 (2007).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 129 (1), 87-93 (2003).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Exp Neurol. 187 (1), 94-104 (2004).
- Clarke, J., Ploughman, M., Corbett, D. A qualitative and quantitative analysis of skilled forelimb reaching impairment following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Res. , 204-212 (2007).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36 (2-3), 219-228 (1991).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Tennant, K. A., et al. The vermicelli and capellini handling tests: simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J Vis Exp. (41), (2010).
- Clarkson, A. N., et al. AMPA receptor-induced local brain-derived neurotrophic factor signaling mediates motor recovery after stroke. J Neurosci. 31 (10), 3766-3775 (2011).
- Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke. Nature. 468 (7321), 305-309 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
