Методическая статья

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52771

⸱

29 апреля 2015 г.

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем методы визуализации всего животного и проточной цитометрии для мониторинга экспансии антиген-специфичных CD8+ Т-клеток в ответ на иммунизацию наночастицами в мышиной модели вакцинации.

Аннотация

Традиционные вакцинные адъюванты, такие как квасцы, вызывают неоптимальный ответ CD8+ Т-клеток. Для решения этой серьезной проблемы в разработке вакцин были разработаны различные системы наночастиц, имитирующие особенности патогенов, чтобы улучшить доставку антигена к дренажным лимфатическим узлам и увеличить поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, что привело к созданию новых вакцинных составов, оптимизированных для индукции антиген-специфических ответов CD8+ Т-клеток. В данной статье мы описываем синтез «имитирующей патогены» системы наночастиц, называемой интербислойно-сшитыми многослойными везикулами (ICMV), которые могут служить эффективным носителем вакцины для совместной доставки субъединичных антигенов и иммуностимулирующих агентов и вызывания мощных цитотоксических ответов CD8+ Т-лимфоцитов (CTL). Описаны методы определения гидродинамического размера и поверхностного заряда наночастиц вакцины с помощью динамического рассеяния света и анализатора дзета-потенциала, а также представлена процедура на основе конфокальной микроскопии для анализа доставки антигена, опосредованного наночастицами, к дренирующим лимфатическим узлам. Кроме того, мы демонстрируем новую биолюминесцентную технику визуализации целых животных с использованием адоптивного переноса экспрессирующих люциферазу антиген-специфических CD8+ Т-клеток мышам-реципиентам с последующей вакцинацией наночастицами, что позволяет проводить неинвазивные исследования моделей экспансии и транспортировки CTL в режиме реального времени. Описаны тетрамерное окрашивание и проточный цитометрический анализ мононуклеарных клеток периферической крови для лонгитюдной количественной оценки эндогенных Т-клеточных реакций у мышей, вакцинированных наночастицами.

Введение

Традиционные развития вакцины в основном использовали эмпирический подход опытной и ошибок. Тем не менее, с недавним развитием широкого спектра биоматериалов и открытий молекулярных детерминант иммунной активации, теперь можно рационально спроектировать вакцинных препаратов с биофизических и биохимических сигналов, полученных от патогенов 1,2. В частности, различные частицы платформы доставки лекарств были рассмотрены в качестве носителей вакцинных как они могут быть совместно с грузом субъединиц антигенов и иммуностимулирующих агентов, защищать компоненты вакцины от деградации и повышения их сотрудничество доставку антиген-представляющие клетки (АРС), проживающих в лимфе узлы (LNS), таким образом, максимально иммунную стимуляцию и активацию 3-5. В этом докладе мы описываем синтез "патогенных имитируя" системы наночастиц, называемые interbilayer сшитого многослойные везикулы (ICMVs), которые ранее были продемонстрированы как мощное platfor вакциным для надежных процессе индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и гуморального иммунного ответа в обоих системных и слизистых тканей отсеков 6-9. В частности, вакцинация ICMVs достигается существенно повысить уровень IgG в сыворотке против малярийного антигена, по сравнению с вакцинацией с обычными вспомогательными веществами (например, квасцы и Montanide) 7, а также вызвало мощные ответов CTL против опухолевых клеток и вирусных моделей призов у мышей 9. Здесь, используя ICMVs как система наночастиц модель вакцины, мы опишем методы для характеризации нано-вакцин составов, в том числе размера частиц и дзета-потенциал измерений и отслеживания оборота частицы в дренирующих лимфоузлов (dLNs) с использованием конфокальной микроскопии в тканях cryosectioned 7. Кроме того, мы представляем весь животного изображений на основе метода анализа расширение ответов CTL у мышей после усыновителя передачи люциферазы выражения антиген-специфических CD8 + Т-клеток 9,10. Наконец, мы деписец тетрамер окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для продольной количественного эндогенных ответов Т-клеток у мышей, вакцинированных с наночастицами 6,9.

ICMVs являются липидов на основе наночастиц препарат синтезированы путем регулируемого синтеза простых липосом в многослойных структурах, которые затем химически стабилизированных сшивающих головных групп фосфолипидов малеимид-функционализированного в липидных слоев с дитиольному сшивающих агентов 6. После ICMVs синтезируются, небольшая часть наночастиц может быть использовано для определения размера частиц и дзета-потенциал (т.е. поверхностный заряд частиц) с (DLS) системы динамического светорассеяния и дзета-потенциал анализатора. DLS измеряет изменения в рассеянии света в суспензии частиц, что позволяет определение коэффициента диффузии и гидродинамического размера частиц 11. Достижение последовательной размер частиц от партии к партии синтеза является критическимс размером частиц является одним из основных факторов, влияющих на лимфатический дренаж частиц вакцины в dLNs и последующего клеточного поглощения БТР 12,13. Кроме того, дзета-потенциал может быть получен путем измерения скорости частиц, когда электрический ток подводится, которая позволяет определять электрофоретической подвижности частиц и поверхности частиц заряда 11. Обеспечение последовательного дзета-потенциал значения частиц является важным, поскольку поверхностный заряд частиц определяет стабильность коллоидного, который имеет непосредственное влияние на дисперсию частиц во время хранения и после введения в естественных условиях 14,15. Для того, чтобы отслеживать локализацию частиц в dLNs, ICMVs могут быть помечены с заданными флуорофорами в том числе липофильных красителей и ковалентно-меченых антигенов. После иммунизации мышей может быть умерщвлены в различные моменты времени, dLNs резекции, cryosectioned и анализировали с конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать лимфатической DraIНин обоих перевозчиков и антигена dLNs вакцин наночастиц. Разделы ткани могут быть дополнительно окрашены флуоресцентной меченых антител и используется для получения более подробной информации, такие как типы клеток, связанных с антигеном и формирования зародышевых центров, как мы показали, ранее 7.

После синтеза частиц оптимизирован и торговля в dLNs подтвердится, это очень важно для проверки выявление в в естественных условиях расширения CTL. Для того чтобы проанализировать извлечение антиген-специфических CD8 + Т-клеток в ответ на вакцинацию наночастиц, мы использовали модели антиген, овальбумин (OVA), с OVA 257-264 пептида (SIINFEKL) иммунодоминантном CD8 + Т-клеточного эпитопа, который позволяет детально иммунологические анализы антиген-специфических ответов Т-клеток для первоначального 16,17 разработки вакцины. В частности, допрашивать динамику расширения и миграции антиген-специфических CD8 + Т-клеток, мы сформировалидважды трансгенной мышиной модели, пересекая люциферазы светляков-выражения трансгенных мышей (Luc) с OT-I у трансгенных мышей, которые обладают CD8 + Т-клеток с Т-клеточного рецептора (TCR), специфичные для SIINFEKL (в связи с Н-2К б). Из этих мышей ОТ-I / Luc, экспрессирующих люциферазы, ОТ-я CD8 + Т-клетки могут быть выделены и подготовлены для передачи в приемной наивных мышей C57BL / 6. После семенами, успешное иммунизация OVA-наночастиц приведет к расширению переданных Т-клеток, которые можно отслеживать с помощью мониторинга сигнал биолюминесценции с всей системы формирования изображений животных 9,10. Это неинвазивный метод визуализации всего тела был использован с другими вирусными или опухолевых антигенов в прошлом 18-20, выявление процессов, участвующих в разложении Т клеток в лимфоидных тканей и распространения в периферических тканях в продольном образом.

В дополнение к анализу адаптивно переданных антиген-специфических CD8 + Т-клеток, endogenoСША T-клеточные ответы после вакцинации могут быть рассмотрены с пептидом главного комплекса гистосовместимости (МНС) тетрамер анализа 21, в котором тетрамер комплекс пептид-МНС, состоящая из четырех флуорофора с метками МНС-молекул класса I, загруженной с пептидных эпитопов, используют чтобы связать TCR и этикеток CD8 + Т клеток в антиген-специфическим образом. Пептид-МНС тетрамер анализ может выполняться либо в терминальных вскрытии исследований для выявления антиген-специфических CD8 + Т-клеток в лимфоидных и периферических тканях или в продольных исследованиях с мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от последовательный забор крови. После окрашивания лимфоцитов с пептид-МНС тетрамер, проточной цитометрии анализа выполняется для детального анализа на фенотип ЦТЛ или количественной оценки их частоты среди CD8 + Т-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, описанные в этом протоколе были одобрены Университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) в Университете Мичигана и осуществляется в соответствии с установленными правилами и руководящими принципами.

1. Синтез и характеристика ICMVs Co загружены белкового антигена и адъюванта молекул

  1. Смешайте 1: 1 мольное отношение 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (DOPC) и 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [4- (п -maleimidophenyl) бутирамид] (МПБ) в хлороформе, сохраняя общее количество липидов в 1,26 мкмоль на пакете (т.е. 500 мкг DOPC и 630 мкг MPB) в стекл нный сосудик на 20 мл (диаметр = 28 мм и высотой = 61 мм).
  2. Добавить липофильные препараты, такие как монофосфориллипида А (MPLA) или липофильных красителей (например, сделал), к липидной раствора при требуемой концентрации. Тщательно удаления органического растворителя путем продувки очень сухой nitrogeн газ и размещения образцов в вакууме O / N.
  3. Гидрат липидной пленки путем добавления 200 мкл 10 мМ трис-пропан (БТП, рН 7,0), содержащего водорастворимые препараты (например, белковых антигенов). Вихревые в течение 10 сек каждые 10 мин в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Перенесите содержимое из стекла флакона в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, место образцы в ледяной бане, и разрушать ультразвуком непрерывно в течение 5 мин с использованием интенсивности настройки на 125 Вт / 20 кГц зонд наконечника ультразвуком 40%.
  5. Добавьте 4 мкл 150 мМ дитиотреитола (DTT), чтобы каждой партии (рабочей концентрации 2,4 мМ), вихря, и кратко центрифуге с использованием настольный микроцентрифужных.
  6. Добавить 40 мкл 200 мМ CaCl 2 и смешать с пипетки (рабочей концентрации 33 мМ). Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 1 часа, чтобы позволить сшивание МПБ, содержащей липидные слои с DTT.
  7. Центрифуга образцов при 20000 мкг в течение 15 мин, удалить супернатант, и ресуспендируют в 200 мкл ddiH 2 O.
  8. Повторите шаг 1,7 и центрифуги снова после второго ddiH 2 O стирки для удаления CaCl 2, непрореагировавший DTT, и разинкапсулировать грузовых материалы из супернатанта.
  9. Подготовка 10 мг / мл 2 кДа полиэтиленгликоль-тиола (ПЭГ-SH) в ddiH 2 O. Ресуспендируют каждый образец ICMV в 100 мкл ПЭГ-SH раствора и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
  10. Выполните два ddiH 2 O моет (шаг 1.7) и ресуспендируют окончательный осадок в ICMV PBS и хранят при температуре 4 ° С. Перед использованием смешать суспензию ICMV, а частицы могут оседать на дно после длительного хранения.
  11. Для характеристики частиц, удалить небольшую аликвоту (~ 10%) ICMVs из каждой партии и разбавить по отдельности в общем объеме 1 мл ddiH 2 O. Поместите один образец в размере Zetasizer клеток и мера частиц, индекс полидисперсности и дзета-потенциала образцов с использованием DLS и дзета-потенциал измерительной системы (в соответствии с протоколом производителя).

2. Рассмотрение лимфоузлов Слив флуоресценции-метками ICMVs с конфокальной микроскопии

  1. Подготовка ICMVs загружен флуорофора с метками антигена и липофильных флуоресцентного красителя
    1. Подготовка флуорофора с метками белка, такие как яичный белок взаимодействует с Alexa Fluor 555-сукцинимидиловым эфира, в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
    2. Чтобы приготовить ICMVs помеченные флуорофора в липидной оболочки, добавить липофильный флуоресцентный краситель (например, 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (сделал)) в процессе подготовки липидной пленке (этап 1.2) в количестве 0,05% молярного липидов. Для липидной пленки гидратации (этап 1.3), использование буфера, содержащего флуорофора с метками антиген, и полного синтеза ICMV, как описано в пунктах 1.4-1.11.
  2. Подкожное введение наночастиц в основание хвоста
    1. Обезболить мышь с помощью контролируемого потока испарителя, оснащенный индукции камеры ütilizing 3% изофлуран и 1,5 л / мин в потоке кислорода в соответствии с утвержденным протоколом IACUC животных. После того, как мышь находится в бессознательном состоянии, выполните следующие действия быстро до анестезии носить с для оптимального доступа к месту инъекции и свести к минимуму дискомфорт для животного. Кроме того, пользоваться правильно подобранным носовой конус для поддержания анестезии. Если мышей под наркозом в течение более 5 мин, применять смазку, необходимую для глаз, чтобы минимизировать раздражение после процедуры.
    2. Спрей основания хвоста с 70% этанола для дезинфекции и влажной мех часть влажные волосы, чтобы выставить небольшой участок видимой кожи, которая может быть использована для визуализации иглы под кожу.
    3. Приготовления инъекции суспензии частиц, содержащий желаемое количество антигена и адъюванта на 100 мкл дозы вакцинации в PBS (например, 10 мкг OVA и 0,3 мкг MPLA на 100 мкл дозы впрыска были использованы в прошлом 6,9).
    4. Нарисуйте суспензии частиц IntOA шприц с иглой 27-29 G и вставить иглу в основание хвоста (~ 5 мм от линии роста волос) с фаской вверх и вводят 50 мкл суспензии 22 частиц.
    5. Подождите несколько секунд, чтобы уравнять давление, чтобы предотвратить чрезмерное обратного потока и вытащите иглу. Повторите инъекции на другой стороне основания хвоста целевой как дренирующие паховые LNS.
  3. Подготовка лимфоузлов криосрезов и обследование с конфокальной микроскопии.
    1. Эвтаназии мышь с CO 2 удушья, а затем индуцированного пневмоторакса в соответствии с утвержденным протоколом IACUC животных. Экстракт паховые LNS в соответствии с протоколом продемонстрировано в Bedoya 23 и промыть кровь путем помещения ткани в 1 мл 4 ° C PBS.
    2. Собрать PBS из тканей с тканями и поставить ткань в ткани cryomolds (10 х 10 х 5 мм 3), предварительно заполнен до верхней с октября замораживания среднего 24. Привязать заморозить ТИСв суд блок в жидком азоте в течение 30 сек. В качестве альтернативы, блок поместить ткани на сухом льду в течение 30 мин. Хранить замороженные ткани в -80 ° C морозильнике.
    3. Сокращение срезов ткани толщиной 5-10 мкм в криостате установлен при -20 ° С 24.
    4. При необходимости, выполните иммунофлюоресценции маркировки, и изучить ткани с конфокальной микроскопии, как было показано ранее 24.

3. Контроль Расширение антиген-специфические, люциферазы-экспрессирующих CD8 + Т-клеток после вакцинации наночастиц с целого животного изображений

  1. Выделение OVA-специфических 257-264 люциферазы, экспрессирующих CD8 + Т-клеток от ОТ-I / Luc трансгенных мышей
    1. Эвтаназии в трансгенной мыши OT-I / Luc с СО 2 удушья и вызвать пневмоторакс в соответствии с утвержденным протоколом IACUC животных. Урожай селезенки в стерильных условиях путем доступа в брюшную полость и осторожно отсоединения ткани из поджелудочной железы 23, иМесто в 5 мл 4 ° C PBS + 2% FBS для передачи капот культуры ткани.
    2. Поместите селезенки на нейлоновой фильтр 70 мкм на 50 мл коническую центрифужную пробирку (до 3 селезенке в то время). Использование плунжера из 3 мл шприц, клетки измельчить через сито.
    3. Вымойте поршень и сетчатый фильтр с PBS + 2% FBS и выбросить. Довести общий объем до 10 мл / селезенки в 50 мл трубки, взять небольшой образец суспензии клеток считаться с гемоцитометра и центрифуги в течение 10 мин при 300 х г.
    4. Использование имеющихся в продаже магнитного негативное комплект выбора, изолировать популяции клеток CD8 + T, следуя инструкциям изготовителя.
    5. После промывки клеток с PBS, подсчитывают количество выделенных CD8 + Т-клеток. Для оценки чистоты выделенных CD8 + Т-клеток, инкубировать ~ 20,000-30,000 клеток в 20 мкл мышиного CD16 / 32 антитела (0,025 мг / мл) в течение 10 мин, затем добавить 20 мкл αCD8-APC антитела (0,005 мг / мл) и инкубировать в течение 30 мин. Физ Раrform Все инкубации при 4 ° С в PBS + 1% вес / объем BSA. Выполните анализ потока цитометрии 25.
  2. Приемные Передача изолированных CD8 + Т-клеток и визуализация их расширение после вакцинации
    1. Выполнение приемных передачи изолированных OT-I / Люк CD8 + Т-клеток в наивных мышей C57BL / 6 путем введения 1-10 × 10 5 клеток в объеме 200 мкл PBS посредством внутривенной инъекции в хвостовую вену 22 (-1 день). Учитывая, что меховые и черный кожи патчи в C57BL / 6 мышей может вмешиваться в биолюминесценции сигнала, побрился альбиносов C57BL / 6 мышей идеально подходят для этих исследований.
    2. После одного дня (день 0), прививку, как описано ранее (раздел 2.2).
    3. Администрирование 150 мг люциферин на кг веса тела мыши внутрибрюшинно в объеме 300 мкл PBS. Через 10 мин, обезболить мышей с изофлуран (как в шаге 2.2.1) и визуализировать OT-I / Люк CD8 + Т-клеток путем приобретения сигнал биолюминесценции в течение 5-10 мин сIth всей системы формирования изображения животных (ИВИС, см Уилсон 26 для подробной инструкцией). При необходимости повторите для продольных исследований.

4. Пептид-МНС тетрамеров Окрашивание РВМС для анализа антиген-специфических клеток CD8 + Т-

Примечание: В следующей процедуре протокола может быть выполнена с использованием либо мышей C57BL / 6 адаптивно передаваемые с OT-I / Люк CD8 + Т-клеток или C57BL / 6 мышей без приемных передачи.

  1. В нужной точке времени после вакцинации, собирать около 100 мкл крови (4-6 капли) от мышей через подчелюстной техники кровотечение 27 в трубку, покрытую К 2 EDTA и инвертировать несколько раз, чтобы предотвратить свертывание.
  2. Передача 100 мкл крови в микроцентрифужных трубки, добавляют 1 мл буфера для лизиса и инкубировали в течение 2 до 3 мин, чтобы удалить эритроциты (эритроцитов). Центрифуга образцов в течение 5 мин при 1500 мкг и удалить супернатант. Если осадок ещеppears красные (с указанием неполное удаление эритроцитов), повторите шаг лизиса с кратковременной инкубации (<1 мин) буфера для лизиса.
  3. Промыть оставшиеся МНПК 1 мл FACS буфера (PBS + 1% вес / объем BSA) и центрифуге при 1500 х г в течение 5 мин.
  4. Аспирата супернатант и ресуспендируют образца в 20 мкл мышиного CD16 / 32 антитела (0,025 мг / мл), чтобы блокировать неспецифическую и FcR-опосредованного связывания антитела. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Трансфер клетки от микропробирок в 4 мл с круглым дном FACS труб. Добавьте 20 мкл H-2K б решения OVA Тетрамер-SIINFEKL-PE в соответствии с требованиями завода-изготовителя для каждого образца и инкубировать в течение 30 мин на льду.
  6. Подготовьте смесь антител (например, αCD8-APC, αCD44-FITC, и αCD62L-PECy7 антитела (0,005 0,005 0,002 мг / мл концентрация, соответственно)). Добавьте 20 мкл каждой экспериментального образца, и инкубировать в течение 20 мин на льду. Подготовьте отдельные элементы управления флуорофорные от Лос-Анджелесаbeling клетки с каждого флуорофора с метками тетрамера или антитела в концентрации, указанной выше.
  7. Промыть 2 раза FACS буфера и ресуспендируют конечный осадок в FACS буфере, содержащем 2 мкг / мл DAPI. Клетки готов к проточной цитометрии (подробности и примеры можно найти в Scheffold 25).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этапы в синтезе ICMVs показаны на рисунке 1 6. Вкратце, липидную пленку, содержащую любые липофильные препараты или флуоресцентные красители гидратируют в присутствии гидрофильных лекарств. Двухвалентные катионы, такие как Ca 2+, добавляют привод сплав анионных липосом в многослойные везикулы. Дитиольному сшивающий агент, такой как DTT, добавляют к "сшивание" малеимид-функционализированного липидов на липидные слои соединяющий, и, наконец, остальные внешние группы малеими...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол в этой статье описан синтез и характеристику новой липидной основе системы наночастиц, называемый ICMVs, и обеспечивает процесс проверки эффективности вакцинных препаратов на основе наночастиц, чтобы вызвать антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы. Синтез ICMV завершена во всех водном состоянии, что является важным преимуществом по сравнению с другими, обычно используемых полимерных систем наночастиц (например, поли (лактид-со-гликолид) частицы кислоты), которые, как правило, требуют органически...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Perkin Elmer при условии, себестоимость производства, понесенных в течение публикации этой статьи.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставлять 1K22AI097291-01 и Национального центра Продвижение поступательного наук Национальных Институтов Здоровья в премии Количество UL1TR000433. Мы также признаем, профессор Даррелл Ирвайн в Массачусетском технологическом институте и профессор Маттиас Стефана в Фреда Хатчинсона онкологический центр за их вклад в первоначальной работы по наночастиц вакцин и OT-I / Luc трансгенных мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1. Синтез и характеристика ICMV в сочетании с белковым антигеном и молекулами адъюванта
1,2-диолеоил-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (соль натрия) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-диолеоил-<ЭМ>СН-глицеро-3-фосфохолин (ДОПК)Avanti Polar Lipids, INC.
Монофосфориллипид А (синтетический) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
Стеклянные флаконы 20 млWheaton0334125D
Symphny Vacuum OvenVWR 414004-580
Овальбумин (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propane (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonicator (125  W/20  кГц)QsonicaQ125-110
Дитиотреитол (DTT)FisherBP172
2 кДа Тиолированный полиэтиленгликоль (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer CuvettesMalvernDTS1070
2. Исследование дренирования лимфатических узлов флуоресцентно меченных ICMV с помощью конфокальной микроскопии
1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианин, 4-хлорбензолсульфонат соли (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-сукцинимидиловый эфир (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Тканевая охлаждающая среда ОКТ VWR25608-930
Тканевые криоформыVWR25608-922
3. Мониторинг экспансии антиген-специфичных, экспрессирующих люциферазу CD8+ Т-клеток после вакцинации наночастицами с помощью визуализации всего животного
C57BL/6 мышейДжексон000664
альбинос C57BL/6 мышейДжексон000058
OT-1 C57BL/6 мышейДжексон003831
70 мкм; m нейлоновый фильтрBD352350
EasySep™ Мышиный набор для изоляции CD8+ Т-клетокStemCell19853
IVIS® система визуализации всего животногоPerkin Elmer
4. Пептидно-MHC тетрамерное окрашивание мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) для проточного цитометрического анализа антиген-специфических CD8+ Т-клеток
K2EDTA tubesBD365974
буфер для лизиса ACKLife TechnologiesA10492-01 
Анти-CD16/32 Fc блокEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetramerMBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6- Диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn Проточный цитометрBeckman Coulter
FlowJo Программное обеспечениеFlowJo
870012850375

Ссылки

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130(2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771(2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765(2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740(2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465(2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105(2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627(2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD8

Похожие статьи