Системы HeLa основе сотового свободное выражение для выражения Плазмодий Rhoptry Белки

Summary

Выражение малярийных белков в клеточных системах на основе остается сложной. Мы демонстрируем две системы шаг и один шаг IVT (в пробирке перевод) бесплатно экспрессии клеток для выражения малярийных рекомбинантных белков rhoptry из HeLa клеток. Мы используем систему очистки на основе Ni-смолы сродства для очистки rhoptry белки.

Abstract

Малярия вызывает серьезную глобальную заболеваемости и смертности. Нет дня вакцина не доступна в данный момент. Один из главных причин, из-за отсутствия вакцины задача выявления подходящих кандидатов вакцины. Малярийные белки выражается с помощью прокариотических и эукариотических систем экспрессии клеток на основе плохо гликозилирован, как правило, нерастворимы и пройти ненадлежащее складывание приводит к снижению иммуногенности. Свободные системы экспрессии зародышей пшеницы, лизата ретикулоцитов кролика и кишечная палочка лизат клеток в настоящее время используются для выражения малярийных белков. Однако продолжительность времени экспрессии и неправильного гликозилирования белков до сих пор остается проблемой. Мы демонстрируем выражение Plasmodium белков в пробирке с помощью системы свободного выражения клеток HeLa основе их называют "сотовые системы экспрессии бесплатно в пробирке человека". Свободные системы экспрессии клеток HeLa основе 2 транскрипции мРНК в 75 мин и 3 мкл transcribред мРНК достаточно, чтобы перевести белки в течение 90 мин. Система 1-шаг выражение транскрипции и трансляции системы в сочетании выражение; транскрипция и со-перевод происходит в 3 ч. Этот процесс также может быть расширен в течение 6 ч, обеспечивая дополнительную энергию. В системе 2-ступенчатой ​​экспрессии мРНК сначала транскрибируется, а затем добавить в смесь перевода для экспрессии белка. Мы опишем, как выразить малярии белки; гидрофобный Волчья PF3D7_0114100 Маурера - 2 трансмембранный (PFMC-2TM) белок, белок гидрофильный PF3D7_0925900 и броненосец повторы, содержащие белок PF3D7_1361800, использующие систему свободного выражения клеток HeLa основе. Белки выражается в микро объемов использующих 2-ступенчатые и 1-шаг стратегии экспрессии. Метод аффинной очистки, чтобы очистить 25 мкл белков, выраженных с использованием человеческих клеток системы свободного выражения в пробирке также описаны. Выход белка определяется анализом Брэдфорда и выразили очищенные белки могут быть подтверждены с помощью анализа вестерн-блоттинга. Выраженные рекомбинантные белки могут быть использованы для иммунизации иммунологических и секвенирования белка.

Introduction

В малярией исследования, выражение иммуногенных белков с использованием прокариотических или эукариотических систем, основанных клеток остается проблемой. НА богатство Plasmodium геноме и неизвестных посттрансляционных механизмов ^14,7, способствуют трудности, связанные с получением правильно сложенные и иммуногенные белки для производства антител и вакцин исследований. Прокариотических системах, таких как кишечной палочки были использованы для экспрессии рекомбинантного белка. Прокариотических системах являются низкая стоимость, эффективный, высокие урожаи рекомбинантного белка и имеют несколько векторов клонирования. Принимающая Е. палочки клетки легко трансформировать и клетки быстро расти. Тем не менее, прокариотические системы имеют ограничения, такие как отсутствие замещения аминокислоты, посттрансляционной модификации, риск загрязнения, гетерогенных продуктов и накопления рекомбинантных белков в тельцах включения ^24.

ВИсследование Mehlin др. (2006), были выражены 1000 открытые рамки считывания (ORF). Примерно 7% выраженных белков растворяются ^14. Нерастворимость наблюдается из-за смещенного природы генов и высокой частоты кодонов, которые используются в идеале от Plasmodium у богатых генома ^14. Альтернативная стратегия для преодоления этой проблемы была разработана с помощью плазмиды или клеток-хозяев, содержащих тРНК, которые распознают редкие кодоны или кодоны, которые соответствуют частоты ^3. Даже после выполнения этих оптимизацию, очень небольшие порции белков выражены как растворима активна и иммуногенной ^14. Системы экспрессии бесклеточные содержать все компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, такие как рибосомы, факторы инициации, элонгации факторов (факторов) переводы, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. Обе реакции транскрипции и трансляции соединены в один шаг процедуры ^11,29. TranscriРеакция автомеханик выполняется в трубе, прежде чем соответствующее количество мРНК инкубировали с перевода техники в другом трубки ^11,29. Хотя эти методы являются успешными в Plasmodium Sp. Экспрессии белка, основным недостатком является продолжительность времени для экспрессии белка, который составляет примерно 22 ч ^29. Кроме того, высокая стоимость расходных материалов для включения в протоколы ^29, трудоемких препараты клеточного лизата и несоответствия в компонент препаратов, сделать эти системы недостижима. Основное внимание исследователей для развития свободной системы экспрессии клеток зависит от таких факторов, как быстрое генетической модификации, быстрых выходов с высокой концентрацией и прямо вперед лизатов препаратов ^1.

Эукариотических системах, таких как дрожжи, клеточные линии млекопитающих, бакуловируса опосредованной системы экспрессии, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum и паразитарных системах экспрессии суч в Leishmania были использованы для экспрессии рекомбинантного белка ^7. Эукариотических системах поделиться филогенетическое родство и, следовательно, общие характеристики, такие как гликозилирование, ацилирование, образование дисульфида облигаций, шаперонной взаимодействия, протеолиза и субклеточном раздробленности. Белковые секреции события в эукариот предотвратить накопление и уменьшается токсичность для систем экспрессии ^13. Применение дрожжей систем является предпочтительным, поскольку они пригодны для экспрессии белка в большом масштабе и для получения высоких урожаев ^4. Два П. тропической белки PFCP-29 и Pvs25 были произведены с использованием системы дрожжей ^4. Тем не менее, основным недостатком в синтезе большинства белков нерегулярные N и О-гликозилирования узоры, неадекватное складывания и усечение белков из их родной форме ^4.

Использование клеток млекопитающих для синтеза рекомбинантных белков является трудоемким, и это expenSive для поддержания стабильных рекомбинантных клеточных линий ^4. Таким образом, клетки млекопитающих были ограничены для анализа сигналов белка, белковых взаимодействий и паразит-хозяин взаимодействий, а также для тестирования вакцин ДНК ^4. ДНК человека и РНК в пробирке бесклеточной системе экспрессии белка, описанный здесь, млекопитающих система на основе клеток, полученных HeLa, что выражает белки в 3 ч. Белки выражается с помощью pT7CFE1-Chis вектор экспрессии имеют C-концевой метки облегчая идентификацию и очистку. Система основана HeLa дополнена факторов инициации трансляции и регулятора перевода, тем самым повышая эффективность системы перевода. Белки могут быть быстро переведен, экранированный, проверены и обработаны для использования в различных иммунологических и конструкционных применений ^15.

Эукариотических системах экспрессии клеток-Free, такие как зародыши пшеницы и ретикулоцитов кролика в настоящее время используется для выражения Varдолговые расписки эукариот белки, включая белки Plasmodium ^11,29. Кроме того, Е. Системы, основанные палочки бесклеточные также используются для выражения эукариотических белков ^11. В таблице 1 приведены различные системы экспрессии клеток бесплатно, сравнивая особенности систем, а также простоту использования системы для экспрессии белка. Бесклеточной системе человеческого в сравнении с другими имеет возможность выполнять пост и ко-трансляционных модификаций и дешевле. Оптимизация кодонов можно и все эти реакции могут быть осуществлены в 3 ч. Система HeLa является идеальной системой перевод синтеза белка в лабораторных условиях.

Основным преимуществом систем экспрессии клеток человека свободным по сравнению с другими свободными системами клеток является наличие нескольких различных клеточных линий, полученных из различных органов и тканей. Несколько разновидностей свободных клеточных системах могут быть разработаны в зависимости от клеточной линии. Экстрактс, полученные из клеток млекопитающих имеют более высокую эффективность, чтобы синтезировать большие белки, чем любых других системах экспрессии клеток бесплатно. Эти системы экспрессии клеток свободным и может быть использован в диагностических и белковых приложений характеризации таких как микро наборов ^30. Популярные клеточные линии HeLa наиболее широко используются для проведения экспрессию белков ^33. Эндоплазматическая сеть в клеточных линиях HeLa недоразвита, что приводит к отсутствию посттрансляционная гликозилирования модификации активности ^33. Тем не менее, эта система, как полагают, чтобы быть выгодным для синтеза белка Plasmodium, как плазмодий также не гликозилирования после модификации перевода ^29. Свободный протокол транскрипции-трансляции HeLa клетки легко выполнить, недорогой и белки могут быть экспрессированы в течение 90 мин, готова для очистки и далее вниз по течению приложений.

Protocol

1. Подготовка паразита клеточных культур, Сборник Parasite Пеллеты

1. Подготовка RPMI-1640-HEPES носитель добавлением 10 г RPMI-1640 порошка, 66 мг гентамицина сульфата, 2 г бикарбоната натрия, 5,9 г HEPES буфера, 50 мг гипоксантина и 3,8 г декстрозы в 1 л стерильной дН ₂ О. Смешайте не с помощью таблицы магнитной мешалки, пока все не растворится в порошковых 1 л дистиллированной воды. Выполните микро фильтрацию массовой информации, использующих 0,22 мкм фильтр. Храните носители в стерильные бутылки.
2. Вымойте заражения сифилисом (свежие) типа А + эритроциты, используя RPMI. Подготовьте 5% гематокрита эритроцитов (0,5 мл промытых свежих эритроцитов в 9,5 мл 10% RPMI + сыворотке крови человека).
3. Сделайте 15% человеческого сывороточного + RPMI (15 мл сыворотки крови человека и 85 мл RPMI), чтобы начать выращивание паразитов. Сделайте 10% человек сыворотки и RPMI (10 мл сыворотки крови человека и 90 мл RPMI), чтобы продолжить культивирование паразитов в эритроцитах.
4. Культура П. тропической (3D7 и ФКР-3 штамма) по типуA + эритроциты человека в 5% гематокрита и 20% паразитемии в чашке Петри или культуральной колбе 75 см ^3. Поддерживать культуру в пробирке в соответствии с методом Träger и Дженсен свечи банку ^26. С другой стороны, поддерживать культуры в термостате при 37 ° С поддержание 9,5% CO _2, и 3,4% N ₂ газа. Культура П. тропической в RPMI 1640-HEPES, дополненной 10% сыворотки человека.
5. Синхронизация P. тропической культуры с добавлением 65% Percoll (65 мл перколлом + 35 мл RPMI-1640 без сыворотки человека) в культуре концентрата ^27.
6. Центрифуга культуры концентрата с перколлом при 2500 х г в течение 5 мин, что приводит к 3-х слоев. Осторожно, с помощью пипетки передачи изолировать шизонты из среднего слоя в передаче отдельную пробирку в асептических условиях ^27.
7. Промыть выделенных культур с 10% человеческой сыворотки + RPMI-1640 в два раза, чтобы удалить избыток перколлом центрифугированием при 7500 х г в течение 5 мин. ДиSCard супернатант каждый раз в асептических условиях ^27.
8. Продолжить культивирование синхронизированный P. Falciparum шизонты в 10% человеческой сыворотки + RPMI-1640 ^27.
9. Сбор шизонты обработкой Plasmodium -infected эритроциты 10 мМ Трис, рН 8,8 и центрифугированием при 15000 х г в течение 15 мин ^23. Магазин паразитов гранулы при -70 ° С после добавления 5 мкл ингибитора протеазы (апротинин) в гранулах. Используйте паразитов гранулы для извлечения белка, выделения геномной ДНК и РНК изоляции.

2. Подготовка вектор плазмиды

1. Изолировать от геномной ДНК P. тропической шизонт гранулы, полученные из культур примерно 20% паразитемии.
2. Добавить 600 мкл 10 мМ Трис-HCl рН 7,6, 50 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,1% SDS и 1 мг / мл протеиназы К, чтобы гранулы в микроцентрифужных трубки, гомогенизации осадка с использованием 1 мл шприц, присоединенный к игле 26 г. Альтернативный заполнения шприцас гранул смеси и опорожнения в микроцентрифужных трубки 20 раз. Выдержите трубки, содержащей гомогенат O / N в С на водяной бане 50 °.
3. Выполнение фенол - хлороформ (Р + С) экстракции добавлением 600 мкл P + C (300 мкл фенола и 300 мкл хлороформа) к гомогенизированной гранул. Крышка трубки плотно и встряхнуть смесь энергично обращения конец-в-конец трубки. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 2 мин и собирают верхнюю водного раствора с помощью микропипетки в новую пробирку микроцентрифужных. Повторите этот шаг дважды.
4. Добавить 600 мкл хлороформа к водному слою в новую пробирку с шага 2.1.2. Vortex трубку в течение 10 сек и центрифуге при 14000 х г в течение 2 мин. Измерить верхний водный слой с помощью микропипетки и перенести его на новой трубки микроцентрифужных.
5. Добавить 0,1 об ацетата рН 5 М натрий 5,5 и 1 об изопропанола (если водный слой составляет 300 мкл добавить 30 мкл ацетата рН 5 М натрия 5,5 + 330 мкл изопропанола) к водному яйцекладкиэ с шага 2.1.3. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 15 мин.
6. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 10 мин для осаждения осадка ДНК. Жидкость над осадком сливают и мыть гранул с 100 мкл 70% этанола (70 мкл этанола и 30 мкл дН ₂ O), чтобы удалить избыток соли из ДНК. Магазин ДНК в 50 мкл дН ₂ O при -20 ° С.
7. Конструкция прямого и обратного праймеров с использованием программного обеспечения или вручную для амплификации P. Falciparum гены PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 и PF3D7_0114100 ранее определены в протеома исследований ^16,18 с соответствующими сайтами рестрикции чтобы позволить клонирование последовательностей генов в нескольких клонирования сайтов выражение плазмиды pT7CFE1-Chis, как показано в таблице 2.
8. Делают 50 мкл реакционной смеси путем добавления; 5 мкл выделенной P. тропической геномной ДНК, 5 мкл 10х буфера, 5 мкл MgCl _2, 1,5 мкл прямого праймера, 1,5 мклобратный праймер, 0,5 мкл ДНК-полимеразы Т7 и 31,5 мкл дН ₂ O и выполнения полимеразной цепной реакции (ПЦР) при 94 ° С в течение 8 мин для денатурации, 50 ° С в течение 1 мин 30 сек для расширения и 72 ° С в течение 9 мин для отжига и ренатурации амплификации генов, приведенных в таблице 1.
9. Отдельные продукты ПЦР на 1% агарозном геле (1 г агарозы и 100 мл Трис ацетата ЭДТА (ТАЕ буфера)) ^32.
10. Нарезать ПЦР-амплификации полосы ДНК из агарозного геля, разместить ломтики гель, содержащий ДНК в геле ДНК извлечения спин колонки и заморозить при -20 ° С в течение 5 мин. Добавьте 100 мкл изопропанола, замороженных срезах геля и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин.
11. Измерьте водный поток-через фильтрованную в пробирку с шагом 2,5, используя микропипетку и передать в новую пробирку. Добавить 0,1 об из 5 М ацетата натрия и центрифугируют при 14000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и добавить 10 мкл дН ₂ O в гое ДНК осадок.
12. Дайджест вектор экспрессии pT7CFE1-Chis и фрагменты очищенной ДНК (от 2.6) в двух отдельных труб, добавив 3 мкл плазмиды и 5 мкл генных продуктов ПЦР в каждую пробирку. Добавить в каждую пробирку, 1 мкл специфических рестрикционных ферментов, 2 мкл реакционного буфера и 14 мкл дН ₂ O.
13. Добавить 3 мкл переваренной плазмидой 5 мкл переваренной ДНК-фрагментов, 2 мкл 10х буфера лигазы, 1 мкл лигазы и 9 мкл дН ₂ O в микроцентрифужных трубки. Выдержите в 12 ° CO / N.
14. Добавить 0,1 об 3 М ацетата натрия при рН 5,5 и 2 объемами этанола (если объем реакционной трубки 20 мкл добавляют по 2 мкл 3 М ацетата натрия + 44 мкл этанола) к трубе с шагом 2.14. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре -20 ° С в течение 15 мин.
15. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 15 мин. Осторожно удалите супернатант, используя микро пипетки, не нарушая гранул.
16. Добавить 100 мкл 70% этанола тО гранулы со стадии 2.10. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 5 мин. Снимите и выбросьте супернатант. Добавить 10 мкл нуклеазы без воды к осадку ДНК.

3. Экспрессия белка, используя в пробирке клеток человека свободу выражения системе

1. Готовят 20 мкл смеси транскрипции путем измерения 2 мкл рекомбинантного pT7CFE1-Chis плазмидной ДНК, 4 мкл 5х буфера транскрипции, 4 мкл смеси NTP, 2 мкл РНК-полимеразы Т7 и 8 мкл нуклеазы без воды в течение 2-шага человек в Vitro экспрессии белка, используя шаблоны ДНК. Смешайте компоненты в микроцентрифужных трубки и инкубировать в течение 75 мин при 30 ° С на водяной бане.
2. Возьмите 2 мкл транскрипции смеси и добавить его в 23 мкл смеси, содержащей перевода 12,5 мкл лизата клеток HeLa, 2,5 мкл вспомогательных белков, 1 мкл солевого раствора А, 0,5 мкл аминокислот -Met, 0,5 мкл аминокислот -Leu, 181; л ингибитора РНКазы, 1,25 мкл энергобалансе и 3,75 мкл нуклеазы без воды.
3. Инкубируйте перевода смеси со стадии 3.2 при 30 ° С в течение 90 мин. Магазин переведен продуктов при -20 ° С.
4. Готовят 25 мкл транскрипции и трансляции смеси путем добавления 3 мкл рекомбинантного pT7CFE1-Chis плазмидной ДНК, 2 мкл нуклеазы без воды, 5 мкл реакционной смеси, 12,5 мкл лизата HeLa и 2,5 мкл вспомогательных белков на 1-шага человек сочетании ИВТ Экспрессия белка для шаблонов ДНК.
5. Инкубируйте реакционной смеси, полученной на стадии 3.4 в течение 90 мин до 6 ч при 30 ° С. Храните продукты при температуре от -20 перевода ° С.

4. Очистка выраженных рекомбинантных белков

1. Добавить 75 мкл буфера 1x очистки до 25 мкл перевод продукта, чтобы сделать 100 мкл смеси очистки.
2. Добавить 100 мкл никель хелатообразующей смолы до 100 мкл очистки микстЮр. Промыть Ni-смолы в два раза путем добавления 300 мкл дН ₂ O и 300 мкл буфера для связывания. Повторное приостановить смолы и центрифуги при 14000 мкг в течение 1 мин для удаления избытка этанола.
3. Добавить 100 мкл смеси очистки от шага 4.2 к ​​100 мкл никелевой хелатирующих смол и инкубируют смесь в течение 60 мин при комнатной температуре.
4. Центрифуга смеси при 14000 х г в течение 1 мин и собирают супернатант в свежую пробирку как "течь через".
5. Промыть смолу со 100 мкл 1х промывочным буфером (20 мМ имидазола, 250 мМ NaH ₂ PO ₄ при рН 8, 2,5 М NaCl и дН ₂ O). Центрифуга при 14000 мкг в течение 1 мин и собрать супернатант в новую пробирку с надписью "мыть". Повторите шаг 4,5 раза.
6. Добавить 100 мкл буфера для элюции 1x (100 мМ имидазол, 250 мМ Na ₂ PO ₄ при рН 8,0, 2,5 М NaCl, и дН ₂ O) к смоле и инкубируют в течение 15 мин. Центрифуга при 14000 мкг в течение 1 мин. Сделайте шаг элюирования в два раза. КаждыйВремя собирать супернатант в новые микропробирок и метки как «элюата".
7. После элюирования, мыть смолы в два раза, как описано в шаге 4.5. Магазин течь через, моет и образцы элюции при -20 ° С или ниже. Смола должна храниться при температуре 4 ° С. Использование 30 мкл каждого образца для SDS-PAGE и иммуноблоттинга анализа.

5. Кумасси (Bradford) анализа белка ³⁴

1. Подготовка стандарт бычьего сывороточного альбумина (BSA решения) с концентрацией 20 мкг / мл (смесь 10 мкл BSA (2 мг / мл) и 90 мкл дН ₂ O), 40 мкг / мл (смесь 20 мкл BSA (2 мг / мл) и 80 мкл дН ₂ O), 60 мкг / мл (смешать 30 мкл BSA (2 мг / мл) и 70 мкл дН ₂ O), 80 мкг / мл (смесь 40 мкл BSA (2 мг / мл) и 60 мкл дН ₂ O), 100 мкг / мл (смесь 50 мкл BSA (2 мг / мл) и 50 мкл дН ₂ O), 160 мкг / мл (смесь 80 мкл BSA (2 мг / мл) и 20 мкл дН₂ O) и 200 мкг / мл (по 100 мкл BSA (2 мг / мл).
2. Мера 5 мкл потока через, моет и элюата образцов с этапа 4.7. Добавить 95 мкл дН ₂ O.
3. Добавляют 5 мл кумасси синим реагента к смеси из шагов 5.1 и 5.2. Покрытие трубы с парафином и вихря в течение 10 сек затем инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.
4. Использование спектрофотометра измерения оптической плотности (OD) при длине волны 650 нм для белка труб из шага 5.3. Концентрация земля против OD чтения, чтобы определить концентрации протеина ^34.

6. Вестерн блот

1. Добавьте 5 мкл шизонтами выписок из P. тропической, 2 мкл кишечной палочки экспрессируемого рекомбинантного Rhop-3 белкам ^31, 5 мкл рекомбинантных белков выражается с помощью 2-х ступенчатый и 1-шаг в пробирке систем экспрессии человека и 10 мкл белковых продуктов очищали с использованием метода сродства к отдельные пробирки.
2. Добавить электрофореза буфера, содержащего меркаптоэтанол в каждую пробирку для конечного объема 20 мкл, чтобы растворенные образцы белка. Варить трубы в течение 2 мин.
3. Загрузка растворенные образцы белка на 10% ПААГ с ДСН, чтобы отделить белки.
4. Перевести разделенных белков из гелей SDS-PAGE на нитроцеллюлозные бумаги (NCP) в электрофореза в 35 мА на гель в полусухого блоттинга западной камере в течение 2 ч.
5. Блок НКТ после переноса с 2% обезжиренного молока.
6. Инкубировать их НКП со следующими поликлональных антител разводили 1: 100 в 2% молока для выполнения вестерн-блоттинга; кролика антитела # 676 ²¹ специфичны для P. Falciparum мерозоитам rhoptries, мыши антитела, специфичные для ²⁰ P. yoelii и П. berghei мерозоитам rhoptries, антисыворотки # 685, специфичные к P. тропической паразитофорной белок вакуоли, сыворотки (серин богатые антиген) ²² и антитела, специфичные для Maurer217; s расщелина белок PFMC-2TM ^28.
7. Выдержите НКП также в 1: 100 разбавленные нормальные мыши и кролика в сыворотке и провел супернатанта культуры (СКС) с клетками миеломы SP2 в качестве отрицательных контролей.
8. Выдержите НКП с антителами и управления при 4 ºC O / N.
9. Промыть НКТ 4x с Тех буфер и инкубировать с НКП видов конкретных вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), разбавленный 1: 1000 в 2% молока.
10. Вымойте НКТ 4x с Клякса буфера. Инкубировать промывали НКП с раствором проявления цвета A + B (Раствор A: добавить 50 мл 1x Тех буфер и 30 мкл H ₂ O _2; Раствор B: добавить 10 мл метанола и 30 мг 3-хлор-нафтола) в течение 30 мин в темноте. Анализ результатов западные блот колориметрическим.

Results

Проверка выраженных рекомбинантных белков через реактивности со специфическими антителами является важным первым шагом в подтверждении надлежащего складывание выраженных белков. Были выражены рекомбинантные белки малярийные помощью один шаг и два шага в пробирке бесплатных систем экспрессии клеток человека. Рекомбинантные белки очищают методом Ni-хелатный сродства. Затем мы использовали антисыворотки против целых мерозоитов rhoptries в западной блоттинга SDS-PAGE разделенных рекомбинантных белков.

Discussion

Важные шаги для успешного экспрессии белков с использованием двух шаг в пробирке свободного системы экспрессии клеток человека и очистки: 1) успешной амплификации и клонированию генов в pT7CFE-Chis плазмидного вектора; 2) расшифровки РНК на 30 ° ^С; 3) перевод белка при 30 ° С в присутствии ингибитора рибонуклеазы; 4) разрабатывает протокол аффинной очистки на основе смолы с использованием шарики, покрытые Ni и 5) анализ результатов вестерн-блоттинга на использованием поликлональных и моноклональных антител. В...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ступенчатая система in vitro система свободной экспрессии клеток человека	Thermo Fisher	88856	Снята с производства. Всегда хранить при температуре -80 °C. Не размораживать в теплой воде
1-ступенчатую систему in vitro Thermo	fischer	88860	Всегда хранить при температуре -80 °C. Не размораживайте в теплой воде
ProBond Purification System	Invitrogen	K850-01	Хранить в RT
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Хранить при температуре 4oC.
Межгосударственный банк		A+ по	адресу 4 градуса по Цельсию.