Резюме

Роза Бенгалия фототромбоза конфокальной оптической томографии<em> В Vivo</em>: Модель одно судно инсульта

Published: June 23, 2015
doi:

Резюме

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

Техника, описанная разрешений визуализация в естественных условиях клеточных реакций сразу же после индукции бенгалроза фототромбоза в неповрежденной мыши. Бенгальский розовый (4,5,6,7-тетрахлор-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) является светочувствительный краситель используется, чтобы вызвать ишемический инсульт в моделях на животных (мыши и крысы). После болюсного введения РБ через хвостовую вену и последующего освещения через разбавлять черепа с 564 нм лазерного света, тромб индукционных вызывая физиологическую инсульт 1. Метод был впервые описан Розенблюм и Эль-Саббан в 1977 году, а позже была адаптирована Уотсон в середине 1980-х годов 1,2. Вкратце, бенгальский розовый облучении зеленым светом возбуждения (561 нм лазера в нашем случае), который генерирует выработку активных форм кислорода, которые впоследствии активирует тканевой фактор, инициатор каскада свертывания крови. Индукция каскада коагуляции производит ишемическая леион, патологически отношение к клинической инсульта 3.

Ход имеет сложную патофизиологию из-за взаимодействия многих типов различных клеток, включая нейроны, глии, эндотелия и иммунной системы. Выбор лучшую технику для изучения частности клеточный процесс требует нескольких соображений. Экспериментальные методы можно в целом разделить на три категории: в пробирке, в естественных условиях и в кремнии с каждой имеющих преимущества и недостатки В пробирке исследования имеют основной недостаток удаления клеток из их естественной среды и, следовательно, не может воспроизвести эффекты, наблюдаемые в неприкосновенности,. живого животного. IN VIVO методы обеспечивают для повышения экспериментальной репликации болезненных состояний с повышенной поступательного значение. В силиконового обычно относится к компьютерному моделированию заболевания или клеточных процессов, и в то время больше используются для изучения потенциальных лекарственных взаимодействий для экзаменаPLE, любая информация, почерпнутые еще должна быть проверена в живых клетках или ткани.

Идеальная модель инсульта в лабораторных условиях должны продемонстрировать аналогичные патологические особенности тем, которые видели в человеческой популяции. В то время как существуют общие физиологические характеристики инсульта в популяции человека, есть также много различий в зависимости от типа травмы испытывал. Инсульт в человеческой популяции происходит в малых или больших окклюзии сосудов, геморрагические поражения и артерии к артерии или сердечно-эмболии, которые приводят к различным объем инфаркта, а также различия в механизмах, связанных с каждой патологии. Преимущество использования модели инсульта животное генерация воспроизводимых инфарктов, которые имитируют характеристики человеческой инсульта. Наиболее распространенные модели на животных инсульта включают окклюзии артерии с помощью: окклюзия средней мозговой артерии (эмболия или эндоваскулярные методы накаливания), какие модели дистального МСАО и модель фототромбоза. ПреимуществаD недостатки каждой модели были рассмотрены в другом месте (см 4 и 5). Глобальные ишемические модели (MCAO), в то время как относительно легко выполнить которые менее отношение к человеческой инсульта, чем координационные модели инсульта. Кроме того, эти методы сильно варьируют в индукции воспроизводимых поражений инфаркт мозга. Фототромбоза модель высокой воспроизводимостью тех пор, пока экспериментатор контролирует их эксперименты также, обеспечивая четкое преимущество над моделей MCAO. Тем не менее, из-за микрососудов оскорбление модель была описана для отображения минимального ишемической полутени, область, где клетки, как полагают, спасти, 6,7. Кроме того, Вазогенный отек и образование отека цитотоксических также может быть вызвана при облучении области изображения. Несмотря на эти ограничения техника обеспечила новый взгляд на многие физиологические процессы следующих инсульта 8, 9, 10, 11.

протокол

Примечание: Все процедуры на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных университета Техаса Научного центра здоровья в Сан-Антонио и согласуются с руководящими принципами прибыть. 1. Обезболивающие для корковых Подготовка Наведите в индукции камеры с 2-3% изофлуораном смешивается с кислородом для анестезии. Соблюдайте уменьшение частоты дыхания, как мышь наводится. Зажмите лапу мыши, чтобы определить, является ли мышь готова переехать в носовой конус. Примечание: Уровень наркотизации является важным шагом в любом в естественных условиях подготовки и уход должны быть приняты, чтобы не вызвать уровень, что вызовет глобальную ишемию. После того, как мышь под наркозом достаточно, передать животное в хирургии / платформы визуализации и поместить нос мыши в носовом конусе и применять 1-1,2% изофлуораном поддерживать наркозом состояние. Убедитесь, что мышь лежит на температурнымntrolled грелку, чтобы поддерживать температуру тела (37 ° С +/- 0,5 ° C) в течение оставшихся процедур. Поместите ветеринар мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Монитор физиологию мыши, используя систему оксиметрии импульса, используя хвост или ноги клип, поставляемый с системой. Убедитесь, что частота дыхания поддерживается между 50-65 вдохов / мин. Убедитесь, что частота сердечных сокращений остается между 300 до 450 ударов в минуту и ​​насыщение кислородом поддерживается между 97-98%, чтобы обеспечить долгосрочное выживание животного. Когда мышь адекватно наркозом, брить волосы на черепе с помощью электрические ножницы, удалить остатки волос и чистой бетадином, затем этанолом тампоном. Повторите эту процедуру до трех раз, чтобы обеспечить стерильную хирургическую окружающую среду. 2. Хирургические процедуры С головы полностью очищенную и бритой, сделать 5 мм разрез в коже головы мыши, чтобы выявить черепно fissuВИЭ и найти брегмы. Используйте стерильным ватным аппликатором для удаления оставшихся фасции, покрывающей череп. Клей на заказ кольцо из нержавеющей стали (рис 1) с тканевым клеем к кости, лежащей теменной коры, используя стереотаксических координат брегмы: -1 до -3 мм и боковой: 2-4 мм. Примечание: Клей, как правило, устанавливает в течение 2 мин после размещения кольца на кости. Прикрепите кольцо стереотаксической держателя (рис 2), чтобы стабилизировать мыши и, чтобы предотвратить движение во время съемки. В хирургической сорт рассекает микроскопом, дрель медленно раздел 1-2 мм в черепе, используя скорость контролируется Dremel, как инструмент (Meisinger 3,9 мм сверло), убедившись, чтобы сохранить уровень площадь, как это сверлят. Добиться этого с помощью шаблона зиг-заг. Чтобы избежать перегрева устройства, установите скорость бурения на низкой и делать частые перерывы. При черепно череп становится хоккей в виду, по-прежнему истончениечерепа скальпелем лезвие с использованием той же схеме зигзагообразную сохранить разбавленной уровня поверхности, чтобы облегчить плавное удаление тонких слоев черепной черепа. Использование кончик лезвием скальпеля сделать небольшие линейные штрихи с легким нажимом, чтобы удалить тонкие слои кости, в то время. Продолжайте, пока не сосудистая отчетливо видна через рассекает микроскопом. Если экспериментатор прокалывает через перерыв или череп в процессе прореживания, усыпить животное в связи с вероятной повреждения основного мозга. Примечание: черепа мыши примерно 300 мкм в толщину и состоит из двух тонких слоев компактной кости (один внешний и один внутренний слой) и слоем губчатой ​​кости зажатой между двумя слоями компактной кости. Внешний слой компактной кости и большую часть губчатой ​​кости удаляются в 5 мм области бурения, в результате чего приблизительной слоя 50 мкм из компактной кости оставшегося (см Фигура 2В). Visualizвания сосудистой будет гарантировать, что окончательный нетронутыми разбавлять черепа составляет приблизительно 50 мкм в толщину. Череп поэтому все еще присутствует, когда разбавлять этой толщины. 3. Микроскоп Настройка Используйте перевернутую систему микроскопа (обычный, конфокальной или системы двух фотонов), который имеет объективное инвертор. Примечание: Можно также использовать стандартный прямой микроскоп. Ограничивающим фактором будет пространство между сценой и целей. Изменения в стадии могут быть необходимы для выполнения этой установки. Безопасный хирургического / платформы изображений в выполненного на заказ этапе, который расположен в стороне основание микроскопа. Примечание: платформа выполнена с использованием лабораторного домкрата, чтобы вертикальное перемещение хирургическое / визуализации платформы под цели. В лаборатории разъем установлен на пластине, прикрепленной к четырех цилиндрических опор. (Смотрите рисунок 2). Расположите объективную инвертор, содержащий 20XЦель по черепной окна. Используйте внешний источник света, чтобы найти черепной окно, глядя через окуляры микроскопа и положение цели в области изображения. Примечание: Площадь изображения будут обозначаться присутствии сосудистой. Для целей на водной основе, использовать искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) (130 мМ NaCl; 30 мМ KCl; 12 мМ КН 2 РО 4; 200 мМ NaHCO 3; 30 мМ HEPES и 100 мМ глюкозы) в качестве среды из-за возможного Утечка в полость черепа во время съемки (Рисунок 3). 4. Роза Бенгалия Краска Подготовка, управление и индукции инсульта Подготовьте свежий 20 мг раствора / мл бенгалроза в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF); фильтровать и стерилизовать перед введением. Не используйте и не храните бенгалроза, когда он был смешан. Сделать свежее решение для каждого эксперимента. Дайте 0,1 мл в хвостовую вену инъекцию бенгалроза то время как сконсервирования черепной окно с 561 нм лазера, чтобы гарантировать адекватную введения раствора. Примечание: бенгальский розовый будет визуализирована в течение 5 секунд после инъекции в сосудистую сеть мозга. Весь сосуд должен быть заполнен бенгалроза. После адекватной инъекции красителя бенгальского розового выбрать подходящий сосуд для тромбоза на основе диаметра сосуда (40-80 мкм), чтобы обеспечить воспроизводимость конкретного объема поражения. Различия между артериями и венами, глядя на направлении кровотока: артерии будет двигаться от большего диаметра к судам меньшего диаметра, вены двигаться от меньшего к судам большего диаметра. Это легко сделать с помощью визуализации раз бенгальский розовый вводят. Измените настройку микроскопа следующим образом: Увеличьте время задержки. Примечание: Это будет зависеть от системы микроскопа быть использованы. Увеличение мощности лазера до 100%. Соберите изображения временной последовательности в 1 кадр / сек с помощьюМаксимальная скорость сканирования. Сканирование мышь, пока стабильна сгусток не образуется внутри сосуда. Примечание: Это обычно достигается в течение 5 мин непрерывного сканирования (рисунок 4). После индукции образования сгустка с использованием бенгальского розового, удалить мышь от области изображения обратно в рассекает микроскопом. Осторожно снимите кольцо из нержавеющей стали с черепной черепа. Осмотрите черепной окно для любого кровотечения. Если кровотечение происходит, прекратить эксперимент. Использование 6.0 мононити шов, чтобы закрыть разрез по черепу. Поместите мазь с антибиотиком по линии шва, чтобы предотвратить инфекцию. Вводят Buprenex (0,05 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение трех дней для лечения боли. Верните мышь к камере регенерации после удаления из наркоза до полностью проснулся и свободно двигаться. Вернуться мыши на чистую клетку для дальнейшего расследования в более позднее время. 5, Продольный изображений в последующие дни Применять следующие методы для выполнения продольной томографии в последующие дни после фототромбоза. Обезболить мыши, как описано в разделе 1 методов. По адекватной анестезии вновь открыть головы путем удаления любых остаточных швов возобновить кожа, покрывающая ранее пробуренных поле изображения. Используйте стерильным ватным аппликатором для удаления оставшихся фасции, покрывающей череп. Клей на заказ кольцо из нержавеющей стали (рис 1) с тканевым клеем к кости, лежащей предыдущее поле изображения. Прикрепите кольцо стереотаксической держателя (рис 2), чтобы стабилизировать мыши и, чтобы предотвратить движение во время съемки. Найдите сосудистую, лежащий в основе ранее утонченную череп. Используйте хвостовую вену инъекцию FITC-декстрана, чтобы проверить наличие ранее индуцированного сгустка. Используйте 6.0 мононити шов, чтобы закрыть инcision по черепу. Поместите мазь с антибиотиком по линии шва, чтобы предотвратить инфекцию. Вводите Buprenex (0,05 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение трех дней для лечения боли. Верните мышь к камере регенерации после удаления из наркоза до полностью проснулся и свободно двигаться. 6. Проверка хода индукции (Посмертное) В заключение исследования, проверить объем хода, используя хлорид окрашивание (TTC) 2,3,5-трифенилтетразолия, как показано на рисунке 5. Полный метод может быть найден в 12.

Representative Results

Целью этого метода было вызвать ишемический инсульт в моделях на животных (мыши и крысы) после болюсной инъекции RB через хвостовую вену и последующего освещения разбавленной черепа с 561 нм лазерного света. Изображения на рисунке 4 показывают прогрессирование образования сгус?…

Discussion

Возможность перевести экспериментальный хода патофизиологии от животного к человеку заявка была сталкивается с неудачей. Тем не менее, использование моделей животных, таких как модели фототромбоза, позволяет улучшить понимание хода патофизиологии и исследование новых терапевтичес?…

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.

Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.

Materials

Reagents
Rose Bengal Sigma 330000
Isoflurane Anesthetic MWI Veterinary Supply 088-076
Vetbond 1469SB 1469SB
aCSF  126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
[header]
Equipment
Dissecting Scissors Bioindustrial Products 500-410
Operating scissors 14 cm Bioindustrial Products 12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight Bioindustrial Products TWZ-301.22
LabJack 132X80 Optosigma Co 123-6670
Platform for Labjack 8X 8 Optosigma Co 145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup Stoelting/Cyborg 51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine DRE, Inc. 15001
Tech IV Isoflurane vaporizer DRE, Inc. 34001
F Air Canister DRE, Inc 80120
Bain circuit breathing tube DRE, Inc 86111B
Rodent adapter for bain tube DRE, Inc 891000
O2 regulator for oxygen tanks DRE, Inc CE001E
Rodent induction chamber DRE, Inc 15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle Suture Express 1639G
Objective inverter Optical Adapter LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120 Foredom 134.53

Ссылки

  1. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
  2. Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40, 320-328 (1977).
  3. Owens, A. P., Mackman, N. Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque. Thrombosis Research. 129, S30-S33 (2012).
  4. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).
  5. . . Manual of stroke models in rats. , (2009).
  6. Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow. Brain Research. 791, 223-228 (1998).
  7. Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).
  8. Zheng, W., et al. Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria. PloS One. 5, e14401 (2010).
  9. Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2. Y. 1. R. -. i. n. i. t. i. a. t. e. d. IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).
  10. Witte, O. W., Stoll, G. Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity. Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).
  11. Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction. Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).
  12. Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
  13. Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).
  14. Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).
  15. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365 (2007).
  16. Blum, S., et al. Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter. Neurology. 78, 38-46 (2012).
  17. Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns. Neurology. 50, 341-350 (1998).
  18. Wardlaw, J. What causes lacunar stroke. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).
  19. Inoue, Y., et al. Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku. Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).
  20. Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis. American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).
  21. Head, B. P., Patel, P. Anesthetics and brain protection. Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).
  22. Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects. International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).
  23. Koerner, I. P., Brambrink, A. M. Brain protection by anesthetic agents. Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).
  24. Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats. Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).
  25. Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke. Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).
  26. Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6, 511-512 (2009).

Play Video

Cite This Article
Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. J. Vis. Exp. (100), e52794, doi:10.3791/52794 (2015).

View Video