Методическая статья

Высокая пропускная способность измерения внеклеточной ДНК-релиз и количественный NET Формирование в нейтрофилах человека In Vitro

DOI:

10.3791/52779

⸱

18 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлены высокопроизводительные анализы, которые в сочетании предоставляют отличные инструменты для количественного определения высвобождения НВЛ из нейтрофилов человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофильные гранулоциты являются наиболее распространенными лейкоцитами в крови человека. Нейтрофилы первыми прибывают на место инфекции. Нейтрофилы развили несколько антимикробных механизмов, включая фагоцитоз, дегрануляцию и образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ). НВЛ состоят из каркаса ДНК, украшенного гистонами и несколькими гранулярными маркерами, включая миелопероксидазу (МПО) и эластазу нейтрофилов человека (HNE). Высвобождение НВЛ – это активный процесс, сопровождающийся характерными морфологическими изменениями нейтрофилов, приводящими к выталкиванию их ДНК во внеклеточное пространство. НВЛ необходимы для борьбы с микробами, но неконтролируемое высвобождение НВЛ было связано с несколькими расстройствами. Чтобы узнать больше о клинической значимости и механизме формирования НВЛ, необходимо иметь надежные инструменты, способные количественно определять НВЛ.

Здесь представлены три метода, которые могут оценить высвобождение НВЛ из нейтрофилов человека in vitro. Первый из них представляет собой высокопроизводительный анализ для измерения высвобождения внеклеточной ДНК из нейтрофилов человека с использованием мембранонепроницаемого ДНК-связывающего красителя. Кроме того, описаны два других метода, способных количественно оценить образование НВЛ путем измерения уровней специфичных для НВЛ комплексов MPO-ДНК и HNE-ДНК. Эти методы на основе микропланшетов в сочетании предоставляют отличные инструменты для эффективного изучения механизма и регуляции образования НВЛ нейтрофилов человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Образование

NET — это новый механизм, с помощью которого нейтрофилы борются с патогенами. 1 Ядром НЭО является ядерная ДНК. 1 Эта сеть ДНК связана с белками и гистонами гранул нейтрофилов. 1 Основная форма образования НВЛ требует гибели нейтрофилов, характеризующейся деконденсацией хроматина, исчезновением зернистых и ядерных мембран, транслокацией эластазы нейтрофилов в ядро, цитруллинированием гистонов и, наконец, разливом НВЛ на основе ДНК. 2 НВЛ захватывают и убивают широкий спектр микробов и являются неотъемлемой частью репертуара врожденного иммунного оружия. Однако неконтролируемое образование НВЛ связано с многочисленными аутовоспалительными заболеваниями. 3,4 Несмотря на их все более установленную актуальность, мало что известно о механизме и регулировании выпуска НЭО.

Нейтрофилы, умирающие при высвобождении НВЛ, отличаются от апоптотических или некротических нейтрофилов. 3,5 Нейтрофилы, высвобождающие НВЛ, демонстрируют ряд особенностей, характерных для образования НВЛ. Компоненты гранул связаны с ДНК в НВЛ. 1 Миелопероксидаза (МПО) и человеческая нейтрофильная эластаза (HNE) обнаруживаются в первичных гранулах в покоящихся клетках, но перемещаются в ядро для связывания с ДНК в НВЛ. 1 Комплексы МПО-ДНК и HNE-ДНК специфичны для НВЛ, не встречаются в апоптотических или некротических нейтрофилах. 1,3,5 Деконденсация хроматина является еще одной особенностью, характерной для нетоза. 2 Высвобождение НВЛ также требует цитруллинирования гистонов пептидиламинидазой 4 (PAD4). 6 Цитруллинированные гистоны являются отличительными признаками нейтрофилов, подвергшихся высвобождению НВЛ. 6

Здесь представлены три метода, которые в сочетании предоставляют отличные инструменты для количественной оценки NET в масштабе с высокой пропускной способностью. Первый анализ был использован в полевых условиях с различными изменениями и количественно определяет высвобождение внеклеточной ДНК в формате микропланшетов. Второй и третий анализы подтверждают наличие НВЛ путем измерения специфичных для НВЛ комплексов MPO-ДНК и HNE-ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Совет Институциональный Обзор Университета штата Джорджия одобрил исследование предмет человека для сбора периферической крови здоровых добровольцев (УЗА # 2012-10769-06). 5,7,8 Добровольцы подписали требуемую форму информированного согласия перед взятия крови. Исследования, проведенные в этой статье, в соответствии с этическими принципами для медицинских исследований с участием человека, закрепленных в Декларации Хельсинки.

1. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека (Рисунок 1)

Примечание: Есть несколько способов, чтобы изолировать нейтрофилов из периферической крови. Следующий протокол обеспечивает одну возможность. Этот протокол дает большое количество неактивированных нейтрофилов человека, способные высвобождать от внешней сетей не стимуляции. Используйте 40 мл цельной крови получали от здоровых добровольцев венопункцией. 7,9

  1. Алиготе 20 мл крови на две 50 мл конические пробирки. Добавляют 10 мл 6% декстрана. Осторожно перемешать.
  2. Через 20 мин передачи лейкоцитарной-RICч верхняя фаза без принятия каких-либо осаждали красных кровяных клеток в чистые 50 мл конические пробирки, и заполнить его стерильной PBS.
  3. Центрифуга при 400 мкг в 10 мин. Ресуспендируют осадок в 4 мл стерильной PBS.
  4. Приготовьте 5-ступенчатый перколлом градиент 85% -80% -75% -70% -65% в двух 15 мл конические пробирки и слой 2 мл лейкоцитарной суспензии на вершине каждого градиента.
  5. Центрифуга 800 мкг в течение 30 мин с тормозами прочь.
  6. Соберите все клетки (нейтрофилы) в слоях на 75% / 80% и 70% интерфейс / 75%.
  7. Вымойте клетки дважды в PBS (350 XG, 10 мин, RT) и подсчет клеток с использованием гемоцитометра.

2. Измерение кинетики внеклеточной ДНК-релиз Использование микропланшетов Флуориметр

Примечание: Этот метод позволяет измерять изменения в флуоресценции мембран непроницаемый для ДНК-связывающего краситель , указывающего высвобождения ДНК на формате микропланшетов 96-луночного (рисунок 2).

  1. Приготовьте суспензию нейтрофилов в аналитической среде (HBSS +1% (об / об) аутологичной сыворотки + 5 мМ глюкозы) в концентрации 2 х 10 6 клеток / мл.
  2. Добавьте 5 мкмоль / л мембраны непроницаемой ДНК-связывающего красителя. Осторожно перемешать.
  3. Аликвотные нейтрофилы человека (50 мкл / лунку) в 96-луночный черный, прозрачный дно микропланшетов. Убедитесь, что анализ среда охватывает всю нижнюю часть скважины. Если нет, то нажмите на пластину аккуратно на стороне.
  4. Нагреть планшет, содержащий нейтрофилы в течение 10 мин при 37 ° С.
  5. В то же время приготовления растворов стимулов при двойном их конечных концентрациях, которые будут использоваться (в 37 ° C теплой среде для анализа). В качестве положительного контроля используют NET нейтрофилов человека с 100 нМ форбол-миристат-ацетата (PMA) в течение 4 часов , чтобы вызвать максимальное высвобождение NET. 5,8 PMA стимуляции в течение 4 ч обеспечивает максимальное высвобождение NET в то время как спонтанное NET образование остается низким 5,8.
  6. Приготовьте микропланшет флуориметра для измерения (4 ч, 37 ° C, 530 нм для возбуждения и 590 нм для эмиссии).
  7. Стимулируют нейтрофилы путем добавления 50 мкл раствора стимул к 50 мкл суспензии нейтрофилов. С помощью 0,5 мкг / мл сапонина в одной скважине для измерения максимального сигнала высвобождения ДНК.
  8. Поместите пластину в считывающее устройство и измерения изменений флуоресценции в течение 4 ч при каждые 2 мин с не встряхивая.
  9. Для анализа данных, вычисляют нормализованные увеличение флуоресценции с течением времени.
    1. Вычитание базовой линии флуоресценции от значений конечных точек для всех скважин , включая сапонины (рис 2А, В). Рост сапонина флуоресценции должен быть самым высоким сигналом. Это называется "максимального высвобождения ДНК" (фиг.2А).
    2. Рассчитать процент высвобождения ДНК в неизвестных образцах путем деления увеличения флуоресценции неизвестных образцов максимального высвобождения ДНК.
    3. Средние результаты повторах и представить их в виде "% максимального высвобождения ДНК" (рис 2С).

3. Количественное NET формывания МРО-ДНК и ДНК-HNE ИФА

Примечание: Эти анализы модифицированного (МРО-ДНК) или установлена ​​(гидроксиноненал-ДНК) в нашей лаборатории количественной оценки NET образования путем измерения уровней МРО-ДНК и комплексов ДНК гидроксиноненал-5.

  1. Шерсть 96-луночного высокой вяжущей способностью ELISA пластины в течение ночи с антителами захвата (50 мкл / лунку): анти-MPO (1: 2000 разведение) или анти-гидроксиноненал (1: 2000).
  2. Мытье ELISA планшеты три раза PBS (200 мкл / лунку) и блокировать их с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% человеческого сывороточного альбумина в течение 2 ч при комнатной температуре (200 мкл / лунку). Промыть три раза PBS.
  3. Семенной нейтрофилы на 96-луночные микропланшеты при плотности 100000 клеток / лунку в 100 мкл среды для анализа, а также стимулировать формирование чистого. Инкубируйте клетки: 4 часа 37 ° C.
  4. Выполните ограниченное ДНКазную пищеварение путем добавления 2 ед / мл ДНКазы к нейтрофильных супернатантов, хорошо перемешать. Храните их при комнатной температуре.
  5. Остановить ДНКазы через 15 мин путем добавления 11 мкл 25 мМ EGTA (конечная концентрация 2,5 мМ). Хорошо перемешать. Собирают суpernatants в чистых микроцентрифужных труб. Образцы Спин, чтобы избавиться от остатков клеток при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Передача их супернатантов в чистые микроцентрифужных труб. Держите их на льду до готовности.
  6. Используйте аликвоту предварительно подготовленную "NET стандарта".
    Примечание: NET-стандарт представляет собой смесь ДНКазы-переваренной супернатантах PMA-стимулированных нейтрофилов, полученных по меньшей мере, 5 различных, независимых людей-доноров.
    1. Для того, чтобы использовать один и тот же стандарт, в течение длительного времени, собирать и аликвоту большой объем нейтрофильных супернатантах от каждого отдельного донора. Сбор, например, 2 мл ДНКазы переваривается супернатантах РМА-стимулированных нейтрофилах приведет к 200 аликвот (10 мкл каждый) достаточно на 200 ELISA пластин. Данные , характеризующие NET стандарт найдены на рисунке 5.
    2. Стимулируют нейтрофилов человека с 100 нМ РМА в течение 4 ч и применять ДНКазы переваривать их супернатантах в соответствии шагов 3,4-3,5.
    3. Сбор, бассейн, аликвоту (10 мкл) и свободногоге (-20 ° C) нейтрофильные супернатанты.
    4. Для приготовления «NET-стандарт", оттепель одну аликвоту / донора, полученного по меньшей мере, пять отдельных доноров, смешать их и держать их на льду.
    5. Откажитесь размороженные образцы и использовать свежие из них для следующего эксперимента.
    6. Подготовьте 1: 2 серийное разведение NET-стандарта в PBS + EGTA.
  7. Развести DNase1-усваиваются образцы (стандартные и неизвестные супернатантов) 20 раз в PBS + EGTA и аликвоту их на ELISA планшеты, покрытые антителами захвата.
  8. Выдержите ELISA пластины в течение ночи при 4 ° С и промойте их три раза PBS.
  9. Нанести раствор антитела обнаружения (100 мкл / лунку): пероксидазу хрена, конъюгированный анти-ДНК-антитела (1: 500, мышь). Выдержите в течение 1 ч в темноте.
  10. После четырех промывок PBS добавляют субстрата пероксидазы TMB: 100 мкл / лунку, 30 мин. Синий окраска является показателем активности пероксидазы (NETS настоящее время).
  11. Остановить реакцию добавлением 100 мкл / лунку 1 М HCl.голубые решения будут желтеть (рис 5А).
  12. Измерить оптическую плотность при 450 нм с использованием микропланшет-фотометр.
  13. Для анализа данных расчета количества МРО-ДНК или комплексов гидроксиноненал-ДНК по сравнению с чистым стандартом.
    1. Вычитание значения оптической плотности фона в среде для анализа из всех образцов.
    2. Участок значения оптической плотности (Х-ось) разбавленных стандартных образцов с их относительной NET контента (Y-ось) (рис 5А).
    3. Используя ненасыщенного диапазон стандартной кривой установить линию тренда (использовать лучше всего подходят экспоненциальную от используемого программного обеспечения) (Рисунок 5А). Уравнение этой линии тренда определяет преобразование значений ОП для количественного количества сетками.
    4. Вставьте измеренные значения ОП неизвестных в уравнении тренда линии от 3.13.3 , которая даст количество НЭО в неизвестном образце в процентах от NET-стандарта (рис 5А).
    5. подсчитыватьсредние повторах (трехкратном повторе) и представить окончательные данные как "количества МРО-ДНК или гидроксиноненал-ДНК комплексов (% от стандарта)" (Рисунок 5С).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цифры , приведенные в этой рукописи описывают метод выделения нейтрофилов, экспериментальных процедур и нынешних представительных результатов с объяснением анализа данных. На рисунке 1 показаны последовательные стадии подготовки человеческого нейтрофилов. Этот протокол представляет собой лишь один из возможных способов выделения нейтрофилов. Это дает большое количество нейтрофилов покоя , способные к высвобождению при стимуляции сетей не . На рисунке 2 п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

НРТ представляют захватывающий новый механизм , с помощью которого нейтрофилы убивают болезнетворные микроорганизмы. 1 Хотя литература НЭО непрерывно расширяется в течение последних десяти лет с момента их открытия, несколько важных вопросов , связанных с их ролью в биологии, механизма и регулирования остаются неясными. Соответствующая методика должна быть разработана для измерения Сетки, этот уникальный антимикробной механизм. В этой статье описаны методы, которые могут быть использованы для количественной о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Особая благодарность персоналу лаборатории Центра здоровья Университета Джорджии за их постоянную поддержку нашей работы по выделению нейтрофилов человека. Эта работа была поддержана стартовым фондом доктора Рады, предоставленным офисом вице-президента UGA по исследованиям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Античеловеческая нейтрофильная эластаза  Кролик Ab Calbiochem4810011:2,000x покрытая
антимиелопероксидаза Ab (Rabbit)Millipore07-4961:2,000x покрытая
ДНКаза-1Roche10-104-159-0011 µ г/мл используется для пищеварения
20 мМ EGTA/PBSSigma-AldrichE3889-25G
2,5 мМ EGTA/PBSSigma-AldrichE3889-25G
Обнаружение гибели клеток ELISA Anti-DNA PODRoche115446750011:500x 
Eon Microplate SpectrophotometerBiotek
Gen5 All-in-One программное обеспечение для микропланшетовBiotekаналитический инструмент (ELISA)
Sytox orangeLife TechnologyS113680,2% конечная концентрация/объем
1 M HepesCellgro25-060-ClИспользуйте 10 мМ конечная концентрация.
1 М глюкозыСигмаИспользуйте 5 мМ конечной концентрации.
HBSSCorning21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3Thermoscientific
PMASigmaP 8139100 нМ окончательное использование
ELISA PlateGreiner bio-one655061
коническими трубками 15 млThermoscientific339650
Конические трубки 50 млТермонаучные339652
Percoll (pH 8,5-9,5) SigmaP 1644Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
DextanSpectrumD1004
RPMI 1640 media CorningCellgro17-105-CV
96 Лунная пробирная пластина черная пластина с прозрачным дномCostar3603

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205(2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MPO DNA ELISAHNE DNA ELISASYTOX OrangePercoll

Похожие статьи