Роза Бенгалия фототромбоза конфокальной оптической томографии В Vivo: Модель одно судно инсульта

Summary

Здесь мы описываем полуинвазивный подход оптической микроскопии для индукции фототромботического сгустка Розовой Бенгалии в соматосенсорной коре мыши in vivo. Описаны технические аспекты процедуры визуализации от индукции фототромботического события до применения и сбора данных.

Abstract

Методы визуализации in vivo стали более широко использоваться из-за последних достижений в области красителей и оптических технологий, что позволяет визуализировать клеточные события у интактного животного. Кроме того, способность вызывать физиологические болезненные состояния, такие как инсульт in vivo, повышает его полезность. Описанная здесь методика позволяет проводить физиологическую оценку клеточных реакций в ЦНС после инсульта и может быть адаптирована для других изучаемых патологических состояний. Представленная методика использует лазерное возбуждение светочувствительного красителя Rose Bengal in vivo для индуцирования очагового ишемического события в одном кровеносном сосуде.

Видеопротокол демонстрирует подготовку черепного окна с тонким черепом над соматосенсорной корой у мыши для индукции фототромботического события Роуз Бенгал, сводя к минимуму повреждение основной твердой мозговой оболочки и мозга. Хирургическая подготовка первоначально выполняется под препарирующим микроскопом с помощью специально изготовленной хирургической/визуализационной платформы, которая затем переносится на конфокальный микроскоп, оснащенный адаптером для перевернутого объектива. Представлены репрезентативные изображения, полученные с использованием этого протокола, а также покадровые последовательности индукции инсульта. Этот метод эффективен тем, что одна и та же область может быть повторно визуализирована в последующие дни, что облегчает продольные исследования in vivo патологических процессов после инсульта.

Introduction

Техника, описанная разрешений визуализация в естественных условиях клеточных реакций сразу же после индукции бенгалроза фототромбоза в неповрежденной мыши. Бенгальский розовый (4,5,6,7-тетрахлор-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) является светочувствительный краситель используется, чтобы вызвать ишемический инсульт в моделях на животных (мыши и крысы). После болюсного введения РБ через хвостовую вену и последующего освещения через разбавлять черепа с 564 нм лазерного света, тромб индукционных вызывая физиологическую инсульт ^1. Метод был впервые описан Розенблюм и Эль-Саббан в 1977 году, а позже была адаптирована Уотсон в середине 1980-х годов ^1,2. Вкратце, бенгальский розовый облучении зеленым светом возбуждения (561 нм лазера в нашем случае), который генерирует выработку активных форм кислорода, которые впоследствии активирует тканевой фактор, инициатор каскада свертывания крови. Индукция каскада коагуляции производит ишемическая леион, патологически отношение к клинической инсульта ^3.

Ход имеет сложную патофизиологию из-за взаимодействия многих типов различных клеток, включая нейроны, глии, эндотелия и иммунной системы. Выбор лучшую технику для изучения частности клеточный процесс требует нескольких соображений. Экспериментальные методы можно в целом разделить на три категории: в пробирке, в естественных условиях и в кремнии с каждой имеющих преимущества и недостатки В пробирке исследования имеют основной недостаток удаления клеток из их естественной среды и, следовательно, не может воспроизвести эффекты, наблюдаемые в неприкосновенности,. живого животного. IN VIVO методы обеспечивают для повышения экспериментальной репликации болезненных состояний с повышенной поступательного значение. В силиконового обычно относится к компьютерному моделированию заболевания или клеточных процессов, и в то время больше используются для изучения потенциальных лекарственных взаимодействий для экзаменаPLE, любая информация, почерпнутые еще должна быть проверена в живых клетках или ткани.

Идеальная модель инсульта в лабораторных условиях должны продемонстрировать аналогичные патологические особенности тем, которые видели в человеческой популяции. В то время как существуют общие физиологические характеристики инсульта в популяции человека, есть также много различий в зависимости от типа травмы испытывал. Инсульт в человеческой популяции происходит в малых или больших окклюзии сосудов, геморрагические поражения и артерии к артерии или сердечно-эмболии, которые приводят к различным объем инфаркта, а также различия в механизмах, связанных с каждой патологии. Преимущество использования модели инсульта животное генерация воспроизводимых инфарктов, которые имитируют характеристики человеческой инсульта. Наиболее распространенные модели на животных инсульта включают окклюзии артерии с помощью: окклюзия средней мозговой артерии (эмболия или эндоваскулярные методы накаливания), какие модели дистального МСАО и модель фототромбоза. ПреимуществаD недостатки каждой модели были рассмотрены в другом месте (см ⁴ и ^5). Глобальные ишемические модели (MCAO), в то время как относительно легко выполнить которые менее отношение к человеческой инсульта, чем координационные модели инсульта. Кроме того, эти методы сильно варьируют в индукции воспроизводимых поражений инфаркт мозга. Фототромбоза модель высокой воспроизводимостью тех пор, пока экспериментатор контролирует их эксперименты также, обеспечивая четкое преимущество над моделей MCAO. Тем не менее, из-за микрососудов оскорбление модель была описана для отображения минимального ишемической полутени, область, где клетки, как полагают, спасти, ^6,7. Кроме того, Вазогенный отек и образование отека цитотоксических также может быть вызвана при облучении области изображения. Несмотря на эти ограничения техника обеспечила новый взгляд на многие физиологические процессы следующих инсульта ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

Примечание: Все процедуры на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных университета Техаса Научного центра здоровья в Сан-Антонио и согласуются с руководящими принципами прибыть.

1. Обезболивающие для корковых Подготовка

1. Наведите в индукции камеры с 2-3% изофлуораном смешивается с кислородом для анестезии. Соблюдайте уменьшение частоты дыхания, как мышь наводится. Зажмите лапу мыши, чтобы определить, является ли мышь готова переехать в носовой конус. Примечание: Уровень наркотизации является важным шагом в любом в естественных условиях подготовки и уход должны быть приняты, чтобы не вызвать уровень, что вызовет глобальную ишемию.
2. После того, как мышь под наркозом достаточно, передать животное в хирургии / платформы визуализации и поместить нос мыши в носовом конусе и применять 1-1,2% изофлуораном поддерживать наркозом состояние. Убедитесь, что мышь лежит на температурнымntrolled грелку, чтобы поддерживать температуру тела (37 ° С +/- 0,5 ° C) в течение оставшихся процедур. Поместите ветеринар мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
3. Монитор физиологию мыши, используя систему оксиметрии импульса, используя хвост или ноги клип, поставляемый с системой. Убедитесь, что частота дыхания поддерживается между 50-65 вдохов / мин. Убедитесь, что частота сердечных сокращений остается между 300 до 450 ударов в минуту и ​​насыщение кислородом поддерживается между 97-98%, чтобы обеспечить долгосрочное выживание животного.
4. Когда мышь адекватно наркозом, брить волосы на черепе с помощью электрические ножницы, удалить остатки волос и чистой бетадином, затем этанолом тампоном. Повторите эту процедуру до трех раз, чтобы обеспечить стерильную хирургическую окружающую среду.

2. Хирургические процедуры

1. С головы полностью очищенную и бритой, сделать 5 мм разрез в коже головы мыши, чтобы выявить черепно fissuВИЭ и найти брегмы.
2. Используйте стерильным ватным аппликатором для удаления оставшихся фасции, покрывающей череп.
3. Клей на заказ кольцо из нержавеющей стали (рис 1) с тканевым клеем к кости, лежащей теменной коры, используя стереотаксических координат брегмы: -1 до -3 мм и боковой: 2-4 мм. Примечание: Клей, как правило, устанавливает в течение 2 мин после размещения кольца на кости.
4. Прикрепите кольцо стереотаксической держателя (рис 2), чтобы стабилизировать мыши и, чтобы предотвратить движение во время съемки.
5. В хирургической сорт рассекает микроскопом, дрель медленно раздел 1-2 мм в черепе, используя скорость контролируется Dremel, как инструмент (Meisinger 3,9 мм сверло), убедившись, чтобы сохранить уровень площадь, как это сверлят. Добиться этого с помощью шаблона зиг-заг. Чтобы избежать перегрева устройства, установите скорость бурения на низкой и делать частые перерывы.
6. При черепно череп становится хоккей в виду, по-прежнему истончениечерепа скальпелем лезвие с использованием той же схеме зигзагообразную сохранить разбавленной уровня поверхности, чтобы облегчить плавное удаление тонких слоев черепной черепа. Использование кончик лезвием скальпеля сделать небольшие линейные штрихи с легким нажимом, чтобы удалить тонкие слои кости, в то время. Продолжайте, пока не сосудистая отчетливо видна через рассекает микроскопом.
7. Если экспериментатор прокалывает через перерыв или череп в процессе прореживания, усыпить животное в связи с вероятной повреждения основного мозга.
   Примечание: черепа мыши примерно 300 мкм в толщину и состоит из двух тонких слоев компактной кости (один внешний и один внутренний слой) и слоем губчатой ​​кости зажатой между двумя слоями компактной кости. Внешний слой компактной кости и большую часть губчатой ​​кости удаляются в 5 мм области бурения, в результате чего приблизительной слоя 50 мкм из компактной кости оставшегося (см Фигура 2В). Visualizвания сосудистой будет гарантировать, что окончательный нетронутыми разбавлять черепа составляет приблизительно 50 мкм в толщину. Череп поэтому все еще присутствует, когда разбавлять этой толщины.

3. Микроскоп Настройка

1. Используйте перевернутую систему микроскопа (обычный, конфокальной или системы двух фотонов), который имеет объективное инвертор. Примечание: Можно также использовать стандартный прямой микроскоп. Ограничивающим фактором будет пространство между сценой и целей. Изменения в стадии могут быть необходимы для выполнения этой установки.
2. Безопасный хирургического / платформы изображений в выполненного на заказ этапе, который расположен в стороне основание микроскопа. Примечание: платформа выполнена с использованием лабораторного домкрата, чтобы вертикальное перемещение хирургическое / визуализации платформы под цели. В лаборатории разъем установлен на пластине, прикрепленной к четырех цилиндрических опор. (Смотрите рисунок 2).
3. Расположите объективную инвертор, содержащий 20XЦель по черепной окна. Используйте внешний источник света, чтобы найти черепной окно, глядя через окуляры микроскопа и положение цели в области изображения. Примечание: Площадь изображения будут обозначаться присутствии сосудистой.
4. Для целей на водной основе, использовать искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) (130 мМ NaCl; 30 мМ KCl; 12 мМ КН ₂ РО _4; 200 мМ NaHCO _3; 30 мМ HEPES и 100 мМ глюкозы) в качестве среды из-за возможного Утечка в полость черепа во время съемки (Рисунок 3).

4. Роза Бенгалия Краска Подготовка, управление и индукции инсульта

1. Подготовьте свежий 20 мг раствора / мл бенгалроза в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF); фильтровать и стерилизовать перед введением. Не используйте и не храните бенгалроза, когда он был смешан. Сделать свежее решение для каждого эксперимента.
2. Дайте 0,1 мл в хвостовую вену инъекцию бенгалроза то время как сконсервирования черепной окно с 561 нм лазера, чтобы гарантировать адекватную введения раствора. Примечание: бенгальский розовый будет визуализирована в течение 5 секунд после инъекции в сосудистую сеть мозга. Весь сосуд должен быть заполнен бенгалроза.
3. После адекватной инъекции красителя бенгальского розового выбрать подходящий сосуд для тромбоза на основе диаметра сосуда (40-80 мкм), чтобы обеспечить воспроизводимость конкретного объема поражения. Различия между артериями и венами, глядя на направлении кровотока: артерии будет двигаться от большего диаметра к судам меньшего диаметра, вены двигаться от меньшего к судам большего диаметра. Это легко сделать с помощью визуализации раз бенгальский розовый вводят.
4. Измените настройку микроскопа следующим образом:
   1. Увеличьте время задержки. Примечание: Это будет зависеть от системы микроскопа быть использованы.
   2. Увеличение мощности лазера до 100%.
   3. Соберите изображения временной последовательности в 1 кадр / сек с помощьюМаксимальная скорость сканирования.
5. Сканирование мышь, пока стабильна сгусток не образуется внутри сосуда. Примечание: Это обычно достигается в течение 5 мин непрерывного сканирования (рисунок 4).
6. После индукции образования сгустка с использованием бенгальского розового, удалить мышь от области изображения обратно в рассекает микроскопом. Осторожно снимите кольцо из нержавеющей стали с черепной черепа. Осмотрите черепной окно для любого кровотечения. Если кровотечение происходит, прекратить эксперимент.
7. Использование 6.0 мононити шов, чтобы закрыть разрез по черепу. Поместите мазь с антибиотиком по линии шва, чтобы предотвратить инфекцию. Вводят Buprenex (0,05 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение трех дней для лечения боли.
8. Верните мышь к камере регенерации после удаления из наркоза до полностью проснулся и свободно двигаться.
9. Вернуться мыши на чистую клетку для дальнейшего расследования в более позднее время.

5, Продольный изображений в последующие дни

1. Применять следующие методы для выполнения продольной томографии в последующие дни после фототромбоза.
   1. Обезболить мыши, как описано в разделе 1 методов.
   2. По адекватной анестезии вновь открыть головы путем удаления любых остаточных швов возобновить кожа, покрывающая ранее пробуренных поле изображения.
   3. Используйте стерильным ватным аппликатором для удаления оставшихся фасции, покрывающей череп.
   4. Клей на заказ кольцо из нержавеющей стали (рис 1) с тканевым клеем к кости, лежащей предыдущее поле изображения.
   5. Прикрепите кольцо стереотаксической держателя (рис 2), чтобы стабилизировать мыши и, чтобы предотвратить движение во время съемки.
   6. Найдите сосудистую, лежащий в основе ранее утонченную череп. Используйте хвостовую вену инъекцию FITC-декстрана, чтобы проверить наличие ранее индуцированного сгустка.
   7. Используйте 6.0 мононити шов, чтобы закрыть инcision по черепу. Поместите мазь с антибиотиком по линии шва, чтобы предотвратить инфекцию. Вводите Buprenex (0,05 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение трех дней для лечения боли.
   8. Верните мышь к камере регенерации после удаления из наркоза до полностью проснулся и свободно двигаться.

6. Проверка хода индукции (Посмертное)

1. В заключение исследования, проверить объем хода, используя хлорид окрашивание (TTC) 2,3,5-трифенилтетразолия, как показано на рисунке 5. Полный метод может быть найден в ^12.

Results

Целью этого метода было вызвать ишемический инсульт в моделях на животных (мыши и крысы) после болюсной инъекции RB через хвостовую вену и последующего освещения разбавленной черепа с 561 нм лазерного света. Изображения на рисунке 4 показывают прогрессирование образования сгустка в пределах одного судна при облучении в области 0, 1, 1,5 и 2 мин. До образования сгустка все судно белый из-за сыпучий бенгалроза. После индукции облучения сосуда существует очевидная потемнение частей судна и указывает на инд...

Discussion

Возможность перевести экспериментальный хода патофизиологии от животного к человеку заявка была сталкивается с неудачей. Тем не менее, использование моделей животных, таких как модели фототромбоза, позволяет улучшить понимание хода патофизиологии и исследование новых терапевтических подходов, чтобы обеспечить нейропротекции после инсульта. Маленькие штрихи корковых и microinfarctions произведенные фототромботической модели клинически значимых субклинического или "тихой" инсульт ^13-15, который имеет ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагенты
Роза Бенгал	Сигма	330000
Изофлуран Анестетик	MWI Ветеринарный запас	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ<суб>2PO<суб>4, 2 мМ MgCl<суб>2, 2 мМ CaCl<суб>2, 10 мМ глюкозы и 26 мМ NaHCO<суб>3 (рН 7,4).
[header]
Оборудование
Ножницы для препарирования	Биопромышленные изделия	500-410
Операционные ножницы 14 см	Биопромышленные изделия	12-055
Щипцы Dumont High Tech #5 стиль, прямые	Биопромышленные продукты	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Платформа для Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Держатель для ушей из стереотаксической установки	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Аппарат для анестезии грызунов	DRE, Inc.	15001
Техно IV Изофлуран испаритель	DRE, Inc.	34001
F Канистра с воздухом	DRE, Inc	80120
Дыхательная трубка для баллона	DRE, Inc	86111B
Адаптер для грызунов для трубки	DRE, Inc	891000
O2 регулятор для кислородных баллонов	DRE, Inc	CE001E
Индукционная камера для грызунов	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in с иглой P-3	Шовный материал Express	1639G
Объектив инвертор Оптический адаптер	LSM технологии
Foredom дрель Dual voltage 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 мм сверло	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)