Концентрические Гель Система по изучению биофизических роли матриксных микроокружения на 3D миграции клеток

Краткое содержание

Механические свойства и микроструктура внеклеточного матрикса сильно влияют 3D миграцию клеток. Метод в пробирке для изучения пространственно-временной миграционного поведения клеток в биофизически переменных среды, на численности населения и индивидуальном уровнях клеток, описывается.

Аннотация

Способность клеток к миграции имеет решающее значение в самых разнообразных клеточных функций на протяжении всей жизни из эмбрионального развития и заживления ран в опухоли и метастазов рака. Несмотря на интенсивные усилия научно-исследовательских, основные биохимические и биофизические принципы миграции клеток до сих пор до конца не изучен, особенно в физиологически соответствующих трехмерных (3D) микросреды. Здесь мы опишем анализа в пробирке разработана, чтобы позволить количественное изучение 3D миграции клеток поведения. Метод основан на использовании способности mechanosensing ячейки и склонность к миграции в ранее не заселенных внеклеточного матрикса (ЕСМ). Мы используем вторжение высоко инвазивных клеток рака молочной железы, MDA-MB-231, в коллагеновых гелях в качестве модельной системы. Распространение популяции клеток и динамика миграции отдельных клеток в течение нескольких недель культуры можно контролировать с помощью визуализации живых клеток и проанализированы, чтобы извлечь spatiotemporally разрешенных данных. Кроме того, Метод легко адаптируется для различных внеклеточного матрикса, тем самым предлагая простой, но эффективный способ изучения роли биофизических факторов в микросреде по миграции клеток.

Введение

Миграция клеток играет ключевую роль в различных физиологических реакций, таких как эмбриональное развитие, гемостаз, и иммунного ответа, а также в патологических процессах, таких как сосудистых заболеваний, воспаления, рака и ^1. Пройдя биохимические и биофизические факторы, лежащие в основе миграции клеток, следовательно, принципиально важно не только понять основные принципы клеточных функций, но и для продвижения различных биомедицинских приложений, таких как в тканевой инженерии, анти-метастазирования и противовоспалительное разработки лекарственных препаратов. Так наблюдение в естественных условиях является технически сложным, много усилий бы....

Протокол

1. Сотовый Сбор

1. Получить MD-MBA-231 клеток из 37 ° C, 5% СО ₂ инкубатора. Отделить клетки от культуры ткани пластины, используя 0,5% раствор трипсина-ЭДТА. Используйте 1 мл раствора трипсина-EDTA для сотовых культивировали в Т25 колбы.
2. Гранул клетки в 15 мл коническую пробирку центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин, супернатант аспирации и ресуспендирования клеток в 5 мл культуральной среды.
3. Количество плотности клеток, ρ, с помощью гемоцитометра.
   Примечание: Чтобы подготовить внутренний гелевый семенами, клеточную суспензию будет позже быть разбавлен 10 × достичь конечной плотности посева клеток. Таки....

Результаты

Концентрические гель анализа, представленные здесь проводили с использованием высоко инвазивных клеток рака молочной железы, MDA-MB-231, 2,4 мг / мл внутренней коллагенового геля и плотности посева клеток из = 2 × 10 ⁶ клеток / мл, в качестве примера. Как показано на рисунке 2, как правило, через несколько дней культивирования клетки нарушил интерфейс внутренний-наружный гель и начал вторгаться в наружную гель. Клеточная популяция распространяется преимущественно в радиальном направлении нару.......

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем анализ in vitro для изучения 3D-миграционного поведения клеток в матричных средах, которые топологически напоминают ВКМ, встречающиеся in vivo. Существует три основных преимущества этого анализа по сравнению с другими доступными в настоящее время методами. Во-первых, этот анализ позволяет одновременно исследовать механизмы миграции клеток как на популяционном уровне, так и на уровне отдельных клеток. Это открывает возможности для изучения коллективной миграции^{клеток13<.......}

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инкубатор для клеточных культур	Fisher Scientific Pte Ltd	Модель: 371, S/No 318854-6055
Конфокальный микроскоп	Nikon A1R		Инвертированный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с камерой инкубатора
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	Life Technologies	10082-147
Флуоресцентный краситель CellTracker CMTMR	Life Technologies	C2927
Чашка со стеклянным дном	IWAKI Cell Biology	3931-035	Чашка диаметром 35 мм со стеклянным дном диаметром 12 мм
Гемоцитометр	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Микропроцессорный pH-метр	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Кислоторастворимый бычий коллаген типа I (стоковый pH ~ 2)
Объектив	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Пенициллин-стрептомицин	Life Technologies	15140-122
pH-метр	Sartorius	S/No 29153352	Базовый pH-метр PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054