Method Article

Бумажные основе Приборы для выделения и характеристики внеклеточной пузырьков

DOI:

10.3791/52722

⸱

April 3rd, 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол детализирует метод, чтобы изолировать внеклеточные пузырьки (EVS), небольшие мембранные частиц, выпущенных из клеток, от всего лишь 10 мкл образцов сыворотки. Такой подход позволяет обойти необходимость ультрацентрифугированием, требуется только несколько минут времени для анализа и делает возможным выделение электромобилей из образцов ограниченных объемах.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные пузырьки (EVS), мембранные частиц, выпущенных из различных типов клеток, провести большой потенциал для клинического применения. Они содержат кислоты и белка груз нуклеиновой и получают все большее признание в качестве средства межклеточной коммуникации, используемой как эукариот и прокариот клеток. Тем не менее, из-за их малого размера, текущие протоколы для выделения электромобилей часто занимает много времени, громоздка и требует больших объемов образцов и дорогое оборудование, например, ультрацентрифуге. Для устранения этих недостатков мы разработали на основе бумаги иммуноафинную платформу для разделения подгруппы электромобилей, который легко, эффективно, и требует выборки объемов столь же низко как 10 мкл. Биологические образцы могут быть пипеткой непосредственно на индикаторной бумаги зон, которые были химически модифицированы с молекулами захвата, которые имеют высокое сродство к определенным Е. поверхностных маркеров. Мы проверки анализа с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), на бумажной основе фермента-сшитый immunosorbenт анализы (P-ELISA), анализ транскриптом. Эти бумажные устройства позволит изучение электромобилей в клинике и условий исследования, чтобы помочь продвинуть наше понимание EV функций в норме и патологии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенные мембранозные частицы размером от 40 нм до 5000 нм и активно высвобождаются многими типами клеток различными путями биогенеза1-9. Они содержат уникальные и отобранные подмножества ДНК, РНК, белков и поверхностных маркеров из родительских клеток. Их участие в различных клеточных процессах, таких как межклеточная коммуникация10, модуляция иммунитета11, ангиогенез12, метастазирование12, химиорезистентность13 и развитие глазных заболеваний9, получает все большее признание и вызывает большой интерес к их полезности в диагностике, прогностии, терапии и фундаментальной биологии.

EV можно классифицировать как экзосомы, микровезикулы, апоптотические тела, онкосомы, эктосомы, микрочастицы, телеросомы, простатосомы, кардиосомы и вексосомы и т. д., в зависимости от их биогенеза или клеточного происхождения. Например, экзосомы образуются в мультивезикулярных тельцах, в то время как микровезикулы образуются путем отпочковывания непосредственно из плазматической мембраны, а апоптотические везикулы — из апоптотических или некротических клеток. Тем не менее, номенклатура все еще недостаточно уточнена, отчасти из-за отсутствия глубокого понимания и характеристики электромобилей. Для очистки ВВ было разработано несколько методов, включая ультрацентрифугирование14, ультрафильтрацию15, магнитные шарики16, полимерное осаждение17-19 и микрофлюидные методы20-22. Наиболее распространенная процедура очистки электромобилей включает в себя серию центрифугирования и/или фильтрации для удаления крупного мусора и других клеточных загрязнителей, за которыми следует заключительное высокоскоростное ультрацентрифугирование, процесс, который является дорогостоящим, утомительным и неспецифичным. К сожалению, технологическая потребность в быстрой и надежной изоляции электромобилей с удовлетворительной чистотой и эффективностью пока не удовлетворена.

Мы разработали устройство иммуноаффинности на бумажной основе, которое обеспечивает простой, экономящий время и деньги, но эффективный способ выделения и характеристики подгрупп EV22. Целлюлозная бумага, нарезанная по определенной форме, может быть скомпонована и ламинирована с помощью двух пластиковых листов с зарегистрированными сквозными отверстиями. В отличие от общей стратегии определения границы жидкости в устройствах на бумажной основе путем печати гидрофобным воском или полимерами25-27, эти ламинированные бумажные модели устойчивы ко многим органическим жидкостям, включая этанол. Бумажные тестовые зоны химически модифицируют для обеспечения стабильного и плотного покрытия молекул захвата (например, антител, специфичных для мишеней), которые имеют высокое сродство к специфическим поверхностным маркерам в подгруппах EV. Биологические образцы можно пипетировать непосредственно на бумажных тестовых зонах, а очищенные электромобили сохраняются после этапов промывки. Определение характеристик изолированных ВВ может быть выполнено с помощью СЭМ, ИФА и транскриптомного анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая схема процедуры работы приводится на рис 1. Использование этических норм, мы собрали образцы крови у здоровых субъектов, и полученный водный образцы юмора у пациентов через ветеранов больницы Тайчжун (TCVGH), Тайчжун, Тайвань под IRB утвержденным протоколов ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Изготовление бумаги устройств

  1. Вырезать хроматографии бумагу в кругах 5 мм в диаметре, чтобы обеспечить тот же макет, как микротитрационном 96-луночного планшета. Бутерброд эти кусочки бумаги с двумя Листы из полистирола с зарегистрированным сквозных отверстий и ламината.
  2. Изменить бумаги устройств, использующих метод химического сопряжения, описанную в следующих шагов 28.
    1. Лечить бумаги устройства с кислородной плазмы (100 мВт, 1% кислорода, 30 сек) в плазменной камере.
      ВНИМАНИЕ: Особая осторожность следует проявлять при работе с 3-меркаптопропилтриметоксисилана и N -γ-maleimidobutyryloxy сукцинимидаэфир (GMBS), так как они оба чувствительных к влаге и токсичными. Носите защитные перчатки и избегать вдыхания или контакта с кожей и глазами. Держите на фондовом бутылку, плотно закрытыми и позволить ему уравновесить до комнатной температуры перед открытием, чтобы избежать конденсации влаги. Кроме того, открыть фондовый бутылки внутрь заполненную азотом перчаточном боксе или коробку. Алиготе в небольших пробирках, чтобы избежать частого открытия фондовой бутылки.
    2. Сразу инкубировать обработанной бумаги устройств в 4% (объем / объем) раствора 3-меркаптопропилтриметоксисилана в этаноле (200 доказательства) в течение 30 мин.
    3. Промыть бумаги устройства с этанолом и инкубировать их с 0,01 мкмоль / мл GMBS в этаноле в течение 15 мин.
    4. Промывают этанолом (200 доказательства) и инкубируют бумаги устройств с 10 мкг / мл раствора авидин в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 1 ч при 4 ° С. Хранить при 4 ° С, если это необходимо, и использовать в течение 4 недель.
  3. Влажный каждого теста бумагу зоны с 10 мкл PBS, содержащим 1% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) В течение 3 × 10 мин до пятнистость 10 мкл биотинилированных молекул захвата для 3 × 10 мин. Использование анти-CD63 антитела (20 мкг / мл в PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА и 0,09% (вес / объем) азида натрия) или аннексина V (1:20, объем / объем в аннексина V буфера для связывания), как молекулы захвата.
  4. Смыв несвязанных анти-CD63 антитела или молекулы аннексина V с использованием 10 мкл соответствующего PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА или аннексина V связывания буферные растворы в течение 3 × 1 мин, соответственно.

2. Сыворотка и водных Юмор Отбор проб и обработка

  1. Сыворотка коллекция.
    1. Соберите 10 мл периферической крови из вены в пробирки разделения сыворотки и аккуратно переверните трубку пять раз. Установка трубки в вертикальном положении и ждать в течение 30 мин.
    2. Центрифуга при 1200 х г в течение 15 мин. Передача сыворотку из верхнего слоя в чистую пробирку и центрифугируют снова в 3000 х г в течение 30 мин.
    3. Пропустите супернатант через FIL 0,8 мкмтер. Хранить образца при -80 ° С до использования.
  2. Водные юмора сбора: Сбор водных образцов юмор от пациентов, диагностированных у офтальмолога непосредственно с помощью инвазивных процедур и хранить образцы при -80 ° С до использования.

3. Выделение внеклеточной пузырьков

  1. Точечные пробы на каждого испытуемого зоне бумаги в размере 5 мкл / мин.
  2. Смыв несвязанных электромобилей с 10 мкл соответствующих PBS, содержащий 1% (вес / объем) БСА или аннексина V связывания буферные растворы для 3 × 1 мин для бумажных устройств, функционализированных молекул анти-CD63 антитела или аннексина V, соответственно. Выполните следующие ниже по течению анализов.

4. Downstream Анализ Пример 1: Сканирование Electromicrographs

  1. Fix электромобилей, снятые на функционализованного индикаторная бумага зону с помощью 10 мкл 0,5 × фиксатор Карновскому в течение 10 мин.
  2. Промыть образцов с достаточно PBS для 2 × 5 мин.
  3. ДегидрироватьОбразцы с последующим 35% -ным этанолом в течение 10 мин, 50% этанола в течение 2 × 10 мин, 70% этанола в течение 2 × 10 мин, 95% этанола в течение 2 × 10 мин, и 100% -ного этанола в течение 4 × 10 мин.
  4. Критический сухой и распыляют пальто образцов с палладий / золото, и изучить с помощью сканирующего электронного микроскопа, работающего при низком напряжении ускорения электронов (~ 5 кВ).

5. Переработка Пример анализа 2: Бумага на основе ELISA

  1. Добавить 5 мкл раствора, содержащего анти-CD9 первичного антитела 1: 1000 разбавление в PBS в каждую тестовую зону, содержащую отснятые электромобилей. Подождите 1 мин.
  2. Промыть образцов с 30 мл PBS, встряхивали при 100 оборотах в минуту в течение 30 сек.
  3. Добавить 5 мкл раствора, содержащего пероксидазу хрена (HRP) -связанной вторичного антитела в 1: 1000 разбавления в ФБР и подождите 1 мин.
  4. Промыть образцов с 30 мл PBS, встряхивали при 100 оборотах в минуту в течение 30 сек.
  5. Добавить 5 мкл колориметрический субстрат, содержащий 1: 1 объемное соотношение перекиси водорода ANd 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (TMB) и сканировать с помощью настольного сканера.

6. На выходе Анализ Пример 3: Выделение РНК

  1. Погрузите образцы в 35 мкл поливинилпирролидон на основе помощи выделения РНК и 265 мкл лизис / буфера для связывания лизировать электромобилей в плен. Vortex энергично.
  2. Добавить 30 мкл гомогената, представленную в изоляции комплекта к лизата. Вихревой энергично и помещали на лед в течение 10 мин.
  3. Извлечение РНК с использованием кислоты разделение фенола-хлороформа, описанной в следующих шагов.
    1. Взять 330 мкл фенол-хлороформом в нижнем слое бутылки и добавить в гомогенате / лизата. Vortex энергично.
    2. Центрифуга при 10000 х г в течение 5 мин. Передача водный (верхний) фазы в чистую пробирку и отмечают объем удален.
  4. Осадок тотальную РНК с 100% -ным этанолом в объеме, который 1,25-кратный объем водной фазы удалена на предыдущей стадии, и соllect РНК в элюции раствора, предварительно нагретую до 95 ° C.
  5. Концентрат и дальнейшей очистки РНК с использованием набора для РНК очистки в соответствии с протоколом изготовления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность устройства бумаги, чтобы изолировать подгруппы электромобилей эффективно зависит от его высокой чувствительностью и специфичностью распознавания EV поверхностных маркеров. Стабильный модификация бумажных волокон с молекулами захвата достигается с помощью авидин-биотин химии, как описано в другом месте 28-30. Эффективность химической конъюгации и метода физической адсорбции оценивается с помощью флуоресценции на основе показаний. Индикаторной бумаги зоны получают в соответствии с шагом протокола 1)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее важные шаги для успешного выделения подгрупп внеклеточных пузырьков являются: 1) хороший выбор бумаги; 2) стабильное и высокий уровень охвата молекул захвата на поверхности бумаги волокон; 3) правильное обращение с образцами; и 4) общая лаборатория гигиены практика.

Пористые материалы были использованы во многих недорогих и оборудования свободной анализов. Они могут иметь настраиваемый размер пор, универсальные возможности, низкая стоимость и высокое соотношение площади поверхности ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана Тайваньского Национального научного совета grants- НСК 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) и НСК 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) и Генерального ветеранов Больницы и системы высшего образования Тайваня совместной программы исследований (CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Хроматографическая бумагаGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Целлюлозная бумага Grade 1
(3-Меркаптопропил) триметоксисиланSigma Aldrich175617Это химическое вещество вступает в реакцию с водой и влагой и должно наноситься внутрь наполненного азотом перчаточного мешка. Избегайте контакта с глазами и кожей. Не вдыхайте испарения и пары.
ЭтанолFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, молекулярно-биологический класс
бычьего сывороточного альбумина (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Часто упоминается как фракция Кона V.
N-γ-малеимидобутироксисукцинимидный эфир (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS представляет собой амино-сульфгидрильный сшиватель. GMBS чувствителен к влаге.
АвидинПирс Биотехнология31000НейтрАвидин имеет 4 сайта связывания для биотина и его значение pI составляет 6,3, что более нейтрально, чем нативный авидин
биотинилированный мышиный анти-CD63Ancell215-030AHN16.1/46-4-5
биотинилированный аннексин VBD Biosciences556418Annxin V имеет высокое сродство к фосфатидилсерину (PS)
Первичный анти-CD9 и вторичный антителоSystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1Вторичное антитело представляет собой
пробирки для разделения сывороткиBD Biosciences367991активатор сгустков и гель для разделения сыворотки
Аннексин V связывающий буферBD Biosciences55645410x; разбавить до 1x перед использованием.
Набор субстратов TMBBD Biosciences555214Набор содержит перекись водорода и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB)
[header]
Набор для выделения РНКLife TechnologiesAM1560MirVana Набор для выделения РНК
основе поливинилпирролидона LifeTechnologiesAM9690Средство для выделения РНК растений содержит поливинилпирролидон (ПВП), который связывается с полисахаридами.
Набор для очистки РНКQiagen Inc.74004Набор для очистки РНК MinElute предназначен для очистки до 45  μ г РНК.
Плазменная камераMarch InstrumentsPX-250
Сканирующий электронный микроскопHitachi Ltd.Настольный сканер S-4300
компании Hewlett-PackardPhotosmart B110получил 8-битные цветные изображения. Также можно использовать фотоаппараты и смартфоны.
Система записи изображенийJ& ПолученыChemi-XX8 компании H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8. Также можно использовать флуросцентные микроскопы.
клон с пероксидом хрена на 16-битные изображения флуросцирования

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesPaper based DeviceImmunoaffinity IsolationScanning Electron MicroscopyP ELISATranscriptome AnalysisCD63 AntibodyAqueous HumorSerum ProcessingRNA Extraction

Related Articles