Методическая статья

Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

DOI:

10.3791/52737

⸱

19 августа 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Imaging, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Memphis, 4Department of Engineering Technology, University of Memphis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был разработан новый протокол визуализации с использованием специального механического привода с приводом от двигателя, позволяющий измерять реакцию на механическую деформацию в живых клетках в реальном времени. Относящаяся к механобиологии, система может применять деформации до 20%, обеспечивая при этом визуализацию в режиме, близком к реальному времени, с помощью конфокальной или атомно-силовой микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время существует значительный интерес к пониманию того, как клетки и ткани реагируют на механические раздражители, но современные подходы ограничены в своих возможностях измерения реакций в реальном времени в живых клетках или жизнеспособных тканях. Был разработан протокол с использованием клеточного актуатора для растяжения живых клеток, выращенных на эластичной подложке, или тканей, прикрепленных к ней, при визуализации с помощью конфокальной и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Предварительные исследования показывают, что тоническое растяжение эпителиальных клеток бронхов человека вызывало значительное увеличение продукции митохондриального супероксида. Более того, с использованием этого протокола были растянуты и визуализированы альвеолярные эпителиальные клетки, которые показали прямое повреждение эпителиальных клеток при чрезмерном растяжении, имитирующем одну из форм повреждения легких in vitro. Также предусмотрен протокол проведения наноиндентирования АСМ на растянутых клетках.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки подвергают механическим нагрузкам во многих тканях, и это механическое раздражение было показано, способствуют изменения в структуре экспрессии генов, выделению факторов роста, цитокинов, или ремоделирование внеклеточного матрикса и цитоскелетом 1-4. Внутриклеточные сигналы трансдуцированных от таких механических стимулов происходит через процесс механотрансдукции 5-7. В дыхательной системы, одним из результатов механотрансдукции является увеличение активных форм кислорода (АФК) 8,9 и провоспалительных цитокинов 10 в легочных эпителиальных клеток в присутствии циклического напряжения при растяжении. Убедительные доказательства также показывает, что чрезмерное напряжение при растяжении приводит к прямой травмы альвеолярного эпителия, в дополнение к биохимических реакций клеток 11-14. Хотя основное внимание здесь, в первую очередь от реакции легких клеток к механической деформации, пути, вызванные механотрансдукции играть ключевую роль в БАСФункция IC многих тканей в организме человека, в том числе в регуляции сосудистого тонуса 15 и развитие роста пластины 16.

Растущий интерес к механотрансдукции привело к разработке многочисленных устройств для применения физиологически соответствующих механических нагрузок в культивируемых клетках и тканях. В частности, устройства, применяющие деформации растяжения, которая распространенной формой механической нагрузки, испытываемой ткани, популярны 11,17-19. Тем не менее, многие из доступных устройств либо разработан как биореактор для тканевой инженерии или не способствует реального времени визуализации с натяжкой. Таким образом, существует необходимость в разработке инструментов и методов, которые могут визуализировать клеток и тканей в напряженности, чтобы облегчить расследование путей механотрансдукции.

При этом механическое растяжение устройство в плоскости была разработана и протоколы были разработаны для применения мultiple формы деформации тканей и клеток, а позволяет визуализации биохимических и механических реакций в режиме реального времени (1А-D). Устройство использует шесть равномерно расположенных зажимов, расположенных по окружности, чтобы понять гибкую мембрану и применять в плоскости, радиальной живота примерно до 20% (Фиг.1В). Исполнительный механизм может быть размещен в инкубаторе для клеточных культур в течение продолжительного периода времени, в то время как двигатель (рис 1C) расположен вне инкубатора и управляется с помощью патентованного программного обеспечения, предоставленной поставщиком двигателя. Двигатель соединен с линейным драйвером, который вращается внутренний кулачок, вождения шесть носилок зажимы равномерно напряжения и расслабления.

В дополнение к механическим устройством, индивидуальные гибкие мембраны были созданы из коммерчески доступных клеточных культур готовых мембран, которые будут использоваться в механической системе. Затем круговые стенки (диаметром около28 мм) были изготовлены и прикреплены к гибкой мембране таким образом, что клетки могут быть культивированы только в этой области хорошо описанной деформации профиля. Для того чтобы определить, является ли размещение этих мембран в исполнительное устройство обеспечит равномерное и изотропное напряжение в центре гибкой мембраны, анализ методом конечных элементов были проведены с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (рис 1E-F). Гибкая мембрана была смоделирована с симметричными граничными условиями и с использованием всех четырехугольных элементов для сетки. Концентрические кольца видели в контурной участке максимальной главной деформации, показанной на рис 1F показывают изотропное распределение напряжения.

Штамм испытали мембраной измерялась записи изображения маркировки через нагрузки (рисунок 2). Рисунок 2D показывает, что средняя деформация мембраны измеряется в радиальных и осевых направлениях было приблизительно линейнымпо отношению к приложенному двигателя рассчитывает до максимальной линейной деформации 20%. Там не было никакого существенного различия между уровнями деформации, измеренных во время растяжения по сравнению с теми, измеряется при отводе назад в положение покоя. Далее, смещение человека бронхиальных эпителиальных клеток (16HBE) и их ядер культивируемых на заказ гибкой мембраны были измерены. Флуоресцентно меченных (DAPI) Ядра клеток 16HBE визуализируют с помощью цели 20X под конфокальной микроскопии, в то время как объем целая клетка была измерена с фазового контраста изображений, записанных с помощью цифрового микроскопа. Как видно на рисунке 3, штамм измеряется смещением ядер был таким же, измеренная по смещению маркировки на мембране, до ~ 20% линейной деформации. Это подтверждает, что применительно к деформации мембран передается на адгезивных клеток. Протоколы, описывающие применение данного пользовательского устройства на традиционном микроскопе и атомно-силовой microscopэлектронной представлены в следующих шагов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Строительство мембраны с хорошо Стены для удерживания культуры клеток (рис 1D для конечного продукта)

  1. Использование полидиметилсилоксановые (PDMS) листы, покрытые коллагеном I, вырезать контур гибкой мембраны с помощью скальпеля или умереть.
  2. Поместите каждую мембрану в 60 мм чашки Петри для хранения.
  3. Создание стен:
    1. Смешайте PDMS в соотношении 10: 1 по массе эластомера А эластомера B (отвердитель).
    2. Налейте 5 мл полностью смешанных PDMS в 50 мл пробирки.
    3. Поместите 50 мл пробирки с неотвержденных PDMS горизонтально в гибридизации духовке.
    4. Используйте функцию ротора, чтобы покрыть внутренние стенки труб на 8 оборотов в минуту в течение времени отверждения. В РТ, PDMS будет полностью вылечить в течение 2 дней.
    5. Снимите PDMS из трубы в стерильной капот культуре клеток.
    6. Используя новый лезвие, разделить цилиндр PDMS в разделах 4 мм в высоту.
    7. Поместите разделы, которые будут служить в качестве мембраны вазаполняет, в посудомоечной контейнера Петри, не позволяя стены, чтобы стать сминаться.
  4. Выбор и центр одной из стен PDMS с одной мембраной, поддерживая два в чашке Петри.
  5. Аккуратно неотвержденных PDMS (10: 1 соотношение) на внешнем периметре стены для использования в качестве клея. Избегать образования зазоров между стенкой и мембраной, так как она есть, чтобы сохранить жидкость.
  6. Поместите каждую чашку Петри, содержащую заполненную оболочку и покрыты в печи при 70 ° С в течение 24 ч, чтобы вылечить.

2. Соотношение оборотов вала двигателя с помощью зажима или перемещении радиального роста для калибровки (рис 2)

  1. Запустите программу управления двигателем.
  2. Свернуть зажимы устройства, используя ручную настройку в программном обеспечении двигателя.
  3. Измерьте расстояние и записать позицию счета двигателя между противоположными зажимы на обоих минимального и максимального смещения зажимов.
  4. Рассчитать процентное изменение в Distance между зажимами в зависимости от кол двигателя (~ 0-75k отсчетов). Это будет означать максимально возможное напряжение, достигнутый на мембране.

3. Применение Stretch на Мышь легких эпителиальных клеток линии (MLE12)

  1. Семенной MLE12 клетки в 2,5 млн клеток на гибкой мембраны (шаг 1) на лунку для сливающийся в течение двух дней. Плотность посева могут отличаться для различных типов клеток.
  2. Убедитесь, что механический привод находится в полностью расслабленном состоянии.
    1. Удалить культуральной среды клеток.
    2. Использование 1,5 мм биопсии удары, удар два отверстия в каждой из шести зажима (рис 1D) выступы мембраны. Радиальное расположение отверстий определяет количество предварительной напряженности мембранные опыты на начальном этапе. Удар отверстия в радиусе 20,5 мм на мембране вкладок, если нет предварительного натяжения не требуется.
    3. Расположите мембрану на носилках с перфорированные отверстия выстраиваются с контактами внутри зажимов.Поместите верхние зажимы на месте. Затянуть винты по одному переменного сторон.
    4. Добавить 1 мл клеточной культуры.
  3. Поместите устройство на столике микроскопа центрирование середину мембраны с пути света.
  4. Используйте ленту или магниты (если это возможно), чтобы зафиксировать устройство на сцену. После фиксированной, контролировать в плоскости (параллельно мембране) и вертикальном (Z-направление) механическое устройство с контроллером стадии микроскопа.
  5. Применить участок с программным обеспечением, предоставленным производителем вручную контролируя положение и скорость вращения двигателя 20.

4. Измерение митохондриальных активных форм кислорода (АФК)

  1. После того, как клетки сливающийся, добавить 1-2 мл DMEM с РТ митохондриальной супероксиддисмутазы индикатора (5 мкМ конечная концентрация) непосредственно на клетки.
  2. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
  3. Промывают клетки осторожно трижды промывают буфером нагревали на водяной бане до37 ° С.
  4. Сразу же место гибкую мембрану на носилках (этап 2.2) уже в место под вертикальном конфокальной микроскопии.
  5. Добавить 1 мл DMEM с фенол-красный свободной средних и 25 мМ HEPES.
  6. Установите фильтры возбуждения / эмиссии в 510/580 нм.
  7. Image несколько полей каждые 15 мин до достижения желаемого времени курс митохондриальной производства супероксид.
  8. Из захваченных изображений, интенсивность флуоресценции запись гистограмм в каждом интервале времени с помощью программного обеспечения, способного количественной интенсивности флуоресценции.

5. Применение Stretch и атомно-силовой микроскопии (АСМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги предусмотрены для конкретного АСМ и оптической комбинации микроскопа (рис 4 и список материалов).

  1. Подготовка АСМ для эксперимента.
    1. Увеличение высоты головки AFM, чтобы его максимальное положение в Z-направлении.
    2. Положите удлинители на ногах АСМ вподнять самолет, на котором АСМ консольные контакты образца. Образец и глава АСМ должен быть поднят, чтобы приспособить высоту механического устройства.
  2. Подготовка оптического микроскопа (если имеется).
    1. Снимите АСМ сканера пластину. Удалить желаемой цели.
    2. Добавить прокладку к цели. Высота прокладки будет зависеть от цели и конкретные АСМ настройки, но это необходимо, если визуализация желательно с плоскость наблюдения будет сдвиг в г-направлении на величину, равную высоте носилок и адаптер (рис 5А). Следует отметить, что, как правило, АСМ обеспечивает низкий изображений с увеличением от оптического пути выше устройства.
    3. Установите нужный объективную обратно в его местоположение. Поместите сканер обратно на AFM.
    4. Запустите программное обеспечение АСМ. Начало все необходимые источники света, включая источник света для измерений флуоресценции.
    5. Установите микросхему с консольной балки, чтоподходит для желаемых измерений. 200 PN / нм или менее предпочтительным жесткость при измерении модуля упругости живых клеток.
    6. Совместите лазер и калибровки кантилевера жесткость в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя на покровного стекла, установленного на устройстве.
  3. Подготовка мембраны как на стадии 1, но со следующими модификациями.
    1. Непосредственно перед монтажом мембраны на растяжение в устройстве, сократить стены до примерно 1 мм в высоту. Это предотвращает помехи между испытывали мембранными стенками и тензодатчика.
    2. Установите мембрану от механического устройства, как описано 3.2.1-3.2.3.
    3. Удалить культивирования клеток, чтобы предотвратить повреждение АСМ сканера в случае разлива нефти.
    4. Пара устройство с адаптером (рис 5А). Поместите механическое устройство с адаптером на сканере.
    5. Стретч мембрану до нужного уровня деформации при растяжении.
  4. Нано-отступы растянутых клеток.
    1. Добавить Limited (<0,5 мл) объем средств массовой информации на клетки, чтобы избежать АСМ сканера или повреждения микроскопа из-за разлива нефти.
    2. Включите консольной балки с мембраной.
    3. Следуйте протокол конкретной АСМ устройства для сканирования области, представляющие интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реактивные формы кислорода и деформация

Предыдущие исследования показали, увеличение активных форм кислорода (АФК) в дыхательных путях и альвеолярных эпителиальных клеток в ответ на циклической участке 21. Активные формы кислорода включают молекулы и свободные радикалы, полученные из молекулярного кислорода с высокой реакционной способности липидов, белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот 22-24. АФК служить общей внутриклеточный сигнал для регулирования функ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был разработан уникальный прибор для живого изображения клеток в процессе механического участка; и это устройство используется в протоколе для изучения mechanobiology эпителиальных клеток легких. В предварительных исследований было установлено, что один проведены растяжения стимулировал продукцию митохондриальной супероксид в бронхиальных эпителиальных клетках. Кроме того, было показано, что повышенные уровни механической деформации вызвано прямой ущерб целостности монослоя эпителиальных клеток альвеол.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить что Fedex технологический институт в Университете Мемфиса за их поддержку. Авторы хотели бы поблагодарить студентов старшей группы дизайн-проекта в инженерно-механический факультет в университете Мемфиса (David Butler, Джеки Картера, Доминик Кливленде, Иаков Шаффер), Даниэль Кон из отдела Университета Мемфиса инженерных технологий для управления двигателем , и д-р Бен Дэн и г-жа Charlean Luellen за помощь в клеточной культуре. Эта работа была поддержана K01 HL120912 (ER) и R01 (HL123540 CMW).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SmartMotor NEMA 34: Серия 3400MOOG AnimaticsSM3416DИнтегрированный двигатель, контроллер, усилитель, энкодер и коммуникационная шина
Мембрана Flexcell (покрытие Collagen I)Flexcell International CorpSM2-1010C3,5"  х  5.25"  х  0.020"
Сильгард 184Доу Корнинг Корпорейшн10:1
Хёхст 33342 Sigma-AldrichH1399DAPI морилка
MitoSOXSigma-AldrichM36008
TironSigma-AldrichD7389 метка митохондриального супероксида
Ингибитор супероксидаDMEM
FBS
HEPES
50 мл пробиркиFisher Scientific06-443-19Любая центригуга пробирка может быть использована для создания области для визуализации.
Гибридизационная печьBellco Glass
MLE12 CellsATCCCRL-2110Эпителиальные клетки легких мыши 
16HBE клеткиATCCCRL-2741Бронхиальные эпителиальные клетки
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentationBudget SensorsSi-Ni30
AFM Asylum ResearchMFP3D
Olympus микроскопOlympusIX-71Инвертированный микроскоп с 20-кратным и 40-кратным объективами.
AFM Удлинители ногAsylum ResearchНедоступноAFM микроскоп
Анализ методом конечных элементов
ABAQUSSimulia6.12
Software
ImageJNIH
Microscopes
Digital микроскопLife TechnologiesEVOS XL CoreПервоначально самостоятельная компания, в настоящее время принадлежащая Life Technologies.
Конфокальный микроскопZeissLSM 7102-фотонный вертикальный микроскоп
человека

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mechanical StretchLive Cell ImagingAtomic Force MicroscopyConfocal MicroscopyMouse Lung Epithelial CellsReactive Oxygen SpeciesMitochondrial SuperoxideElastic ModulusNano IndentationCell Actuator

Похожие статьи