Мы описываем здесь простой протокол выделения перитонеальных макрофагов мышей. За этой процедурой следует экстракция РНК для проведения анализа экспрессии генов при стимуляции Toll-подобных рецепторов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение перитонеальных макрофагов Carry Out Gene Expression анализ По Toll-подобные рецепторы стимуляции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Во-инфекции и воспаления, циркулирующих моноцитов оставить кровоток и мигрируют в ткани, где они дифференцируются в макрофаги. Макрофаги экспрессируют поверхностные Toll-подобные рецепторы (TLR,), которые распознают консервативные молекулярные модели в процессе эволюции в широком диапазоне микроорганизмов. TLRs играть центральную роль в активации макрофагов, которые, как правило, связанные с изменением экспрессии генов. Макрофаги имеют решающее значение при многих заболеваниях и появились как привлекательных объектов для терапии. В следующем протоколе мы опишем процедуру, чтобы изолировать перитонеальных макрофагов с помощью тиогликолята среду пивные. Последнее будет стимулировать миграцию моноцитов в брюшину, соответственно это повысит макрофагов выход 10-кратным. Несколько исследований было проведено с использованием костного мозга, селезенки или перитонеальные макрофаги происходит. Тем не менее, перитонеальные макрофаги было показано, что более зрелые при отрыве и более стабильны по своим функциональнымность и фенотип. Таким образом, макрофаги, выделенные из мышиного брюшную полость представить важную клеточной популяции, которые могут служить в различных иммунологических и метаболических исследований. После выделения макрофаги стимулировали различными лигандами TLR и, следовательно, экспрессии генов оценивали.
Введение
Ретикулоэндотелиальной фагоцитарной система состоит из клеток различных тканей и органов, таких как костный мозг, кровь, печень и селезенка. Макрофаги широко распространены по всему телу, где они особенно участие в врожденного и адаптивного иммунного ответа для управления и ясные инфекции. В дополнение к их роли в защите организма, макрофаги, также играют важную роль в заживлении ран и в поддержании гомеостаза тканей 1,2. Кроме того, макрофаги важны не только для иммунной функции, но также активно участвовать в гомеостазе железа 3. В организме, примерно 80% железа присутствует в гемоглобина в эритроцитах, что при стареющей фагоцитированы макрофагов 4. Ежедневно эти макрофаги перерабатывать 25 мг эритроцитов, полученных железа и обеспечить его транспортировку в плазме 5. Кроме того, во время инфекции и воспаления, провоспалительных макрофагов секвестр сывороточного железа восстановления железа Доступностти к патогенам, как на системных и местных уровнях 6-8. Кроме того, исследования показали, что макрофаги и главным гепатоциты производят антимикробного пептида по имени гепсидин, что считается главный регулятор метаболизма железа 9, 10. Гепцидин в основном увеличился на воспалительные стимулы и частично отвечает за поглощения железа в макрофагах при хроническом воспалении 11-13. Как гепсидин выражение в макрофагах не очень хорошо понял, мы изучали возможную роль Toll-подобные рецепторы (TLR,) в этом регулировании. В первую очередь TLRs найти на макрофагах и играют центральную роль в их активации. Кроме того, ЛПС индуцированных гепсидин выражение в печени зависит от TLR4 13. Поэтому, чтобы выполнить наше исследование, мы использовали метод, основанный на выделении мышиных перитонеальных макрофагов.
Линии макрофагов клеток широко используются в макрофагов шпильких годов; тем не менее, расширенная культура может спровоцировать потерю гена и снижением иммунных функций в этих клеточных линий. Таким образом, выделение макрофагами брюшную полость имеет решающее значение.
Мышь брюшной полости представляет собой идеальное место, чтобы урожай макрофаги 13-15. Изолированные мышиные перитонеальные макрофаги удобны в течение нескольких исследований, касающихся их иммунологической функции. Тем не менее, количество макрофагов в брюшной полости недостаточно для обширных исследований и, по оценкам около 1 × 10 6 на мышь макрофаги. Таким образом, чтобы повысить выход макрофагов, стерильный вызывая агент, такой как тиогликолята вводили в брюшную полость, предшествующий урожай клеток. После инъекции тиогликолята, выход макрофагов на мышь была увеличена в 10 раз. Несмотря на увеличение урожайности, макрофагов тиогликолята среднего актов пивные как раздражитель, который вызывает воспалительную реакцию, в результате найма макрофагов, которые мау, но не нужно влиять на экспрессию генов. Следовательно, контрольная группа, состоящая из необработанными макрофагами должны быть включены в каждом эксперименте. В наших руках, гепсидин выражение, которое высоко стимулируется воспаления не был обнаружен в необработанной тиогликолята вызвало перитонеальные макрофаги. Кроме того, исследования показали, что тиогликолята Пивные новобранцев многочисленные макрофаги, но не активирует их 16. С другой стороны, тиогликолевой Пивные вызвало макрофаги показали увеличение фермента лизосом, а снижение убивает микроорганизмы проглатывании 17. Тем не менее, фагоцитарная способность не влияет, по сравнению с не-макрофагов вызвало 16.
После культивируют в чашках, в перитонеальные макрофаги становятся присоединенными, тем самым возможность их отделения от других типов клеток, выделенных из брюшной полости. Впоследствии, выделенных макрофагах заражали различными агонистами TLR,.Наконец, мРНК экстрагировали из культивированных клеток и экспрессии генов был проанализирован с использованием количественной обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (QRT-PCR).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были выполнены в соответствии с Канадским советом по принципов ухода за животными после утверждения Уходу за животными комитета Центр по исследованиям дю Клинический центр де l'Университета Монреаля (CRCHUM) по.
1. Выделение, идентификация и культура перитонеальных макрофагов
- Подготовка тиогликолята среду 3,8% пивных. Чтобы сделать это, приостановить 38 г тиогликолевой среды в 1000 мл дистиллированной воды. Принесите решение кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при 121 ° С в течение 15 мин. Храните до 3 месяцев в темноте, при комнатной температуре 18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Откажитесь, если мутность развивается что указывает на бактериальное загрязнение. Решение может быть до одного года в темноте при хранении стерильной. - Используя 1 мл шприцы, прикрепленные к 23 г игл, вводят 1 мл 3,8% Brewer тиогликолевой среды в брюшную полость каждой муSE и ждать в течение 3 дней. Используйте новый шприц и иглу для каждой мыши.
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (100 мг / кг) и эвтаназии мышей путем смещени шейных позвонков. Подтвердите правильное обезболивания путем проверки дыхания. Обычно быстрые дыханий показывают, что мышь не глубоко под наркозом.
- Вымойте брюшко каждой мыши с 70% этанола. Использование ножниц, выполнить боковой разрез вдоль нижней средней линии брюшины.
- Использование щипцов, потяните кожу с живота на подвергать прозрачную перитонеальный кожу. С использованием 5 мл шприцы, прикрепленные к 20 г игл, вводят 5 мл холодного DPBS в брюшную полость каждой мыши.
- Выполните легкий массаж на брюшную полость, а затем аспирации жидкости тщательно, не прокалывая любой орган. Извлеките иглу и дозировать перитонеальной жидкости в 50 мл конических центрифужных пробирках.
- Центрифуга в течение 10 мин при 400 х г в охлаждаемой центрифуге.Клетки должны оставаться холодной в течение всей процедуры. Удалите супернатант и осадок ресуспендируют клеток в RPMI среде 1640.
- С помощью гемоцитометра, рассчитывать клеток и приспособиться к плотности клеток 1 × 10 6 клеток / мл.
- Определение характеристик фенотипа отдельных клеток методом проточной цитометрии с использованием 1 × 10 6 клеток на мышь и antibodie против F4 / 80 (поверхностный антиген экспрессируется на макрофагах).
2. Сотовые Лечение
- Непосредственно после изоляции, добавить 1 × 10 6 клеток в каждую лунку. Оставьте перитонеальных макрофагов придерживаться в 6-луночных планшетах с культивированием их в течение от 1 до 2 ч при 37 ° С. Удалить неприкрепленных клеток осторожно промывки 3 раза теплой PBS.
- Впоследствии, культуры клеток в 900 мкл бессывороточной DMEM в течение 24 ч в присутствии следующих лигандов TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 мг / мл) поли (I: С) -TLR3 (10 мг / мл) ; ЛПС-TLR4 (100 нг / мл); Флагеллин-TLR5 (100 нг / мл); FSL1-TLR6 / 2 (100 нг / мл); ssRNA40-TLR7 (1 мкг / мл); ODN1826-TLR9 (1 мкМ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка к каждой лиганда 10x исходного раствора. Добавить 100 мкл последнего в каждую лунку, выполняя таким образом разведение в 10 раз.
3. Выделение РНК
- Удалить все средние и лизировать клетки непосредственно в шесть-луночных планшетах в добавлением 1 мл TRIzol в каждую лунку и прохождение клеточного лизата несколько раз через пипетку. Инкубируйте гомогенизированные образцы в течение 5 до 10 минут при комнатной температуре, чтобы позволить полной диссоциации комплексов нуклеопротеидных.
- Перевести лизат в 1,5 мл RNase- и ДНКазы свободный микроцентрифужные трубки. Добавить 0,2 мл хлороформа за 1мл TRIzol. Встряхнуть трубки энергично вручную в течение 15 секунд и инкубируют их при комнатной температуре в течение 5 до 10 мин. Центрифуга при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Соблюдайте смесь, отделяющую в нижней красной фазы (фенол-хлороформ), межфазного и бесцветной верхней водной фазы. РНК остается исключительно в водной фазе.
- TranSFER тщательно верхнюю водную фазу в чистую пробирку, не нарушая интерфазу. Осадок РНК из нее путем смешивания с 0,5 мл изопропилового спирта. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугируют при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. РНК осадки образуя белый осадок на стороне и нижней части трубы.
- Удалить супернатант. Промыть осадок РНК один раз 1 мл 75% этанола. Смешайте образцы на вортексе и центрифугируют при 7500 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Кратко сухой РНК (воздух сухой в течение 10 мин). Растворите РНК в 0,1 мл DEPC (РНКазы воды) и инкубируют в течение 10 мин при 55 ° С.
- Количественно РНК с использованием спектрофотометра. Чтобы сделать это, разбавить образцы 100 раз в DEPC воды и читать на длинах волн 260 нм. Концентрация РНК затем будет: OD 260 х 40 нг / мкл х коэффициент разбавления.
- Выровнять концентрации РНК и синтеза кДНК в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием ОТ-ПЦР системы для первой цепи кДНК синтеза Kit. Какв соответствии с инструкциями изготовителя, измерения уровней мРНК гена от ПЦР в реальном времени (45 циклов) в режиме реального времени система обнаружения ДНК. Нормализовать уровень экспрессии генов с геном двух домашнего хозяйства например β-актина и GAPDH.
Примечание: нормализовать концентрацию РНК 500 мкг / мл и 0,5 мкг использовать для синтеза кДНК.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сначала характеризуется изолированные перитонеальных макрофагов с помощью проточной цитометрии. Чтобы сделать это, мы использовали (F4 / 80) антитела, которые специфически распознают маркеры только выраженные макрофагов. Эта характеристика необходима, чтобы определить процент изолированной макрофагов и отличать их среди клеток, полученных в процессе выделения. Как показано в (фиг.1), процент клеток, экспрессирующих антиген F4 / 80 последовательно найдено быть выше 95%. Далее, для изучения экспрессии ген...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Макрофаги имеют решающее значение для выживания и обеспечить заманчивой целью манипулировать хост для иммунологических целей. Открытие TLRs и других молекул распознавания провели макрофаги к центру иммунологической дискуссии. Макрофаги отвечают на множество стимулов, в том числе цитокинов, ассоциированных повреждений молекул молекулярных рисунок (DAMPS) 20 и молекул, ассоциированных с группами патогенов (PAMPs) 21. Эти различные ответы стимулы представляют собой курс макрофагов активации и, как пра...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (NSERC, не дают никаких 298515-2011). Л. является получателем к.т.н. Стипендия от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (NSERC), и MS была поддержана грантом от от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, грант №. MOP123246).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 мышей | Charles River Laboratories, Inc. (Уилмингтон, Массачусетс, США) | 475 | |
| Тиогликоллат | Сигма-Олдрич, (Сент-Луис, Миссури) | 19032-500G | |
| 70% этанол | |||
| 10% пентобарбитал натрия (используется для анестезии мышей (80 мг/кг, внутривенно)) | |||
| Дульбекко s фосфатно-солевой буфер (DPBS), помещенный на лед и служащий для сбора макрофагов | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Добавка с пенициллином, стрептомицином, L-глютамином и 10 % сывороткой плода телят). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 и 5 мл шприцы | BD США (NJ) | 309659 | |
| 6-луночные планшеты | Corning Incorporated (NY, США) | MCT-150-C | |
| Бактериальный липопротеин Pam3CSK4 (0,5 мг/мл) | InvivoGen (San Diego, США) | TLRL-pm25 | |
| Полиионозин– полицитидиловая кислота (Poly(I:C)) (10 мг/мл) | InvivoGen (Сан-Диего, США) | TLRL-PIC | |
| LPS из Escherichia coli 055:B5 (100 нг/мл) | InvivoGen (Сан-Диего, США) | L2880 | |
| Очищенный флагеллин из Salmonella typhimurium (100 нг/мл) | InvivoGen (Сан-Диего, США) | TLR-FLIC-10 | |
| Липопротеин синтетический FSL1 (100 нг/мл) | InvivoGen (Сан-Диего, США) | TLR-FSL | |
| ssRNA, полученная из длинноконцевого повтора ВИЧ-1 ssRNA40 (1 μ г/мл) | InvivoGen (Сан-Диего, США) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG олигонуклеотид ODN1826 (1 μ M) | InvivoGen (Сан-Диего, США) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Берлингтон, Онтарио, Канада) | 15596-026 | |
| Иглы 20 G и 23 G | BD США (NJ) | 305175 | |
| Ножничные | |||
| щипцы | |||
| 50 мл конические трубки, помещенные на лед | Sarstedt (Ньютон, Массачусетс, США) | 62.547.205 | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | Sigma-Aldrich, (Сент-Луис, Миссури) | R7757-100ML | |
| Охлаждаемая центрифуга | |||
| Гемоцитометр | |||
| F4/80 антитела | BIO-RAD ( CA, | )MCA497APC | |
| антитела CD16/CD32 | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Проточный цитометр | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL, США) | ||
| 1,5 мл Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA, США) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Канада) | UN1888 | |
| Изопропиловый спирт | JT Baker (PA, США) | 70566 | |
| 75% этанол (в воде, обработанной DEPC) | Коммерческие алкогольные напитки (QC, Канада) | 17394 | |
| 0,01% диэтилпирокарбонат (DEPC) обработанная вода (оставить на ночь и автоклав) | Sigma-Aldrich, (Сент-Луис, Миссури) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Миссиссога, Онтарио, Канада) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR наборы | Qiagen, (Миссиссога, Онтарио, Канада) | 204141 |
Ссылки
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
