Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение

10.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52724

⸱

27 сентября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

В этой статье

Краткое содержание

Контроль синтеза белка происходит в основном на этапе инициации трансляции, дефицит которого связан с различными нарушениями. Чтобы лучше понять их этиологию, мы описали здесь протокол с использованием ооцитов Xenopus laevis, оценивающий трансляцию транскрипта mos в присутствии мутанта фактора инициации трансляции eIF4G1.

Аннотация

Синтез белка является фундаментальным процессом в экспрессии генов влияющих различные биологические процессы особенно адаптации к условиям окружающей среды. Шаг инициация, которая включает в себя сборку рибосомных субъединиц на мРНК кодон инициации, участвующих фактором инициации в том числе eIF4G1. Дефекты в этом ограничение скорости шага перевода связаны с различными нарушениями. Для изучения возможных последствий таких дерегулирования, Xenopus ооциты Laevis составляют привлекательную модель с высокой степенью сохранения существенных клеточных и молекулярных механизмов с человека. Кроме того, во время мейоза созревания ооциты транскрипционно подавляются и все необходимые белки из ранее существовавших переведены, по материнской линии, полученных мРНК. Это недорогая модель позволяет экзогенный мРНК, чтобы стать совершенно интегрированный с эффективной трансляции. Здесь описан протокол для оценки перевод с коэффициентом интерес (здесь, eIF4G1) с помощью STORред материнской мРНК, которые в первую очередь Полиаденилированную и переведены во созревания ооцитов как физиологического состояния. Во-первых, мРНК синтезируются транскрипцией в пробирке плазмид интереса (здесь eIF4G1) вводят в ооцитах и кинетики созревания ооцитов по зародышевого пузырька обнаружения пробоя определяется. Исследуемый материнской мРНК-мишени является серин / треонин-киназы белка мес. Его полиаденилирования и его последующее перевода исследованы вместе с выражением и фосфорилирования белков МОП каскад участвует в созревании ооцитов сигнализации. Вариации текущего протокола выдвинуть трансляционные дефекты также предложил, чтобы подчеркнуть свою общую применимость. В свете новых доказательств того, что аберрантная синтез белка могут быть вовлечены в патогенез неврологических расстройств, такая модель дает возможность легко оценить эту нарушения и определить новые цели.

Введение

Белки являются важнейшими элементами клеточной жизни и, таким образом, в более масштабных организма. Они обеспечивают большинство клеточных функций, включая структуры, транспорта, реакции катализа, регулирования, экспрессии генов и т.д. Их выражение является результатом сложного механизма перевода, позволяющего преобразование мРНК в белок. Перевод подвергается различных элементов управления, чтобы адаптироваться и регулировать экспрессию генов в соответствии с потребностями клеток, в процессе разработки и дифференциации, старения, физиологических стрессов или патологических проявлений.

Перевод делится на 3 фазы (инициация, удлинение и прекращение) и подарками 3 системы инициирования перевода для того, чтобы реагировать на эти потребности: крышка-зависимой, крышка независимый помощью вхождения рибосом сегмента (IRES) структур и кэп-независимый Усилители перевода ( САЙТ).

Большинство эукариотических мРНК переводится в кепке-депеОтступ образом через 7-methylguanosine 5'-трифосфата колпачком, который служит в качестве признака распознавания в процессе синтеза белка. Этот колпачок связывается с eIF4E, компонент eIF4F комплексе с eIF4G1 и eIF4A. Связанное с другими партнерами, такими как поли (А) белок, связывающий (PABP), eIF2-ГТФ-Met-тРНК Met, эти факторы инициации трансляции позволяют рассылать циркуляры мРНК и не улучшить доступность форм 43S комплекс до начала AUG-кодона признания 1. Это событие соответствует концу инициации трансляции т.е. на первой стадии перевода.

Кап-независимый перевод используется мРНК, кодирующей белки для основных при стрессовых условиях, которые вызывают пролиферации экземпляр и апоптоза клеток. Этот механизм включает в себя вторичные структуры в мРНК 5'нетранслируемой области (UTR) называется IRES, конец карбокси-конец, связанный с eIF4G1 eIF4A и комплекса 43S. Связывание этого 43S предварительно инициации Complex для IRES инициирует колпачок независимый перевод без необходимости фактора eIF4E 2,3.

Наконец, еще один механизм перевода до сих пор не понятны поддерживает этот шапка-независимый переводческой деятельности при стрессовых условиях с помощью САЙТ структуры, расположенные в мРНК УТР 4.

С помощью этих различных режимах, отличающихся перевод их шагов инициирования, перевод играет важную роль в клеточном гомеостазе и любое изменение в одном из этих процессов, таким образом, повлиять на организм малых и больших эффектов масштаба. В самом деле, начало является ограничение скорости шаг руководящим правильные процессы трансляции мРНК в белки и, таким образом, цель многочисленным управления и точек регулирования 5. Является ли это для него или для компонентов этих процессов, если один оказывается дефектным, он будет нарушать сложившийся баланс в клетке и, таким образом, может привести к патологическим кондиционции. В этом контексте, мутации в факторов перевода были вовлечены в нескольких заболеваний, включая нейродегенеративных расстройств, таких как `лейкоэнцефалопатии с нулевыми белого matter' (eIF2B1-5 субъединицы) 6, при синдроме Уолкотт-Rallison (EIF2AK3 ген, кодирующий для PERK) 7, потенциально болезнь Паркинсона (eIF4G1 p.R1205H) 8. Поэтому важно, чтобы провести клеточные и молекулярные исследования мутантных белков, чтобы увеличить наши знания о развитии болезни и на общем процессе инициации трансляции.

Для проведения этих исследований, важно, чтобы выбрать наиболее адекватные модели для наблюдать последствия этих мутаций у Xenopus Laevis ооциты особенно хорошо приспособлен из-за их физиологических и биохимических свойств:. Физиологическая синхронность (заблокирован в фазе G2 клеточного цикла) , высокая производительность синтеза белка (200-400 нг / день / ооцитов), большое количество добываемой МНКytes из того же животного (800-1000 ооциты / женские) и размер ячейки (1,2-1,4 мм в диаметре), что облегчает их манипуляций. Микроинъекция Xenopus ооцитах с синтезированной мРНК может быть легко выполнена рассекать шаги по переводу. С этой точки зрения она представляет другие преимущества. Учитывая скорость прогрессирования мейоза и перевода после микроинъекции мРНК (~ 24 ч), Xenopus ооцитов представляет собой систему быстрой по сравнению с восстановленным сотовых систем (извлеченных из E.coli, зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика ...), в котором мРНК переводится с пониженной скорости перевода и при более низкой скорости. Таким образом, эффекты мутации, введенной в мРНК будет быстро и легко наблюдаемой изучали в нескольких ооцитов. Еще одно преимущество Xenopus ооцитах, что материнских мРНК скрыты и перевод белок заблокированы до прогестерона стимуляции. Добавление прогестерона, таким образом, является хорошим средством контроля индукции перевода. Цитоплазма рolyadenylation не происходит во время оогенеза. Она начинается во время созревания ооцитов прогестерона стимулированных яйцеклеток в временном порядке и продолжается в течение раннего развития и может быть использован для изучения различных этапов перевода.

Полиаденилирования МО мРНК является одним из первых, происходит и принадлежит с Aurora A / EG2, гистонов-Like B4 мРНК к классу "раннее созревание» генов, как определено в Charlesworth и др. (2004) 9. Поступательное индукция "поздних" мРНК, таких как циклин A1 и B1 Cyclin происходит вокруг время зародышевого пузырька пробоя (GVBD). Мос мРНК кодирует серин / треонин киназы-белка. Его перевод имеет решающее значение, так как это вызывает МАР-киназы каскад, который косвенно активирует созревание ооцитов. В самом деле, в ответ на прогестерон, полиаденилирование МО мРНК усиливается с помощью процесса, включающего Aurora A / Eg2 регуляторные белки и другие РНК-связывающие белки с ме 3'UTR МО мРНК. Это увеличение полиаденилирования МОП мРНК приводит к увеличению уровня МОП белка, который в свою очередь активирует MEK1. Этот процесс опосредует активацию внеклеточной сигнальной киназы-2 регулируется (ERK2) (рисунок 1). Это сигнальный каскад может вызвать созревание M-фазу факторов, способствующих, комплекс, образованный циклин B и Cdc2 киназы, и в конечном итоге приводит к возобновлению мейоза.

Поэтому в Xenopus ооциты Laevis, исследование материнских мРНК, таких как MOS может быть легко использован для тестирования их переводимости с несколькими конечными точками от их эффективного полиаденилирования для перевода нескольких мес сигнализации компонентов, в том числе и определение скорости GVBD. Эта система, следовательно, интересно оценить первые последствия мутаций в факторах инициации трансляции без помех вновь транскрипции мРНК или эффективность трансфекции, проблемы часто происходят с eukaryушные исследования клеток.

Вот протокол устанавливается в случаях мутантные eIF4G1 мРНК микроинъекций в ооциты Xenopus Laevis и перевод материнской мРНК проверяется. В присутствии дефекта в прогрессии GVBD МОП мРНК полиаденилирования, которая является существенным для прогрессии через ооцитов мейоза клеточного цикла и последующего перевода ранних и поздних мРНК класса Установлено. Фосфорилирование Aurora A / Eg2 и ЭРК также изучал, чтобы подтвердить следствие МО deregulation.Thus, Xenopus ооциты представляют собой простой способ для анализа различные этапы трансляции мРНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились Xenopus на животных объекту Лилль 1 Университет в соответствии с правилами руководящих принципов Совета Европейского сообщества (86/609 / EEC) для лабораторных экспериментов на животных. Протокол животных был утвержден местным советом институционального обзора (Comite d'Ethique ан Эксперименты Животные Нор-Па-де-Кале, CEEA 07/2010).

1. Яйцеклетка Обращение

  1. Подготовка раствора анестетика: растворить 1 г Tricaine метана сульфонатного порошка в 1 л стерильной воды.
  2. Окунитесь женщина Xenopus Laevis в этот раствор, покрыть стакан, чтобы избежать побега и ждать примерно 45 минут, чтобы животное могло быть полностью в отключке (без реакции на крайнем ноги).
  3. Вымойте лягушку с мылом и сполоснуть водой то место животного на спине на чистом алюминиевой фольги.
  4. Зажмите кожу боковой части живота и на уровне яичников щипцами.Сделайте надрез около 1 см с ножницами очищенных перед использованием этанола 70%. Убедитесь, что раздел достаточно глубоко и достичь основной брюшной стенки, чтобы позволить иссечение ткани яичников, в которых несколько ооцитов на разных стадиях развития находятся.
  5. Проанализируйте яичника долей, мыть их в 4 раза в чашке Петри (50 мм) с ND96 среды (96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,8 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES доводили до рН 7,4 с NaOH, дополняется 50 мкг / мл стрептомицина / пенициллин, 225 мкг / мл пируват натрия, 30 мкг / мл соевого ингибитора трипсина, 1 мкл / мл тетрациклина), чтобы удалить все следы крови и мусора.
    Примечание: Тетрациклин позволяет оптимальное сохранение и хорошее восстановление после лечения микроинъекции.
  6. Храните их в закрытом чашке Петри, погруженной в среду в 14 ° C, что позволяет их сохранность в течение одной недели.
  7. Вышивание брюшной стенки и кожи с ветеринаром рассасывающиеся тhread и ушивание иглы (3 или 4 стежков будет необходимо).
  8. Поместите животное в стакане воды и без влажная кожа с водопроводной водой до тех пор, пока лягушка снова двигаться. Накройте стакан, чтобы предотвратить побег.
  9. Отдельные тщательно яичника долей в среде, в группах от 5 до 10 ооцитов с помощью 2 пар щипцов под стереомикроскопа с 10-кратным увеличением. Выберите ооциты на стадии VI. Они могут быть признаны I) их форму и цвет с коричневым пигментного полюса животных и желтого растительного полюса, разделенных четкой пояса II) их размер превосходит 1,2 мм в диаметре 10.
  10. Инкубируйте выбранные ооциты в растворе коллагеназы (1 мг / мл коллагеназы А из Clostridium histolyticum, растворенного в ND96 без тетрациклина) в чашке Петри при осторожном перемешивании в течение 45 мин, чтобы облегчить ооцитов defolliculation (коллагеназа переваривает ооцитов / фолликулярных соединений клеток). Промойте ооциты 3 или 4 раза с ND96 среды выдерживают при 14° С.
    Примечание: Не инкубировать ооцитов меньше или больше, чем 45 мин из-за риска разрушения ооцитов поверхностные белки и причинения плохой жизнеспособность. Лечение Коллагеназа может вызвать спонтанное GVBD.
  11. Инкубируйте ооцитов в среде в течение 3-4 ч. Удалить фолликулярных клеток с мелкими пинцетом под бинокулярной лупой и держать их на 19 ° С в среде ND96.

2. Подготовка мРНК синтеза

  1. Линеаризовать 5 мкг следующих плазмид ферментативным расщеплением с использованием ПМЭ я фермента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: pcDNA6.2 / V5-DEST, содержащий 1599 амино-кислоты eIF4G1 кДНК дикого типа (WT-eIF4G1; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST содержащий eIF4G1 доминирующее негативное кДНК (eIF4G1-DN) с мутациями c.2105T > G c.2106A> С, c.2120-> G, c.2122T> А, 2125T> - и c.2126T> G в области взаимодействия между eIF4G1 и eIF4E в положении 612 до 618 соответствующего белка препятствующий выполнению Взаимодействие betweан eIF4G1 и eIF4E 8, pcDNA6.2 / С-EmGFP содержащий хлорамфеникол ацетил трансферазы (GFP),. Подготовьте 2 смесей для каждого из 3 плазмид: первый том числе ПМЭ я фермента и второй без фермента в качестве контроля.
  2. Осадок ДНК плазмиды с использованием классической процедуре этанола и ресуспендируют его в 20 мкл нуклеазы без H 2 O.
  3. Определить его концентрацию, используя спектрофотометр. Концентрация должна быть выше 150 нг / мкл, чтобы расшифровать кРНК.
  4. Запустите 1 мкл образцов и их управления с 5 мкл загрузочного буфера на 0,8% агарозном геле для проверки плазмиды линеаризацию.
  5. Использование комплекта для транскрипции в пробирке и очистки кРНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Транскрибированная кРНК ресуспендировали в 20 мкл нуклеазы без H 2 O. Образцы могут храниться при температуре -80 ° С в случае необходимости.
  6. Подготовка миграции буфер MOPS 10X, содержащий 0,2 М MOPS (рН 7,0), 20 мМ ацетата натрия и 10 мМ ЭДТА (рН 8,0). Стерилизация раствора с 0,45 мкм фильтр. Фондовый решение, защищенном от света при комнатной температуре, чтобы избежать окисления раствора.
  7. Очистите электрофореза бак последовательно NaOH, HCl и тщательно промыть дважды фильтруют воду для O / N, чтобы избежать РНКазы и предотвращения деградации РНК.
  8. Литой 1,5% агарозном геле, содержащем формальдегид швабры и. Теплый до полного растворения агарозы и дайте ему остыть до 55 ° С. Под вытяжкой, добавить 0,1 объема MOPS 10X, 6,6% формальдегида и 4 мкг бромистым этидием (10 мг / мл). Вылейте гель под тягой и подождите примерно 1 час для гель для упрочнения.
    Примечание: Формальдегид и бромид этидия являются токсичными.
  9. Подготовка образцов для миграции в 0,2 мл трубки с 1 мкл Чёрный, 8,8% формальдегида, 60% формамида и 0,1 объема MOPS 10X. Инкубировать в течение 3 мин при 70 ° С и поместить пробирки на лед в течение 10 мин. Центрифуга образцы на несколько секунд5000 х г. Добавьте 2 мкл буфера для нанесения геля.
    Примечание: Формамид является токсичным.
  10. Запуск образцов в течение 20 мин при 90 В. Замочите геля в нуклеазы без H 2 OO / N, чтобы destain гель перед анализом его, чтобы проверить качество кРНК.
  11. Определить концентрацию кРНК с использованием спектрофотометра и хранить их при температуре -80 ° С.

3. Микроинъекция синтезированной РНК и ооцитов Созревание стимуляции

  1. Подготовьте необходимое оборудование для ооцитов микроинъекции. Используйте микропипетки съемник тянуть небольшой стеклянный капилляр. Под стереомикроскопа, разорвать оконечность капилляра с помощью пинцета, чтобы создать тупой конец. Заполните капиллярную микропипетки с минеральным маслом при помощи 1 мл шприц с микропористый фильтр 0,45 мкм на другой ноге. Установите микропипетку на микроинъекции пипетки. Выберите точный микропипетку калиброванный производителем, чтобы дать хорошую точность при работе с соответствующим стеклянного капилляра.
  2. Выполните микроинъекции 1-2 часа после defolliculation, необходимо задержки для восстановления ооцитов на ооциты выдерживают при 14 ° С. Блюда использования Петри с нижней Царапины щипцами, чтобы создать клейкую поверхность для ооцитов и заполнить их с ND96 среды.
  3. Расположить ооциты вдоль шнековом полосу в чашке Петри позволяя последовательной закачке ооцитов с капиллярной микропипетки под углом 45 ° С.
  4. Вводят в ооцита экваториальной зоне, ниже пигментированной области животного для оптимального диффузии образцов в цитоплазме. Вставьте только тонкая часть капиллярного кончика на приблизительно 150-200 мкм глубины.
  5. Вводят 30 нг кРНК, полученной из, соответственно, из плазмид различных в объеме 60 NL в первом ооцита. После инъекции, подождите 5-10 сек перед удалением наконечника, чтобы избежать капиллярного образца побег (рис 2А).
    Примечание: Не превышать 120 NL. Вводите медленно, как вы можете. Контрольная дистиллированной водой рекомендуется.
  6. Перемещение вручную чашку Петри, чтобы придать следующий яйцеклетки.
    Примечание: Убедитесь, что наконечник не забиты генерации небольшой импульс из раствора ванны после 2 до 3 микроинъекций.
  7. Передача вводят в ооциты 24 лунок культуральных планшетах (10 ооциты / лунку) заполнены 3 мл свежей среды ND96 и оставить их на 19 ° C.
  8. Инкубируйте ооцитов в ND96 с прогестероном (PG) (2 мкг / мл), чтобы вызвать созревание мейоза (GVBD) в 19 ° C, 15 ч или 4 ч после микроинъекции полиаденилированных CRNAs полученных, соответственно, из pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 и pcDNA6 0,2 / С-EmGFP использовали в качестве контроля (фиг.2А).
    Примечание: Со-инъекция флуоресцентным маркером с кРНК хороший инструмент для того, чтобы кРНК вводили и оставался в ооцит. Выполните такие предварительные эксперименты, используя кРНК интерес с GFP тега.
  9. Microinject как в # 3.5 различные соотношения (1: 3; 2: 2; 3: 1) полиаденилированных eIF4G1-WT и eIF4G1-DN CRNAs чтобы т.еул эффект перевод eIF4G1-WT CRNAs на мутанта фенотипа (рис 2D).

Определение 4. Распределение зародышевого пузырька

  1. Подсчитайте количество зрелых ооцитов после стимуляции PG наблюдая присутствие белого пятна на черном анимальной с стереомикроскопа. Повторите считая каждый час до тех пор, двадцать четвертого часа (рис 2B, 2C).

5. Вестерн-блот (ВБ) Анализ

  1. Однородный группу 10 ооцитах назад и вперед движений с наконечником микропипетки, при 4 ° С в 200 мкл в следующем буфере: 50 мМ Hepes, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 0,05% ДСН, 5 мМ MgCl 2, 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, 10 мг / мл лейпептина, 10 мг / мл апротинина, 10 мг / мл ингибитора соевого трипсина, 10 мкг / мл бензамидина, 1 мМ PMSF, 1 мМ ванадата натрия.
  2. Центрифуга образцов в течение 15 мин при 10000 х г для удаления липида (верхнюю фазу) и мембраной (нижняя фаза) Fractions. Сбор цитоплазматической фракции, хранить аликвоты для определения концентрации белка и завершить оставшиеся с Laemmli или буфера для образцов Bis-Tris (1: 1).
    Примечание: Bis-Tris гели и загрузочным буфером имеют более нейтральный рН, который защищает белки от гидролиза
  3. Тепло 20 мкг образца при 95 ° С в течение 10 мин. Загрузите каждый образец в лунки геля акриламида. Поместите гель в резервуаре с соответствующим буфером.
  4. Выполнение электрофорез в течение 1 ч при 200 В.
  5. Реализовать ВБ в TBS рН 8,0 (Трис HCl 15 мМ, NaCl 150 мМ, Tween 0,1%, содержащей 10% бычий сывороточный альбумин) с козьим анти-Aurora A / EG2 (1: 3000, 2 ч) или с кроличьей анти -Aurora А / Eg2-П (1: 1 000, М / Н при 4 ° С), мышиное анти-ERK2 (1: 3000, 2 ч), козий анти-ERK2-Р (Tyr204) (1: 3000, 2 ч ), кролика против МОП (1: 5000, 4 ч), кролика против GFP (1: 3000, 2 ч) antibodies.Use мышиных антител анти-V5 (1: 10000, 2 ч) и кролика против Риск (1 : 1000, 2 ч) (в качестве контроля нагрузки).
  6. мытьмембрана 3 раза в течение 10 мин TBS-Tween и инкубируют 1 час с любым анти-мышь или анти-кроличий или анти-козел (IgM) с пероксидазой хрена меченого вторичного антитела в разбавлении 1: 5000, 1: 7500 и 1 : 5000 соответственно.
  7. Выполните 3 промыли 10 мин в TBS-Tween и обнаружить антиген-антитела комплексов с системой обнаружения Расширенный ECL.

6. Анализ Полиаденилирование

  1. Образец 5 ооциты в состоянии в 1,5 мл. Вымойте их с 1 мл нуклеазы PBS 1X (рН 7,4). Следующие шаги будут сделаны под вытяжкой.
  2. Извлечение РНК с использованием классической органической процедуру (см инструкции производителя).
  3. Восстановление РНК центрифугированием (10000 х г) в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и сухой воздух РНК в течение 10 мин.
  4. Ресуспендируют осадок РНК в 30 мкл нуклеазы свободной H 2 O.
  5. Возьмем 15 мкл образцов в новую пробирку и добавить 85 мкл нуклеазы без H 2 O. УбиратьОбразцы SE улучшить их качество на колонке с силикагелем, в соответствии с инструкциями изготовителя. Элюируют РНК с использованием 30 мкл нуклеазы свободной H 2 O
  6. Запуск 1 мкл образцов с 5 мкл загрузочного буфера на 0,8% агарозном геле, чтобы проверить целостность РНК.
  7. Определить концентрацию РНК с использованием спектрофотометра.
  8. Подготовьте 2 лигирования смеси на каждое условие (т.е. eIF4G1-WT, eIF4G1-Ду и 2 O Control Н) со следующими реагентами: 10 U РНК-лигазы, 0,1 объем 10X буфера, 1 мМ АТФ, 10% PEG8000 50% , 0,1 мкг праймера Р1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 и приведения конечного объема 10 мкл с нуклеазы без H 2 O. Добавить в первой смеси РНК, полученной из ооцитов без PG стимуляции и во втором смеси РНК, полученной из PG стимулировали ооцитов.
  9. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С, затем в течение 20 мин при 65 ° С, чтобы инактивировать фермент.
  10. НамEA кДНК обратной транскрипцией (RT) комплект. Подготовьте смесь RT, за трубы: 0,1 Объем буфера 10X РТ, 0,1 мкг праймера Р2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, 4 мМ дНТФ смеси, 50 ед обратной транскриптазы и в комплекте с нуклеазы без H 2 O до конечного объема 10 мкл. Добавить 10 мкл реакции лигирования полученной ранее. Выполните RT в условиях, описанных изготовителем.
  11. Подготовьте полимеразной цепной реакции (ПЦР) Смесь, на пробирку: 0,1 объем буфера 10Х, 1,5 мМ MgCl 2, 133 мкМ дНТФ смеси, 0,2 мкМ специфического праймера, 0,2 мкМ праймера Р2, 0,025 U Taq-полимеразы, 1 мкл кДНК и в комплекте с нуклеазы без H 2 O до конечного объема 50 мкл. Выполните ПЦР при следующих условиях: 50 ° C в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, [95 ° C в течение 1 мин, 56 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек] * 40 циклов, 72 ° С в течение 10 мин 9. В специфических праймеров в следующем: MOS, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA гистонов, как В4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Циклин A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Циклин В1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
  12. Приготовьте 3% агарозном геле. Добавить в каждой ПЦР-продуктов 10 мкл буфера для. Запуск гель с 10 мкл образцов при 110 В для оптимального миграции. Анализ гель после 10 и 20 мин наблюдать изменение размера отражающий длина хвоста поли (А) и, таким образом РНК созревания, который является необходимым условием для их перевода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Кинетическая созревание ооцитов Xenopus и определения процент ооцитов GVBD после 24 часов П.Г. стимуляции (рис 2B, 2C):

Для того, чтобы изучить трансляции последствия мутации eIF4G1-DN, ответ на PG У Xenopus ооциты Laevis микроинъекции с кРНК eIF4G1-DN по сравнению с eIF4G1-WT и других контрольных условиях (H 2 O, GFP). Элементы управления позволяют оценить частоту ооцитов микроинъекции независимо от природы вводимой кРНК или eIF4G1 свер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перевод представляет собой механизм участвует в физиопатологии многочисленных заболеваний у человека и в том числе несколько нейродегенеративных заболеваний. Например, в болезни Паркинсона несколько докладов предложил обесценение в переводе, связанные с наследственными мутациями 8,12,13.

Несколько сотовых модели доступны для изучения перевода. Вот для того, чтобы изучить трансляции последствия мутации в eIF4G1, который действует как доминирующее негативное мутации, уменьшая взаимо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом INSERM, Университет Лилля 1, Университет Лилля 2, Региональный больничный центр Лилля (CHR de Lille). MCCH выражает признательность за поддержку со стороны Фонда Франции и выражает благодарность IRCL, профессору Соненбергу за подарок V5-плазмид, доктору Диссу (Институт Пастера, Лилль) за подарок антител против GFP, UMS 3387 (Университет Ренна), где приобретены ооциты Xenopus, и доктору Таймансу (JPArc, Лилль) за критическое прочтение текста рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трикаин, сульфонат метана,SandozMS-222обработка ооцитов
щипцыMoriaDumont MC40
стрептомицин/пенициллинSigma781
пируват натрияSigmaP2256
ингибитор трипсина сои,SigmaT9128
тетрациклинSigmaT7660
Ветеринарная рассасывающаяся викрильная нитьJohnson& Johson IntlJV1205
Коллагеназа АRoche диагностика10103586001
PmeINew England BiolabsR0560SПолучение синтетической мРНК
ДНКазы/РНКазы без H2OLife Technologies10977
Ацетата натрияMerck6268
Абсолютный этанолSigma02854
Nano DropThermo Scientific
TBE 10XEppendorf0032006.507
Бромид этидия 10 мг/млLife Technologies15585-011
mMESSAGE mMACHINE KitAmbion by Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
АгарозаЛайф Технолоджид16500-500
Формальдегид 37%Merck1.04003.1000
ФормамидФлюка47671
Гель Doc ImagerBiorad
Ооцит Пипетка с 100 стеклянными капиллярами 8"Drummond Scientific Company3-000-510-Xмикроинъекция
Сменное стекло 8"Drummond Scientific Company3-000-210-G8
0.45 &; m фильтрMilliporeSLHA025NB
ProgesteroneSigmaP0130
HepesSigmaH3375Western Blot
NaClSigmaS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2SigmaA3294
Бычий сывороточный альбуминSigmaA4612
лейпептинSigmaL8511
апротининSigmaA1153
бензамидинSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
ванадат натрияSigmaS6508
Laemmli bufferBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 мм, 15 лунокLife TechnologiesNP0323BOX
электрофорез SDS-PAGE, мини-Protean TGXBiorad456-1036 и -1096
горизонтальная полусухая блоттинговая системаW.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
мембрана Hybond ECLAmersham Life Science10401180
метанолVWR20846-292
Ponceau Red (0.5%)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
anti-GFPLife TechnologiesA11122
anti-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anti-Eg2Santa Cruz Biotechnologysc-27884
anti-Eg2-PCell SignalingC39D8
anti-ERK2Santa Cruz Biotechnologysc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)Santa Cruz Biotechnologysc-7976
anti-RskSanta Cruz Biotechnologysc-231
anti-mosSanta Cruz Biotechnologysc-86
меченое вторичное антитело против пероксидазы хренамыши Santa Cruz Biotechnologysc-2005
против пероксидазы хрена кролика меченое вторичное антителоSanta Cruz Biotechnologysc-2812
против козьей пероксидазы хрена меченое вторичное антителоSanta Cruz Biotechnologysc-2378
Усовершенствованная системаобнаружения ECLAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417анализ полиаденилирования
ТРИЗОЛ (реагент для лизиса Qiazol)Qiagen79306
ХлороформSigma31998-8
ИзопропанолSigma278475-1L
RNeasy мини-наборQiagen74106
RTL buffer Qiagen79216
РНКаза без ДНКазыQiagen79254
ПраймерыEurogentec
T4 РНК-лигаза 1 New England BiolabsM0204S
Набор для обратной транскрипции c-ДНК большой емкостиApplied Biosystems, Life Technologies4368813
Taq-полимеразаLife Technologies10342020
, , , , , , , , ,

Ссылки

  1. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  2. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
  3. Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
  4. Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
  5. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  6. Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
  7. Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
  8. Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
  9. Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
  10. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
  11. Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
  12. Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
  13. Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
  14. Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
  15. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449(2012).
  16. Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
  17. Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
  18. Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
  19. Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
  20. Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
  21. Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
  22. Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
  23. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  24. Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138(2013).
  25. Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
  26. Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

инициация трансляциисозревание ооцитараспад зародышевого пузырькавестерн-блоттингполиаденилирование мРНКсигнальный каскад Mosстимуляция прогестерономмутация eIF4G1капиллярная микроинъекция
Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.