Методическая статья

Иммуноокрашивание визуализировать нервную развития системы мышиный Кишечная

DOI:

10.3791/52716

⸱

29 апреля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Neurosciences, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтеральная нервная система состоит из клеток нервного гребня, которые пролиферируют, мигрируют и колонизируют кишечник. Клетки нервного гребня дифференцируются в нейроны с маркерами, специфичными для их фенотипа нейротрансмиттеров. Этот протокол описывает технику препарирования, фиксации и иммуноокрашивания желудочно-кишечного тракта эмбриона мыши для визуализации экспрессии нейротрансмиттеров энтеральной нервной системы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтеральная нервная система состоит из клеток нервного гребня, которые пролиферируют, мигрируют и колонизируют кишечник. После колонизации клетки нервного гребня должны дифференцироваться в нейроны с маркерами, специфичными для их фенотипа нейротрансмиттеров. Холинергические нейроны, основной фенотип нейромедиаторов в энтеральной нервной системе, идентифицируются путем окрашивания на холинацетилтрансферазу (ChAT), синтезирующий фермент ацетилхолина. Исторические усилия по визуализации холинергических нейронов были затруднены антителами с различной специфичностью к ChAt центральной нервной системы и периферической нервной системы. Мы и другие специалисты преодолели это ограничение, используя антитело против плацентарного ChAT, которое распознает как центральный, так и периферический ChAT, для успешной визуализации эмбриональных энтеральных холинергических нейронов. Кроме того, мы сравнили это антитело с генетическими репортерами для ChAT и показали, что антитело более надежно во время эмбриогенеза. Этот протокол описывает технику препарирования, фиксации и иммуноокрашивания желудочно-кишечного тракта эмбриона мыши для визуализации экспрессии нейротрансмиттеров энтеральной нервной системы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечная функционирует нервная система (ENS), которая контролирует моторику, всасывание питательных веществ, и местный кровоток, имеет важное значение для жизни 1. ЭНС формируется клеток нервного гребня (НКЦ), которые пролиферируют, мигрируют и колонизировать кишечник, где они дифференцироваться в ганглиев содержащих нейронов и глиальных клеток. Болезнь Гиршпрунга (HSCR, Интернет Законы Менделя в человеке), multigeneic врожденный порок с частотой 1 в 4000 живорожденных, можно считать прототипом для изучения болезни нарушенного образование ENS. В HSCR, НКК не мигрируют и колонизировать переменной длины дистального кишки 2. Кроме того, другие общие желудочно (GI) пороки развития в педиатрической популяции, такие как аноректальной пороками развития, кишечных atresias и нарушений моторики связаны с нарушениями в основных функций ENS, и, вероятно, связано с тонкими, недооцененных, анатомических изменений и функциональных изменений вENS 3-6. Таким образом, методы, которые позволяют нам понять детерминанты развития образования ENS может пролить свет на патогенез и потенциального лечения расстройств желудочно-кишечного тракта у детей.

После миграции и колонизации, НКК дифференцируется в нейроны с маркеров, специфических для их фенотипа нейромедиатора. Холинергических нейронов содержат приблизительно 60% кишечных нейронов 7, и могут быть обнаружены путем окрашивания по холинацетилтрансферазы (ХАТ), синтезирующего фермента на возбуждающий нейротрансмиттер ацетилхолин. Исторически, попытки визуализировать холинергические нейроны смешивать с различной антигенной специфичности антител, направленных против центральной нервной системы (ЦНС) ХАТ в сравнении периферической нервной системы (ПНС) ХАТ 8-10. Тем не менее, антитела, направленные против плаценты ChAT признать как центральную и периферическую Чат 11-13, и мы в последнее время описанные методы, которые позволяют visuaлизация из ENS холинергических нейронов с высокой чувствительностью ранее в развитии чем была достигнута с чатом репортер линий 14.

Здесь мы представляем технику для рассечения, фиксация и иммунное мышиного эмбрионального желудочно-кишечного тракта для визуализации выражение нейромедиатора ENS в нейронах. Для этих исследований, мы использовали мышей Чат CRE повязана с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (определенные как чат-Cre tdTomato всей рукописи). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей, чтобы получить мышей, экспрессирующих обе флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Эти два репортер животные на линии C57BL / 6J фоне и коммерчески доступны (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Университет Висконсина уходу и использованию животных комитета утвердил все процедуры.

1. Подготовка решений

  1. Использование 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в качестве буфера рассечение и промывки раствором.
  2. Подготовка 30% сахарозы путем взвешивания 30 г сахарозы и место в бутылку. Добавить 99 мл 1x PBS и добавить 1 мл 10% азид натрия. Тщательно перемешать, пока все сахарозы не растворится. Хранить при 4 ° С до использования.
  3. Подготовьте Блокирующий раствор путем смешивания 1X PBS, 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% Тритон-X-100. Тщательно перемешать и хранить в холодильнике, пока не понадобится.
  4. Подготовка 8% параформальдегида (PFA) раствор в 1x PBS путем взвешивания соответствующего количества PFA в 1x PBS, а затем инкубировали при 65 ° С до тех пор, пока полностью не растворится. Магазин в 25 мл аликвотах в -20 ° C морозильнике до использования. Развести до 4% PFA в 1x PBS на день использования.

2. Эмбрион и Гут Рассекитеион

  1. В соответствии с институциональной уходу и использованию животных комитета утвержден протоколы, усыпить приуроченный беременную мышь и перенести в матку в 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной 1x PBS.
  2. Под микроскопом рассечение, используя острые ножницы, разрезать стенки матки открытый, чтобы выставить эмбрионов. Удалить эмбрионов из матки и место в чистой 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной холод 1x PBS.
  3. Эвтаназии каждый эмбрион, обезглавливание в ледяной 1x PBS. Если вы используете трансгенных мышей, содержащих флуоресцентные белки, под флуоресцентной подсветкой, определить положительные трансгенные эмбрионы.
  4. Рассеките желудочно-кишечного тракта от каждого эмбриона с использованием рассечение микроскоп. Использование тонких щипцов, ориентироваться эмбрион таким образом, что левая сторона стороной вверх и правой стороне на дно чашки Петри. Снимите верхнюю стенку тела из эмбрионов, чтобы выставить внутренние органы. Вставьте тонкий пинцет между спинной стенке тела и внутренних органов. Crуги щипцы друг против друга в ножницеобразный, как режущего действия, чтобы удалить внутренние органы от эмбриона.
  5. Кроме того суб-рассекать желудочно-кишечного тракта от окружающих органов, а затем поместить каждый желудочно-кишечного тракта в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ледяной 1X PBS.

3. Фиксация GI урочища

  1. Промыть каждый желудочно-кишечного тракта 3 раза охлажденным на льду PBS 1x, а затем заменить 4% PFA. Закрепите GI участки в 1,5 мл микропробирок на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Промыть желудочно-трактов 3 раза в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем в течение 1 часа на качалке платформы. На этой стадии, сохранять GI тракт при 4 ° С в 30% сахарозы в 1x PBS, содержащим 0,1% азида натрия до тех пор, пока это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, хранения эмбрионов в 30% сахарозы в течение до одного года без какого-либо влияния на целостность тканей. Хранение образцов в 30% сахарозы позволяет последующую обработку образцов либо для иммунным или в октябре для крио-sectioniнг. Кроме того, приступить к протоколу иммуноокрашивания подробно ниже.

4. Протокол Иммуноокрашивание

  1. Если образцы были сохранены в 30% сахарозы, промыть их 3 раза в течение 20 мин в PBS 1x на платформе-качалке.
  2. Поместите GI участки в блокировании решения на качающейся платформе в течение 1 часа при комнатной температуре.
  3. Удалить блокирующий раствор и инкубировать GI тракт с соответствующим количеством первичных антител разводят в блокирующем растворе для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С на ротационном платформы. Использование 1: 1000 разбавление человеческого анти-антитела (Hu сыворотки, полученной от пациента), 1: 1000 разбавление куриного анти-зеленого флуоресцентного белка (GFP) антитела и 1: 100 разбавление козьего анти-ХАТ антитела.
    Примечание: Мы используем человеческого анти-Hu антитело, которое было получено локально от пациента, однако, анти-Hu антитела коммерчески доступны, например, мышиное анти-Hu, (использование при 1: 500 разбавлении).
  4. Промыть GI участки в 1x PBS3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
  5. Заменить 1X PBS с помощью вторичных антител, разведенных 1: 500 в блокирующем растворе на платформе-качалке для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Использование осла против человеческого амина-реактивный краситель, такой как DyLight, осла против ветряной су2 и осла против козьего Cy5. При использовании мышиное анти-Ху антитела затем используют в разведении 1: 500 осла против мышиного амина-реактивный краситель 405.
    ПРИМЕЧАНИЕ: интенсивность эндогенного GFP и выражения tdTomato и ясности иммуноокрашивания увеличение с возрастом развития. Как правило, мы immunostain эмбриональных кишки индивидуально в 0,2 мл пробирки с 150 мкл окрашивающего раствора, чтобы уменьшить объем используемого антитела, а также обеспечить эффективное окрашивание ткани.
  6. Промыть GI тракт в 1X PBS 3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
  7. Поместите несколько капель флуоресценции монтажа среде с DAPI на предметное стекло. Погрузите GI траКТ в монтажной флуоресценции среды и добавить покровное стекло непосредственно на ткани. Флуоресценции монтажа средней -G является водорастворимым соединением, которое обеспечивает полупостоянного уплотнение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресценции монтажа носитель, например Vectashield что глицерин основе монтажа среду, предотвращающую выцветания и фотообесцвечивание антител. Оба из этих продуктов позволит ткани должны храниться в течение длительных периодов времени при 4 ° С.
  8. Захват изображения каждого из флуорофора с помощью конфокальной микроскопии. Используйте для длин волн возбуждения флуорофоров и фильтров, используемых, представленных в таблице 3.
  9. Выполнить анализ изображения с помощью компьютера, используя соответствующее программное обеспечение в зависимости от типа используемого конфокальной захвата изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее мы уже описали поколение мышей, экспрессирующих GFP оба и tdTomato флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Вкратце, мышей Чат-Cre были скрещены с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (так называемые чат-Cre tdTomato). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей. Эмбрионы были выделены и ткани иссекали до того, как фиксированные и иммунологически, как указа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашей лаборатории и другие показали, что кишечные дефекты HSCR не ограничивается aganglionic толстой кишки, но распространяется в проксимальном направлении, даже в тонком кишечнике узловатый 5,15,16. Эти изменения включают изменения в ENS фенотипа нейронов плотности и нейромедиаторов и может составлять моторики, которая наблюдается у пациентов с HSCR. Мы использовали выше методы в наших усилиях, чтобы понять детерминанты формирования ENS. В частности, эти методы были использованы для визуализации нейронов с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Байт премии американской детской хирургической ассоциации Foundation (АГ) и Национальных Институтов Здоровья K08DK098271 (АГ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфат буферный физиологическийОксоидBR0014G
СахарозаFisherS2
Азиднатрия FisherBP9221
Бычий сывороточный альбуминFisherBP1605
Triton X-100SigmaX100
ПараформальдегидSigma158127
60 мм Чашки ПетриФишерFB0875713A
Флуоресцентный микроскопNikonSMZ-18 Диссекционный
микроскопNikonSMZ-18
щипцыИнструменты для тонкой науки11252-20
1,5 мл Eppendorf TubesVWR20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Бирмингем, Алабама0100-01
Предметные стеклаFisher12-550-15
Защитное стеклоVWR16004-330
Конфокальный микроскопNikonA1
Nikon ElementsNikon
Тонкие

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Enteric Nervous SystemMurine Embryonic GutCholine AcetyltransferaseImmunostaining TechniquePlacental ChAT AntibodyNeural Crest CellsCholinergic NeuronsGastrointestinal Tract DissectionEmbryonic DevelopmentNeurotransmitter Phenotype

Похожие статьи