Мы описываем методы визуализации всего животного и проточной цитометрии для мониторинга экспансии антиген-специфичных CD8+ Т-клеток в ответ на иммунизацию наночастицами в мышиной модели вакцинации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Традиционные вакцинные адъюванты, такие как квасцы, вызывают неоптимальный ответ CD8+ Т-клеток. Для решения этой серьезной проблемы в разработке вакцин были разработаны различные системы наночастиц, имитирующие особенности патогенов, чтобы улучшить доставку антигена к дренажным лимфатическим узлам и увеличить поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, что привело к созданию новых вакцинных составов, оптимизированных для индукции антиген-специфических ответов CD8+ Т-клеток. В данной статье мы описываем синтез «имитирующей патогены» системы наночастиц, называемой интербислойно-сшитыми многослойными везикулами (ICMV), которые могут служить эффективным носителем вакцины для совместной доставки субъединичных антигенов и иммуностимулирующих агентов и вызывания мощных цитотоксических ответов CD8+ Т-лимфоцитов (CTL). Описаны методы определения гидродинамического размера и поверхностного заряда наночастиц вакцины с помощью динамического рассеяния света и анализатора дзета-потенциала, а также представлена процедура на основе конфокальной микроскопии для анализа доставки антигена, опосредованного наночастицами, к дренирующим лимфатическим узлам. Кроме того, мы демонстрируем новую биолюминесцентную технику визуализации целых животных с использованием адоптивного переноса экспрессирующих люциферазу антиген-специфических CD8+ Т-клеток мышам-реципиентам с последующей вакцинацией наночастицами, что позволяет проводить неинвазивные исследования моделей экспансии и транспортировки CTL в режиме реального времени. Описаны тетрамерное окрашивание и проточный цитометрический анализ мононуклеарных клеток периферической крови для лонгитюдной количественной оценки эндогенных Т-клеточных реакций у мышей, вакцинированных наночастицами.
Введение
Традиционные развития вакцины в основном использовали эмпирический подход опытной и ошибок. Тем не менее, с недавним развитием широкого спектра биоматериалов и открытий молекулярных детерминант иммунной активации, теперь можно рационально спроектировать вакцинных препаратов с биофизических и биохимических сигналов, полученных от патогенов 1,2. В частности, различные частицы платформы доставки лекарств были рассмотрены в качестве носителей вакцинных как они могут быть совместно с грузом субъединиц антигенов и иммуностимулирующих агентов, защищать компоненты вакцины от деградации и повышения их сотрудничество доставку антиген-представляющие клетки (АРС), про....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты, описанные в этом протоколе были одобрены Университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) в Университете Мичигана и осуществляется в соответствии с установленными правилами и руководящими принципами.
1. Синтез и характеристика ICMVs Co загружены белкового антигена и адъюванта молекул
- Смешайте 1: 1 мольное отношение 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (DOPC) и 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [4- (п -maleimidophenyl) бутирамид] (МПБ) в хлороформе, сохраняя общее количество липидов в 1,26 мкмоль на пакете (т.е. 500 мкг DOPC и 63....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этапы в синтезе ICMVs показаны на рисунке 1 6. Вкратце, липидную пленку, содержащую любые липофильные препараты или флуоресцентные красители гидратируют в присутствии гидрофильных лекарств. Двухвалентные катионы, такие как Ca 2+, добавляют привод сплав анионных липосом в многослойные везикулы. Дитиольному сшивающий агент, такой как DTT, добавляют к "сшивание" малеимид-функционализированного липидов на липидные слои соединяющий, и, наконец, остальные внешние группы малеими.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол в этой статье описан синтез и характеристику новой липидной основе системы наночастиц, называемый ICMVs, и обеспечивает процесс проверки эффективности вакцинных препаратов на основе наночастиц, чтобы вызвать антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы. Синтез ICMV завершена во всех водном состоянии, что является важным преимуществом по сравнению с другими, обычно используемых полимерных систем наночастиц (например, поли (лактид-со-гликолид) частицы кислоты), которые, как правило, требуют органически.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Perkin Elmer при условии, себестоимость производства, понесенных в течение публикации этой статьи.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставлять 1K22AI097291-01 и Национального центра Продвижение поступательного наук Национальных Институтов Здоровья в премии Количество UL1TR000433. Мы также признаем, профессор Даррелл Ирвайн в Массачусетском технологическом институте и профессор Маттиас Стефана в Фреда Хатчинсона онкологический центр за их вклад в первоначальной работы по наночастиц вакцин и OT-I / Luc трансгенных мышей.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1. Синтез и характеристика ICMV в сочетании с белковым антигеном и молекулами адъюванта | |||
| 1,2-диолеоил-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (соль натрия) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | ||
| 1,2-диолеоил-<ЭМ>СН-глицеро-3-фосфохолин (ДОПК) | Avanti Polar Lipids, INC. | ||
| Монофосфориллипид А (синтетический) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| Стеклянные флаконы 20 мл | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR 414004-580 | ||
| Овальбумин (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 кГц) | Qsonica | Q125-110 | |
| Дитиотреитол (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 кДа Тиолированный полиэтиленгликоль (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Исследование дренирования лимфатических узлов флуоресцентно меченных ICMV с помощью конфокальной микроскопии | |||
| 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианин, 4-хлорбензолсульфонат соли (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-сукцинимидиловый эфир (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Тканевая охлаждающая среда ОКТ | VWR | 25608-930 | |
| Тканевые криоформы | VWR | 25608-922 | |
| 3. Мониторинг экспансии антиген-специфичных, экспрессирующих люциферазу CD8+ Т-клеток после вакцинации наночастицами с помощью визуализации всего животного | |||
| C57BL/6 мышей | Джексон | 000664 | |
| альбинос C57BL/6 мышей | Джексон | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 мышей | Джексон | 003831 | |
| 70 мкм; m нейлоновый фильтр | BD | 352350 | |
| EasySep™ Мышиный набор для изоляции CD8+ Т-клеток | StemCell | 19853 | |
| IVIS® система визуализации всего животного | Perkin Elmer | ||
| 4. Пептидно-MHC тетрамерное окрашивание мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) для проточного цитометрического анализа антиген-специфических CD8+ Т-клеток | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| буфер для лизиса ACK | Life Technologies | A10492-01 | |
| Анти-CD16/32 Fc блок | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL TS-5001-1C | ||
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6- Диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Проточный цитометр | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Программное обеспечение | FlowJo |
Ссылки
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
