Методическая статья

Агарозные микрокамеры для долгосрочного Кальций изображений

10.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52742

⸱

24 июня 2015 г.

 ,  , 
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

В этой статье

Краткое содержание

Визуализация поведения и нейронной активности в длительных временных масштабах без иммобилизации животного является необходимым условием для понимания поведения. Визуализация в микрофлюидных камерах агарозы (AMI) может быть использована для визуализации нейронной активности и поведения на всех этапах жизни Caenorhabditis elegans.

Аннотация

Поведение контролируется нервной системой. Кальций изображений простой метод в прозрачном нематоды Caenorhabditis Элеганс для измерения активности нейронов во время различных поведений. Чтобы сопоставить нейронной активности с поведением, животное не должно быть иммобилизованы, но должны быть в состоянии двигаться. Многие поведенческие изменения происходят во время длительных временных масштабах и требуют записи в течение многих часов поведения. Это также делает необходимым культуры червей в присутствии пищи. Как черви могут быть выращены и их нейронная активность отображены в течение длительного времени масштабах? Агарозном микрокамеры изображений (ОИМ) ранее разработана для культуры и наблюдать мелких личинок, а теперь были адаптированы, чтобы изучить все этапы жизни с раннего L1 до взрослой стадии С. Элеганс. AMI могут быть выполнены на различных этапах жизни С. Элеганс. Долгосрочный изображений кальция достигается без иммобилизации животных при помощи короткого внешне запускаются воздействия комсочетании с электронного умножителя с зарядовой связью записывающего устройства (EMCCD) камеры. Уменьшение масштаба или сканирование можно масштабировать до этого метод изображения до 40 червей параллельно. Таким образом, метод описан в поведении изображения и нейронной активности в течение длительного времени масштабах во всех жизненных этапах С. Элеганс.

Введение

Caenorhabditis elegans был создан в качестве модельной системы для изучения поведения1. Благодаря его податливости к генетике, молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе поведения, могут быть изучены. Многие модели поведения происходят в длительных временных масштабах. Для наблюдения за подвижными животными в длительных временных масштабах можно использовать два основных подхода. Первый подход заключается в следовании за животным во время движения с помощью автоматизированной сцены или камеры2-8, а второй заключается в ограничении движения до расстояния, которое по меньшей мере равно полю зрения камеры9-14. Оба способа имеют свои преимущества. Отслеживание позволяет следовать за животным на больших пространственных расстояниях, но ограничивает количество животных, которые могут быть обнаружены в одном эксперименте. Ограничение передвижения животных позволяет масштабировать наблюдение за многими особями одновременно за счет использования массивов ограниченных отсеков.

Поскольку нематода прозрачна, флуоресцентная визуализация в реальном времени может быть выполнена неинвазивно15. Визуализация кальция обеспечивает функциональное считывание активности возбудимых клеток и установлена для C. elegans16-20. Кальций поступает в клетку через каналы в плазматической мембране, которые открываются при деполяризации. Таким образом, кальций выступает в качестве прокси для нервной активности. Кальциевые сенсоры можно разделить на два основных класса: ратиометрические и нератиометрические датчики. Оба класса используют конформационные изменения кальций-связывающих белков, индуцированные связыванием кальция. Ратиометрические датчики содержат два флуоресцентных белка. Когда флуоресцентный белок с более низкой длиной волны возбуждается, часть световой энергии передается флуоресцентному белку с более высокой длиной волны в зависимости от расстояния между ними в процессе, называемом резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET)21. Нетратиометрические сенсоры основаны на круговой перестановке GFP и используют гашение флуорофора, вызванного связыванием кальция22. Каждый класс имеет свои преимущества. В то время как ратиометрические датчики менее чувствительны к артефактам движения или мимики, нератиометрические датчики обычно имеют более широкий динамический диапазон. Как ратиометрические, так и нератиометрические сенсоры оказались полезными для изучения активности возбудимых клеток у C. elegans16-20,23,24.

При проведении долгосрочной флуоресцентной визуализации экспериментатору придется столкнуться с несколькими потенциальными проблемами: 1. Нарушение поведения из-за возбуждающего света: Черви чувствительны к коротковолновому флуоресцентному возбуждающему свету и избегают света от фиолетового до синего, который используется для визуализации кальция25,26. Черви реагируют либо назад, либо вперед25,26. Таким образом, количество света необходимо контролировать. 2. Обесцвечивание белка флуоресцентного сенсора: Часто обесцвечивание флуоресцентного белка затрудняет долгосрочную визуализацию. Однако, как правило, интенсивность света, необходимая для наблюдения за обесцвечиванием, выше, чем интенсивность света, вызывающая тревожное воздействие на поведение животных. Таким образом, отбеливание является лишь теоретической проблемой в этом типе визуализации кальция. 3. Черви внутри микрокамер не закреплены и постоянно перемещаются во время пробуждения, а изображения могут казаться размытыми, если червь не обездвижен. Все эти проблемы могут быть решены с помощью чрезвычайно короткого времени экспозиции при низкой освещенности. Это может быть реализовано за счет использования высокочувствительной камеры EMCCD с коротким временем экспозиции и внешним срабатыванием светодиода (LED). Чтобы подвергнуть червей воздействию света как можно более короткого времени (только во время экспозиции камеры), светодиод запускается извне с помощью транзисторно-транзисторного логического сигнала (TTL), который камера излучает во время экспозиции, что приводит к свечению червя точно в то время, когда чип камеры экспонируется. Это также означает, что чип EMCCD будет темным во время считывания данных, что является оптимальным для производительности считывания данных этого чипа.

Ранее были разработаны агарозные микрокамеры для долговременной флуоресцентной визуализации личинок C. elegans 9. В статье описывается, как можно использовать агарозные микрокамеры для долговременной визуализации кальция на любой стадии жизни C. elegans, как можно проводить визуализацию кальция и как этот метод может быть масштабирован для параллельного анализа множества отдельных червей.

Протокол

1. Приборы, культура, средства массовой информации, и тарелки

  1. Использование микроскопа, который способен держать образец в фокусе, и который оснащен автоматической стадии. Построить на заказ нагреватель крышки или приобрести коммерческую решение. Настройка LED-EMCCD камеры системы, в которой воздействие на камеру триггеры светодиодной подсветкой через сигнала TTL с помощью инструкции производителя.
    Примечание: См Обсуждение для деталей.
  2. Polydimethylsiloxan (PDMS) марок:
    1. Изготовление печатей PDMS в Microfluidics объекте или имеют PDMS марки, произведенные в коммерческих литейного производства. Чтобы использовать коммерческую литейный, отправьте файл AutoCAD компании и указать глубину (15 мкм, например) устройства. После родов из литейного, вырезать чип PDMS в свои 16 марок с использованием скальпеля.
    2. Облигации индивидуальный штамп в стекле с помощью воздушной плазмы. Для склеивания, выставить как PDMS штамп и предметное стекло для воздушной плазмы длябой 1 мин (при использовании максимальных настроек в плазме на уровне 0,5 мбар). Убедитесь, что поверхности для соединения лицом вверх в течение плазменной обработки. Затем поместите печать PDMS на стекло.
  3. Возьмите 3,5 см нижний блюдо и вырезать квадрат площадью 18 х 18 мм от центра нижней части блюдо с использованием вертикальной фрезерной машины и острые режущие поворотные. Использование низкой скорости вращения фрезы и медленной подачи, чтобы предотвратить плавление пластика из-за тепла, выделяемого при трении. Подготовьте несколько блюд одновременно.
    Примечание: В нижней тарелки можно использовать много раз после эксперимента, если он очищен после замачивания в чистый этанол O / N.
  4. Агарозном:
    1. Растворите 3 г высокой плавления агарозы в 100 мл S-базальных (5,85 г NaCl, 1 г K 2 HPO 4, 6 г KH 2 PO 4, 1 мл холестерина (5 мг / мл в этаноле), H 2 O в 1 л, стерилизовать в автоклаве) при кипячении. Сделать аликвоты растворяли в 2 агарозном мл пробирки Эппендорф и Storе. Кроме того, подготовить партию низкой температурой плавления агарозы в точности так же, как в точке агарозы высокой температурой плавления.
    2. Перед использованием разместить 3 аликвоты с высокой точкой плавления агарозы на нагревательном блоке при 95 - 98 ° С. Перед использованием поместите одну аликвоту точки легкоплавкого агарозы на нагревательном блоке при 95 - 98 ° С до тех пор, пока не расплавится и затем на нагревательном блоке при 30 - 35 ° С.

2. Выбор Животные

  1. Вырастить червей при низкой плотности на сеяных NGM пластин для получения чистых животных. Убедитесь, что есть много еды и только несколько животных на тарелку.
  2. Для изображения L1 личинок, передавать около 30 яиц, содержащих эмбрионы на стадии кренделя на свежий сеяной NGM пластины. Для передачи позже личиночной стадии или взрослых С Элеганс, передать около 30 червей на свежий сеяной NGM пластины.

3. Приготовление агарозных микрокамеры

  1. Подготовка блюдо:
    1. Возьмем пластиковую чашку с квадратным отверстием 18 х 18 мм в нижней части и поместите его вверх дном с отверстием вверх. Закройте отверстие путем размещения кусок двухсторонней клейкой ленты 20 х 20 мм на отверстие. Поверните блюдо вокруг так, что клейкая лента на дне и поставить блюдо на твердую поверхность. Вырезать отверстие бесплатно, используя скальпель.
    2. Использование P1000 пипетки, заполнить 2 мл 3% высокой температурой плавления агарозы в S-базальной на блюдо. Поместите агарозы на область, которая окружает отверстие и пусть затвердевают. Подождите, пока агарозном твердого тела.
    3. Повернитесь блюдо и снимите защитную пленку, которая покрывает двустороннюю клейкую ленту, чтобы липкая сторона будет оставаться на блюдо и будет подвергаться.
      Примечание: В результате тонкой кольцо из клейкой ленты будет окружать наружную поверхность отверстия. Агарозы служит в качестве резервуара влаги, которые затем окружают образец.
  2. Литье микрокамеры:
    1. Expose-йе PDMS поверхности для формования с воздушной плазмы для 20 - 60 сек.
      Примечание: Эта плазменная обработка оказывает PDMS поверхности гидрофильные, который предотвращает перехват воздушных пузырьков и производит резкие отпечатки.
    2. Построить две распорки одинаковой высоты путем укладки 5 - 9 стеклянных слайдов. Место, параллельно с их длинных сторон, в первую прокладку стек, затем один стекло, затем снова стека спейсера. Поместите предметное стекло, содержащее штамп PDMS ортогонально через распорки. Высоту распорок так, чтобы было пространство около 1,5 мм между формующей поверхностью штампа PDMS и стекло одного.
    3. Поместите каплю горячего жидкого точки агарозы тугоплавкого на одном стекле возле PDMS штамп и быстро сдвиньте PDMS штамп вертикально в жидкости агарозы. Пусть агарозном укрепить. Убедитесь, что он получает непрозрачный вид, что, как правило, занимает около 2 мин. Снять печать вертикально одним движением.
      Примечание: Это удобно GLие прокладка скользит вместе с двухсторонней клейкой лентой. Вертикальное перемещение штампа предотвращает пузырьки воздуха из застревать в агарозы.
  3. Передача яйца или червей вместе с OP50 бактерий на агарозы помощью тонкой платиновой проволоки выбор. Распределить одно яйцо или один червь за камере вместе с пищей с помощью глазом. Заполните около 30 яиц на одну агарозном площадку.
  4. Вырезать агарозном плиту, содержащую заполненные микрокамеры в квадрат примерно 15 х 15 мм, так что это вписывается в отверстие в чашке. Возьмите квадратный агарозном плиту с пинцетом и поместить его с ног вниз на стекло покровное 20 х 20 мм. После того, как упал, не поднимайте его снова или сдвиньте его вокруг, потому что это может привести к бактерии и черви будут вытеснены из своих камер.
  5. Ассамблея блюдо:
    1. Поместите покровным стеклом на открытии пластиковую чашку. Осторожно надавите на стекло покровное на кольцо из двухсторонней клейкой ленты.Позаботьтесь, чтобы не разбить стекло.
    2. Поверните блюдо с ног на голову и использовать P1000 пипетки, чтобы заполнить пробел между агар плиты, содержащей микрокамеры и агарозном резервуара с жидким точки агарозы легкоплавкого охлаждают до 30 ° С. Подождите, пока агарозном укрепил.
    3. Печать блюдо с крышкой. Для инвертированных микроскопов использовать с подогревом крышку. Для вертикальных микроскопов использовать обычный крышку и уплотнение блюдо парафильмом.
  6. После окончания подготовки микрокамеры, проверить их под стереомикроскопа. Правильное заполнение имеет решающее значение. Смотрите обсуждение для деталей.

4. Кальций изображений

  1. Используйте трансгенных линий, выражающих генетически закодированные датчики кальция, такие как HBR16 (goeIs5 [pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3'UTR, UNC-119 (+)]) 27.
  2. Используйте сложный микроскоп оборудованная для широкого поля эпифлуоресцентной. Подключите TTL выход EMCCD камеры наTTL вход светодиода, так что каждый раз, камера записывает кадр будет гореть образец. Используйте время экспозиции около 5 мс. Использование EM усиления в диапазоне 50 - 300.
  3. Укажите ход взрыв фильм в течение 24 часов с каждого червя которая отображается каждые 15 - 30 мин сначала на 20 сек с ДВС, то в течение 20 сек с GFP флуоресценции для записи GCaMP, а затем принять окончательное изображение сигнала mKate2 берется контроль за уровнями экспрессии. Использование частоты кадров / сек 2 при каждом пакете.
  4. Для визуального осмотра данных, использовать ложно-цветовую карту, чтобы увеличить видимость небольших изменений в интенсивности флуоресценции. Земля люминесцентные данные, как; F / F, F с того средняя базовая стоимость флуоресценции. Подробное описание анализа данных кальция можно найти в литературе 20.

5. Параллельно АМИ множественных Worms

  1. Поместите блюдо, содержащее микрокамеры на микроскопе, сосредоточить внимание на образец и привлечь autofoКас. Настройка протокола программного обеспечения, так что камера приобретает взрыв 40 кадров изображения в 20 сек каждые полчаса в течение 24 часов, что приведет к 1920 кадров в червя, разумное данных. Настройка сканирования так, чтобы он посещает каждый червь, используя стадию. Цель снимать около 30 червей в одном счете.
  2. Image нескольких червей масштабирования из, т.е., используя нижнюю увеличение. Используйте более низкую увеличение охватывать несколько микрокамеры с чипом камеры и снимать несколько смежных микрокамеры одновременно. После окончания захвата изображения, отделить данные для каждого отдельного камере обрезка область интереса, охватывающего одно животное.
  3. Чтобы быстро оценить данные мобильности, использовать рамки вычитание 28-32.

6. визуализации различных жизненных Этапы С Элеганс

  1. Используйте агарозные микрокамеры для всех стадий жизненного цикла C. Элеганс от L1 до взрослого и в том числе dauers. Используйте соответствующие размеры камеры для дифных этапах жизни, которые показаны в таблице 1.
Сценическую жизнь Размер палата Глубина камеры Типичное время записи Увеличение
L1 190 х 190 мкм 10 - 15 мкм яйцо - середина L2 400X
L2 370 х 370 мкм 15 мкм яйцо - L3 200X
Срок личинка 370 х 370 мкм 25 мкм 4 дня 200X
L3 700 х 700 мкм 45 мкм L2 - L4 200X
L4 700 х 700 мкм 45 мкм Молодой L4 - молодой взрослый 100X
Молодая взрослая 700 х 700 мкм 45 мкм 12 - 24 ч 100X

Таблица 1. Палата размеры для разных этапах жизни. Указаны размеры камеры и увеличениях, которые являются полезными для различных стадий, оптимизированных для 8 х 8 мм чип камеры.

Результаты

Агарозы микрокамеры могут быть применены к любой стадии жизненного С. Элеганс. Как можно видеть на фиг.1А, может наблюдаться развитие личинок и поведение во сне L1 африканский трипаносомоз. Показаны размеры камеры, которые 190 х 190 мкм, 10 мкм глубоко. Если больше шкалы времени, необходимы более крупные камеры могут быть использованы. Как можно видеть на фиг.1В, с использованием камеры с более крупными размерами (370 х 370 мкм, глубиной 25 мкм) позволяет разрабатывать C. Элеганс от яйца до взрослого. Рисунок 1С показывает анализ долгосрочных изменений в поведении с использованием кадров вычитание червя не выросли в камере с яйцом до взрослого. Показаны средние интенсивности после вычитания кадра для выбранных очередей во время после и африканский трипаносомоз. Ниже среднего значения интенсивности после вычитания кадра, меньше подвижность червя. Показано выбраны серийной следы из одного состояния бодрствования и один африканский трипаносомоз состоянии на личиночной стадии.наблюдаемое увеличение средней интенсивности в процессе разработки, в основном из-за увеличения контраста и размера животного. Рисунок 1D показывает Срок личинку, альтернативный этап жизни, который занимается при неблагоприятных условиях окружающей среды 33. Размер палата 370 х 370 мкм, 15 мкм глубоко. Следует отметить, что личинка Срок был помещен в камеру без бактериальной пищи, которая может вызвать выход из Срок личиночной стадии. На рис 1E показан взрослых червей, которые уже заложен много яиц в камеру. Размеры камеры, используемые для взрослых были 700 х 700 мкм, 45 мкм глубоко. Наконец, рис 1F показывает взрослый гермафродита и мужской спаривания внутри взрослого камеры.

Кальций изображений в подвижных червей можно с GCaMP датчиков кальция. 2А, В шоу изображений кальция в командной интернейрона AVA для L1 личинки 27. Цифры 2C, D показывают активность кальция для SAмне тип нейрона в взрослого животного.

Расширение долгосрочного изображений можно путем сканирования и масштабирования из. Рисунок 3A показывает качество изображения одновременной визуализации 30 червей на одном чипе камеры с 5-мегапиксельной камерой. 3В показывает качество изображения 4 червей кальция отображаемого одновременно.

figure-results-1
Рисунок 1. Адаптация AMI для всех стадий жизненного цикла C. Элеганс. () Личинка не отображены с раннего L1 до L2 ранней стадии в 190 х 190 мкм камер. (Б) разработка от яйца до взрослого в 370 х 370 мкм камеры. (С) Подвижность червя оценивается с помощью вычитания кадра. Показана средняя интенсивность всех фотографий изображения после вычитания кадра для одной выбранной серийной кино для каждого личиночной ГНАGE для после и африканский трипаносомоз поведения. (D) Срок личинка в отсутствие пищи в камере мкм 370 х 370. (Е) для взрослых гермафродитом со многими яиц в 700 х 700 мкм камеры. (F), Спаривание самца и гермафродит внутри 700 х 700 мкм камеры. Ю.А. означает молодых взрослых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Кальций изображений с ОИМ. () Кальций изображений с GCaMP3 в командной интернейрона AVA из L1 личинок с помощью ЯМР-1 промотор. Показаны два ложных цветных изображений. В левом изображении, деятельность AVA низкий и червь не делает обратную движению. В правом изображении деятельность AVA является высокий, и червь движется в обратном направлении. переходные (Б) Кальций в течение долгого времени для червя L1. (С, D) переходные кальция у взрослого животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. визуализации нескольких червей параллельно увеличить масштаб. (A) Одновременное изображений 30 L1 червей в кадре с использованием 190 х 190 мкм камеры и увеличение 100X (с использованием цели 10X) и 16,6 х 14 мм чип камеры. (Б) Одновременная визуализация четырех L3 червей в кадре с использованием 370 х 370 мкм камер и 100-кратном увеличении и область интереса 16,6 х 14 мм чип камеры.ET = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Аппаратный

Фокус микроскопа обычно дрейфуют во время длительного получения изображения. Для составных микроскопов, сосредоточиться поддержанию системы можно приобрести у крупных производителей микроскопов. В случае соединения микроскоп с регулировки фокуса слишком дорогой, простой альтернативы можно было бы использовать стереомикроскопа. Составные микроскопы позволяют использовать объективы с высокой числовой апертуры (NA), и может быть легко автоматизирован. Нефть цели 40X хорошо подходят. Погружение в воду линзы не идеально, потому что испарения при длительном изображений. Дифференциальный интерференционный контраст (DIC) генерирует хороший контраст, который помогает следить морфологические и поведенческие изменения, но простой визуализации светлое поле также может быть использован. Для DIC или изображений светлое поле, использовать красный свет, поместив красный светофильтр на пути диа-освещения микроскопа. Для сканирования нескольких микрокамеры автоматизированная этап необходим. Лучший производительность переменного токаhieved, когда ступень используется, что имеет нелинейную ускорение и замедление, и может быть установлен на малой скорости сканирования для предотвращения нарушения животных во время сканирования. Мы не наблюдали поведенческие реакции или увеличение кальция в нейронах механочувствительных (ALM и PLM) во время сканирования, предполагая, что медленное сканирование действительно не активировать систему механочувствительных червя (данные не показаны). Коммерческие Светодиодные системы могут быть использованы. Несколько компаний предлагают готовые к использованию решения, которые включают светодиоды на различных длинах волн. Светодиод должен иметь возможность запуска внешних светодиода с сигналом TTL. Высокочувствительный камеры необходим для визуализации кальция перемещения животных. EMCCD камеры являются наиболее чувствительными камерами на рынке. Камера должна иметь выход TTL во время экспозиции (также называется "огонь" выход). Крышка нагреватель для предотвращения образования конденсата на крышке, если с помощью инвертированного микроскопа. На прямой микроскоп, антенна будет располагаться так, чтобы крышка Wiбудете на дне и таким образом предотвращается конденсация и без крышки нагрева не требуется. Крышка должна плотно закрывать посуду, чтобы предотвратить испарение воды во время длительного изображений.

PDMS марки

Поверхность PDMS штамп, который содержит структуру для формования агарозы сталкивается от стекле, которая поддерживает печать PDMS. Список с компаниями, которые предлагают на заказ микрожидкостных чипы можно найти в Википедии ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).

Заполнение нематод в их камерах

Это самый важный шаг в протоколе, и следующие пункты должны быть рассмотрены:) влажность агарозы имеет решающее значение для передачи червей и визуализации. Если агарозном слишком высокое содержание влаги, то есть, есть жидкость COVтч площадь в несколько микрокамеры, он не будет возможным распределить бактериальной пищи и червей контролируемым образом потому, что жидкость будет сделать бактерии утекают. Если агарозном слишком сухой, то бактерии и черви не могут получить от выбор легко, что означает, что увеличение силы должны быть использованы для падения червей и бактерий, которые легко приводит к повреждению агарозы. При заполнении много червей агарозы может высохнуть. В худшем случае агарозы будет настолько сухой, в конце концов, что камеры рухнет. Если агарозном слишком сухой он может быть регидратации, помещая маленькую каплю (приблизительно 2 мкл) S-базальной на стороне чипа, где нет никаких червей. Затем опустите платиновой проволоки забрать в жидкость и даже тянуть некоторые из жидкости в районе, где камеры, наполненной червями. Б) количество пищи имеет решающее значение для успешного долгосрочного изображений. Если не хватает еды, черви могут бежать из него. При наличии чрезмерного пищи полость камерыне будет вести себя как жидкость, а как твердое и позволит избежать черви из камеры отталкиваясь бактерии. Стремитесь получить бактериальную суспензию, которая заполняет всю камеру. Черви находятся в постоянном физическом контакте с поверхностью агара и стекла вдоль большей части своей длины во время эксперимента, и появляется ползет поведение, чтобы быть похожими на движения на тарелку и отличается от обмолота в жидкости. С) Механические повреждения агарозы может разрушить эксперимент. В порядке выбор имеет важное значение. Она не должна иметь острых углов. Мягкая ресниц прикреплены к концом пипетки может быть использован для перемещения бактерий или глистов в камеры вместо использованием платинового выбор. В большинстве случаев, однако, пересушенной агарозы является причиной повреждения. Выбор или ресниц, в идеале, только едва касаться самой агарозы, и водяной пленки на поверхности агарозном должны снять червей и бактерий. При герметизации камер, опять же, влага из агарозы имеет важное значение. Там не должнобыть свободной жидкости на поверхности агарозном потому что это может смыть бактерии и черви во время герметизации. Большие пузыри могут быть удалены путем осторожного подъема угол агара плиты. Мелкие пузырьки, которые меньше, чем камеры часто получают в ловушке внутри камер. Эти пузырьки не проблема, и исчезнет поглощения. После сборки блюдо, проверьте еще раз, что в агарозном не слишком сухой или слишком влажный. Камеры должны быть хорошо запечатаны и не должно быть любой поток жидкости между камерами. Если агарозном слишком влажная, камеры не будет запечатать должным образом. Черви могут убежать или их пища будет смыта. Если образец слишком влажный, просто откройте крышку и дайте высохнуть агарозы на минуту или две. Если агарозном слишком сухой, камеры могут рухнуть и черви избежать.

Расширение путем увеличения из

Для флуоресценции, масштабирование из ограничивается низким количеством света, полученного при более низких увеличениях. Кроме того, EКамеры MCCD оптимизированы для чувствительности и часто имеют относительно низкое разрешение. Тем не менее, расширения изображения в четыре раза можно хорошо. Например, четыре камеры 190 мкм х 190 мкм может поместиться на одном кадре при использовании 140x увеличение (достигнутый с помощью 20х объектива и камеры 0,7Х монтирования) и 512 х 512 пикселей, 8 х 8 мм камеры. Камера высокого разрешения с большим чипом (например, камер sCMOS, 16,6 мм х 14 мм чипа, 2560 х 2560 пикселей = 5,5 мегапикселя) оптимизирует расширения ДВС и визуализации ярко поля. Например, до 30 L1 червей в 190 мкм х 190 мкм камеры можно установить на каждом кадре этой камеры при использовании 100-кратном увеличении (рисунок 3). В принципе, увеличения и уменьшения масштаба сканирования также могут быть объединены, чтобы получить даже большее число животных. Большинство нейронов остаться хорошо в центре внимания, так что только один фокальной плоскости должен быть образ. Если нейроны находятся выйти из фокуса, AZ сканирование, используя пьезоприводу могут быть приняты в каждый момент времени рoint.

Адаптация к разным поведением

Этот протокол дает хорошее представление о поведении всей больших временных масштабах. Очевидно, что выбор времени всплесков должна быть адаптирована к различным поведения и жизненных этапах.

Ограничения метода

Несколько факторов ограничивают продолжительность визуализации. Наиболее важным является количество пищи. После того, как пища потребляется, личинки прекратить разработку. Таким образом, в небольших камерах черви (190 х 190 мкм) не развиваются до стадии L3, а затем арестовать. Если требуется более длительное время формирования изображения, большие камеры должны быть использованы. Максимальная продолжительность долгосрочного изображений находится в диапазоне 2,5 - 3 дня. Если больше изображений требуется, черви должны быть восстановлены и помещены в новые помещения. При визуализации взрослых червей, одно ограничение обусловлено потомства этих червей. Взрослые черви откладывают яйца, из которых отрождаются. Эти личинки также останется в камере, Потребляют пищу, и может нарушить анализа изображения. Если потомство проблема, решение либо использовать стерильные взрослых или повторно поместить червей в свежих камер. Чтобы восстановить червей, агарозы плиты, содержащий камеру режется бесплатно с помощью скальпеля, снимается покровное, и находится на качестве NGM пластины, из которой черви могут быть восстановлены. Другой предел ограничение червей в относительно небольших районах. Это может быть проблемой, если движение дальнего необходимо проанализировать. В то время как животные в камерах можно стимулировать механически и optogenetically 21,27,34,35, запечатаны характер камере будет трудно применять растворимые или летучие стимуляторов. Биологически важных газов, таких как кислород или двуокись углерода может свободно диффундировать в агар. Значительный резервуар воздуха в чашке должен поддерживать концентрации газов в камерах постоянной в течение времени, необходимого для экспериментов. Тем не менее, следует иметь в виду, что местное concentratio кислородап в камере может больше напоминают условия, найденные в жидкой культуре, чем культуры на тарелку.

Значение по отношению к существующими методами

Микрофлюидных устройства значительно продвинулись поведенческие и развития учился в С. Элеганс. Часто микрофлюидальные конструкции выполнены из ПДМС 12. Здесь мы опишем протокол для генерации микрожидкостных культуры камеры, сделанные из агарозы. Сила этого метода является сочетание высокого качества изображения, корреляция поведения с физиологическими измерений, долгосрочного изображений, и достаточно высокой пропускной способностью. Высокое качество изображения достигается за счет визуализации через покровного стекла с использованием высоких целей Н.А.. В результате флуоресценции изображений, таких как изображения кальция и конфокальной микроскопии субклеточных структур может быть выполнено. Потому что животные не заблокирован, как и в других системах, что позволяет корреляцию поведения с физиологическими измерений. БекAUSE животные имеют обильную пищу, они продолжают развивать позволяет долгосрочное изображений. Эта система может изображение много червей в одном счете, потому что животные ограничены их определенных камер. Таким образом, этот метод может быть легко масштабируется до 9,27,34-36.

Будущие приложения

Пока эта система была использована в основном для изучения поведения сна в С. Элеганс L1 личинок. Тем не менее, адаптация к всех этапах позволит изучить широкий спектр поведения и в dauers и взрослых. Широкий спектр поведений могут быть изучены с этой техникой, начиная от спаривания с откладки яиц.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Общество Макса Планка и стипендия Гёттинген Высшая школа младшая группа для HB профинансировал эту работу.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Высокая температура плавления агарозыFisher БиореагентыBP(E)164-1000
Top Vision низкая температура плавления АгарозаThermo ScientificR0801
Светодиодная системаCoolLEDpE-2
Составной микроскопNikonTiE
СтереомикроскопLeicaM5
EMCCD камераAndoriXon 897теперь продается как iXon Ultra 897
sCMOS камераAndorNeo
Очиститель плазмыHarrickPDC-23G2
Нагреватель крышкиMPI мастерскаяна заказ
Пластиковая тарелкаFalcon08-757-100A
Z-stage для микроскопаPriorNano Scan Z
X-Y столик для микроскопPriorProscan III
PDMS штампAbbott Laboratoriesизготовленный на заказ
фильтр красного светаChromaET660/50m
35 мм чашка ПетриFalconFalcon Одноразовые чашки Петри, стерильные, Corning
Двусторонняя клейкая лентаSellotape/Henkelдвусторонняя 25 мм x 33 мв качестве альтернативы можно использовать передовую двустороннюю липкую ленту от Rubance Adhesives.

Ссылки

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  3. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
  4. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094(2012).
  5. Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
  6. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in. C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208(2008).
  8. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
  9. Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
  10. Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
  11. Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
  12. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
  13. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
  14. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  17. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  18. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
  19. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  20. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  21. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  23. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198(2008).
  26. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  27. Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
  28. Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
  29. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  30. Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
  31. Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
  32. Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782(2013).
  33. Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
  34. Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
  35. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
  36. Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853(2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

C elegansEMCCD
Агарозные микрокамеры для долгосрочного Кальций изображений
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.