Методическая статья

Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя В Vivo И In Vitro Анализы

DOI:

10.3791/52795

⸱

9 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center Growth and Signaling, INSERM U845, Institut Cochin, 2Unit for Biology of Lymphocyte Populations, Immunology Department, Institut Pasteur and CIMI, Unity of Treg Biology and Therapy, University of Pierre & Marie Curie, 3Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U668, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается методология in vivo и in vitro для характеристики предшественников заселения тимуса путем анализа кинетики генерации, фенотипа и количества их потомства Т-клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеризуя тимуса урегулирования предшественники важно понять заранее тимуса этапы развития Т-клеток, важно разработать стратегии для замены Т-клеток в lymphopenic пациентов. Мы изучили тимуса осаждения предшественников из мышиных эмбриональных день 13 и 18 thymi двумя дополнительными в пробирке и в естественных методов, как на основе метода "висячей капли". Этот метод позволил колонизации облученных плода тимуса долей с E13 и E18 / или тимуса предшественников отличаются CD45 allotypic маркеров и таким образом их потомства следующие. Колонизация смешанным населением позволяет анализировать клетки автономные различия в биологических свойств клеток-предшественников, а колонизация или населения удаляет возможные конкурентные давление отбора. Колонизированных тимуса долей также могут быть привиты в иммунодефицитных мышей-самцов-реципиентов, позволяющих анализа зрелого Т-клеток потомства в естественных условиях, например, динамики популяций Тон периферической иммунной системы и колонизации различных органов и тканей. Эмбриональные тимуса культуры органов показало, что E13 предшественники быстро превратился всех зрелых CD3 + клеток и привело к канонической подмножества γδ Т-клеток, известный как дендритные эпителиальные Т-клеток. Для сравнения, E18 предшественники имеют отсроченный дифференциации и были не в состоянии генерировать дендритные эпителиальные Т-клетки. Контроль периферической крови тимуса привитым CD3 - / - мышей показали также, что Е18 тимуса отстойные предшественники генерации, со временем, большее число зрелых Т-клеток, чем их коллеги E13, особенность, которая не может быть оценена в краткосрочной перспективе тимуса плода органов культуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-лимфоциты, несущие на αβ или γδ T-клеточный рецептор (TCR), дифференцироваться в специальный орган, тимус. Полностью разработан тимус состоит из двух отдельных регионов: коры, где тимуса предшественники развивать и где тимоциты, что продуктивно переставить TCR β и α генов цепи спасенных от запрограммированной смерти (процесс, известный как позитивной селекции); и мозговое вещество, где выбрана тимоцитов слишком сильной реактивности самоуправлениям лигандов удаляются (негативный отбор) 1,2. Тимуса происходит из эндодермы слоем третьего глотки мешок, который позже в окружении мезенхимальных клеток 3. Это колонизирована гемопоэтических клеток-предшественников, начиная с эмбриональный день E12 и, после этого, непрерывный набор необходимого для развития Т-клеток нормального 4. Тимуса иммигранты развиваться через последовательные стадии развития, организованы жестко регулируется программе, инициированной и почтаntained по активации сигнального пути Notch на тимоцитов при взаимодействии с его лигандом, дельта, как 4, экспрессируется на эпителиальных клетках тимуса (ТИК) 5.

Развитие тимоцитов начинается в так называемой CD4 - CD8 - дважды отрицательный (DN) этапов. DN тимоцитов может быть далее подразделены в соответствии с выражением CD25 и CD44 в DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) и DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) и CD117 (с-Kit), дополнительно подразделяет отсек dN1 в 5 подмножеств, где DN1a и б соответствуют ранних предшественников тимуса (ETP). Тимоциты переставить TCR δ, β и α цепей на стадии DN и пройти предварительную TCR выбор (DN3-DN4 стадии). Они также транзит в CD4 + CD8 + двойной положительный (ДП) отсеке TcR α цепь переставляет до положительного и отрицательного Селеие. На этом этапе большинство тимоцитов устранены, и лишь небольшой процент (3-5%) достигают CD4 + или CD8 + Т-клеток зрелых отсек.

Лимфоидной дифференциация путь проходит через этапы, которые генерируют ГСК мультипотентные предшественники (MPP) и лимфоидных грунтовка мультипотентные предшественники (LMPP), которые потеряли эритроцитов и мегакариоцитов потенциальную 6. LMPP фенотипически определяется отсутствием дифференцированных клеток крови маркеров (род отрицательным, Лин -), выражение с-Kit (CD117), SCA-1 и Flt3 / Flk2 (CD135) и отсутствие заметных уровней интерлейкина ( Иллинойс) -7-рецептор α цепи (ИЛ-7rα или CD127). LMPPs дальнейшей дифференциации в общих лимфоидных клеток-предшественников (CLP) 7, которые на этом этапе потеряли способность генерировать миелоидных клеток. CLP сохранить лимфоцитов (B и Т-клетки), NK клетки, DC и врожденная лимфоидной клетки (ILC) потенциал, и отличаются от LMPP по выражению CD127 и отсутствие высоких уровней SCA-1.

Хотя природа тимуса урегулирования предшественников (TSP) был широко обсуждается 8, стало ясно, что в последнее время ТСП изменение фенотипа, дифференциация потенциал и функция, на протяжении развития 9. Мы выступали в пробирке и в естественных условиях анализов для характеристики ПБО, изолированных на FACS сортировки клеток или от E13 (первая волна) или E18 (вторая волна). Эмбриональные тимуса культуры органов (FTOC) с долей тимуса облученных колонизированных равных чисел E13 E18 и предшественников, несущих различные маркеры allotypic, разрешенных после их потомства в аналогичной среде развития и выявленных внутренние свойства клеток, различные между двумя типами клеток-предшественников. Тимуса долей, колонизированных или E13 или E18 TSP позволило развитие без выбора из-за конкуренции между двумя предшественников. В естественных условиях трансплантация колонизированных тимуса долях показали также, что также тон зрелый потомство E13 E18 и ТСП имеют различные биологические свойства в естественных условиях. TSPS от первой волны быстро генерировать Т-клетки, но приводят к низкой численности αβ и γδ Т-клеток. Среди последних мы обнаружили Vγ5Vδ1 дендритные эпителиальные клетки Т (DETC), которые имеют инвариант TcR, мигрируют в эпидермис, где они оказывают функцию в заживлении ран и производятся только во время эмбрионального развития 10. В отличие от этого, ТСП ​​от второй волны занять больше времени, чтобы произвести большое число TcR + Т-клеток и не в состоянии генерировать DETC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: все эксперименты проводились в соответствии с Институтом Пастера этики Устава, утвержденного Министерством сельского хозяйства Франции, и с директивами ЕС. Манипулятор с обучением на небольшой операции грызунов, заверенная французского министерства сельского хозяйства, выполняет все хирургические вмешательства.
ПРИМЕЧАНИЕ: См в приложении таблице 1 показаны процедуры 5-ступенчатую плана.

1. Выбор эмбрионов

  1. Используйте 36 C57BL / 6 CD45.2 женщин, 12 женщины CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 мужчин и 12 C57BL / 6 CD45.2 мужчин. Пересечение самок либо с мужской генотип будет производить эмбрионы CD45.1 / 2 и CD45.1 используется в качестве источника TSP или CD45.2 используемого в качестве источника получателей тимуса долей. Дом все мужчины отдельности.
  2. Для получения эмбрионов для изоляции E18 TSP, 2 место самок в клетке с одной мужской CD45.1 в 6 часов вечера, 21 дней до эксперимента прививки. Проверьте наличие вагинальной пробки следующий день, до полудня. SepaОцените подключенный самок.
  3. Для получения эмбрионов E14 быть колонизирована TSP, повторите процедуру, описанную выше (1,2), используя самцов CD45.2, за 17 дней до эксперимента прививки.
  4. Для получения эмбрионов, чтобы изолировать E13 TSP, повторите процедуру, описанную выше (1,2), используя самцов C57BL / 6 CD45.1, 16 дней до эксперимента прививки.

2. Рассечение эмбрионов Под горизонтальной ламинарного потока Hood

ПРИМЕЧАНИЕ: За два дня до эксперимента прививки.

  1. Жертвоприношение беременных путем смещения шейных позвонков или прогрессивной администрации СО 2 в течение по меньшей мере 5 мин, в закрытой камере насыщения. Убедитесь, смерть окончательного ареста сердечно-дыхательных движений. Намочите живота с 70% этанола.
  2. Сделайте продольный разрез в коже в средней линии живота и откройте его, потянув кожу друг от друга. Откройте брюшины щипцами и ножницами, не касаясь пищеварительный тракт. Вытяните бифидобактерий Uterнам и отделить его от влагалища с ножницами.
  3. Поместите матку в 90 х 15 мм чашки Петри, содержащей 40-50 мл DPBS и сократить трансверсально между децидуальной каждого эмбриона.
  4. С парой тонких ножниц наконечником и тонких щипцов удалить мышечную оболочку матки, вынуть эмбрионов путем разрезания между плацентой и желточного мешка, и снимите amnios, который подпорных эмбрионов.
  5. Поместите эмбрионов в чашке Петри 90 х 15 мм, содержащие HBSS + 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Для эмбрионы старше E15, удалить головы с ножницами перед дальнейшей диссекции.

3. Выделение тимуса

  1. Под увеличительным стеклом бинокулярного, поместите эмбриона, лежа в положении лежа на спине (вид снизу), на мокрой марли постельные принадлежности.
  2. Вставьте один пинцет в продольном направлении вдоль хряща грудины, зажать и открыть грудной сетку. С изогнутыми щипцами, тянуть грудной стенки в сторону, чтобы визуализировать тhymic выступов на каждой стороне трахеи.
  3. Тщательно провести каждый лепесток, зажимая под с тонким пинцетом и поместить их в чашку Петри, содержащую 1 мл HBSS + 1% FCS. Изолировать мочки и удалить соединительную ткань, окружающую с двумя 1 мл шприцев + 26 г ⅜ "иглы, не повреждая капсулу.
  4. Промыть долей в 3 мл HBSS + 1% FCS, чтобы устранить клетки крови.
    Примечание: Перед E15, тимуса лопасти расположены на каждой стороне трахеи и последующего предохранителей в середине, чтобы составить би-долевой орган.

4. Клеточные суспензии

  1. Дразнить кроме мочки под бинокулярной лупой, с двумя иглами 26 G, установленных на 1 мл шприцы, в HBSS + 1% FCS. Фильтр клеточной суспензии через нейлоновое сито.

5. Окрашивание флуоресцентными антителами и сортировки клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела ранее титруют для получения оптимального определение популяции (titratион может меняться в зависимости от партии антител).

  1. Инкубируйте тимоцитов (E13 или E18) в течение 15-30 мин при 4 ° С с 100 мкл коктейля биотинилированных антител для окрашивания клональные положительных клеток (анти-CD19, анти-Gr1, анти-Ter119, анти-NK1.1 , анти-CD11c, анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25).
  2. Смыть избытка антител спин вниз трубы с 4 мл HBSS + 1% FCS в 280 мкг в течение 7 минут, устранить супернатант и ресуспендирования осадка в пресной HBSS + 1% FCS. Повторите центрифугирования.
  3. Инкубируйте биотин-меченых клеток E18 стрептавидином микросфер в течение 15 мин при 4 ° С и промыть клетки дважды HBSS в 1% FCS. Повторное приостановить клеток в 2 мл HBSS + 1% FCS. Большинство тимоциты E13 являются Lineage отрицательным и, следовательно, не нужно MACS обогащение до сортировки клеток.
  4. Pass клеток на колонке LS, в соответствии с инструкциями изготовителя. Когда все клеточной суспензии введен в столбце добавить 2 мл HBSS + 1% FCS. Восстановление4 мл колонке течь через центрифугу и клетки в течение 7 минут при 280 х г.
  5. Повторное приостановить гранул либо обедненным E18 или E13 общего тимоцитов в 50 мкл смеси антител TSP (анти-CD117 APC, анти-CD135 ПЭ, анти-CD127 PECy7, анти-CD24 FITC, анти-CD44 APCCy7 и стрептавидином Pacific Blue ) и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
  6. Вымойте клеток с 4 мл HBSS + 1% FCS и вновь приостановить клеток в 1 мл HBSS + 1% FCS с пропидийиодидом.
  7. Сортировать TSPS Лин - CD44 + CD117 + CD24 + CD127 низкий CD135 + клеток в FACS (с 4 лазеров) на 1,5 мл пробирки, содержащие 200 мкл полной среды + 20% FCS. Ворота первые клетки в зависимости от их размера и степени детализации на FSC и SSC каналов. Устранить мертвые клетки (окрашивание пропидийиодидом), ворота из дублеты и забить флуоресценцию в показательных масштабах. Около 100 или 600 TSPS могут быть получены из одного E13 или E18 одной тимуса, respectivЭли.

6. Колонизация E14 тимуса Лопасти с прародителей: капля крови Техника

  1. Облучают (30 Грейс = 30 Гр) E14 тимуса долей от эмбрионов CD45.2, 3 ч до культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: E14 E15 или тимуса доли были успешно использованы в качестве получателя Т-клеток-предшественников. Использование получателей тимуса долей поздних гестационный дней приводит преждевременной некроза в связи с большим размером органа, а тимуса долей на более ранних сроках беременности дней развиваются слабо, вероятно, из-за неполного развития эпителиальных клеток.
  2. Центрифуга сортируются ОТУ и повторно приостанавливать клеток в культуральной среде (OPTI-MEM полной среде с 10% FCS, пенициллина (50 единиц / мл), стрептомицин (50 мкг / мл) и 2β-меркаптоэтанола (50 мкм)), таких, что 35 мкл содержит 500 ПБО.
  3. Поместите каплю 35 мкл клеточной суспензии и каждый из 60 также Тарасаки пластины.
    Примечание: 35 мкл капли могут сливаться, если они размещены в смежных скважин.
  4. Поместите один лепесток облученного на поверхности каждой капли. Закройте TERASAKI пластину и поверните пластину вниз, чтобы клетки достигают апикальной полюс капли под действием силы тяжести.
  5. Хит осторожно верхняя сторона перевернутой пластиной, чтобы заставить лопасти, чтобы скользить к апикальной краю капли. Инкубируйте перевернутой Тарасаки пластины в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч при 37 ° C ± 5% CO 2. После колонизации, либо культуры E14 thymi в FTOC 7 или трансплантата под почечную капсулу реципиентной взрослой мыши 8.

7. эмбрионального тимуса Орган Культура

  1. Поместите 3 мл полной среды на 35 мм чашки Петри. Разместить isopore мембранный фильтр с плавающей на носителе. Поместите восстановленные долей на краю мембраны с пинцетом (не более 8 выступов на одной мембраны).
  2. Поместите чашки Петри, содержащие тимуса долей в чашку Петри 90 мм, вместе с 35-мм блюдо, без крышки, содержащую 2 мл водоснаг, чтобы обеспечить оптимальную влажность. Выдержите 12 дней при 37 ° C ± 5% CO 2.

8. Прививки Под почечную капсулу в стерильных условиях

Примечание: паренхима почек окружена соединительной ткани, образующего капсулу. Суб-капсульного область особенно богата кровеносными и лимфатическими сосудами, таким образом, обеспечивая благоприятную среду для развития трансплантатов (например тимуса долей, панкреатических островков или новорожденных сердца). Трансплантаты обычно делается на левой почки, потому что это более доступным, чем правой почки. CD3 - / - мышей-самцов были использованы в качестве получателей, таким образом, избежать РТПХ из-за незначительных антигенов гистосовместимости, связанных с Y-хромосоме, потому что определение пола, прежде чем E15 не легко сделать.

  1. Стерилизовать инструменты и носить стерильные перчатки вдоль хирургии. Обезболить мышь, внутрибрюшинной инъекции раствора кетамина 10 мг / мл + Ксилазин 1 мг /мл разведенного в PBS: (от 50 до 100 мкл на 10 г веса тела), используя 1 мл шприц. Проверьте анестезии, проверяя отсутствие межпальцевых рефлексов. Поместите каплю гидро-Optimune геля на каждый глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: решение должно быть подготовлено для немедленного и нагревают при комнатной температуре перед инъекцией. Анестезия длится по меньшей мере 20 мин. Степень анестезии следует контролировать по всей операции. Анестезия может быть продлен внутрибрюшинной инъекции дозы половине каждого 20 мин.
  2. Наведите на правой стороне, под горизонтальной капотом пластинка потока. Стерилизовать хирургическое поле с 70% этанола и 10% йодида дермы решения. С щипцов части волос мыши по длине 2 см чуть выше сустава задней ноги. Бритье хирургическую область.
  3. С помощью скальпеля, сделать надрез на 1,5 см длины первого, кожной ткани, а затем с ножницами вырезать мышечную ткань. Нанесите небольшое давление к обеим сторонам разреза, Который заставит почку из брюшной полости.
  4. Применить раствор ватным почкой, чтобы сохранить почку влажной. Если у вас есть трудности в разоблачении орган, использовать плоские щипцы, чтобы вытащить окружающей адипоцитов ткани, к которой прикреплен почек. Поддержание почку из забрюшинного полости с помощью ватного тампона помещен под орган.
  5. С двумя тонких щипцов, сделать 2-3 мм отверстие в капсуле (не касаясь паренхимы, чтобы предотвратить кровотечение). В течение всего хирургического вмешательства держать открытую капсулу почки постоянно увлажняется.
  6. Вставка тщательно лепестки под почечную капсулу, при поддержании стенки капсулы открыт, и скользить трансплантата под капсулой к краю полюса. Поместите до 6 лепестков на почки.
  7. Замените почку в ретро-перитонеального полости. Шовный мышечные апоневрозов, то кожу с отдельными хирург узлов. Намочите рану 10% йодида раствор повидон. Наведите на нагретой годовыхд при 37 ° С.
  8. Рассмотрите не пересаженных мышь до полного выхода из наркоза по контролю сердечных, респираторных и усов движений, слизистой цветов до полного восстановления видел себя не содержащихся движения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем инъекцию обезболивающего раствора (Buprenorphin, 0,1 мг / кг) внутри мышц сразу после операции и 2 дня после операции, чтобы предотвратить послеоперационной боли.
  9. Держите управляется животное в изоляции до полного восстановления. Осмотрите каждый день стежки раны, чтобы проверить и предотвратить инфекцию. Никогда не наблюдается раневой инфекции после использования этой процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Еженедельный анализ клеток периферической крови от CD3 - / - мышей, привитые позволит нам обнаружить тимуса, полученные популяции возник либо из E13 или E18 предшественников, используя CD45 allotypic маркер и Т-клеток происхождение специфических антител (рисунок 3).

9. Анализ потомства TSP с помощью проточной цитометрии

    дразнить FTOCs индивидуально для получения суспензии отдельных клеток (см раздел протокола 4).
  1. Пятно клеточные суспензии из отдельных лепестков с смесь антител, содержащие антитела, распознающие CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4, CD8 APCCy7 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 и инкубировать, как описано в разделе 5.
  2. Повторное приостановить клеток в HBSS + 1% FCS + пропидий йодида и анализировать в проточном цитометре (см результаты на фиг.2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того чтобы выбрать способ истощить тимуса долей эндогенных тимоцитов, позволяющих лучшее развитие колонизации предшественников, мы сравнили уровни Т-клеток восстановления в тимуса долях колонизированных после облучения или 5-дневный дезокси-гуанозин (D-Гуа) лечения. Результаты показывают, что в то время как нет никакой разницы на 9-й день культуры, облученные лопасти содержали больше Т-клеток, чем у пациентов, получавших д-Gua, в день 12. Таким образом, облучение является более подходящим, чем д-Gua лечения, чтобы п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Две основные анализы могут быть использованы для анализа Т-клеток дифференциации экс виво. Недавно сообщил в совместное культивирование гемопоэтических клеток-предшественников с стромальных клеток, OP9, выражая лиганды Noth1, дельта, как 1 или 4 12. Этот 2-D анализа легко выполнить, высокоэффективным и чувствительной, что позволяет анализа на один уровень клеток. Тем не менее, ни поддерживает развитие Т-клеток за пределами стадии DP, ни генерации γδ DETC 13, оба из которых требуют непосред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддерживается в Институте Пастера, INSERM, Национальное агентство по исследованиям ANR (Гранта "лимфопоэза"), возродить инвестиционной программы будущего и "La Ligue CONTRE ле рака".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашки Петри для культуры пластиковой ткани 90 x 15 мм и 35 x 15 мм.ТТПТ93100/Т9340отбор проб
26 г ⅜ Шприцы 0,45 х 10 мм с игламиBD Plastipak300015Cell суспензия
Нейлоновая сетка салфетка для болтов стерилизована 50/50 мм штук.СЕФАР НИТЕКС03-100/32Фильтрация ячеек
Этанол 70%.VWR83801.36Стерильное действие
Йодид Повидон 10% (Бетадин)MEDA Pharma314997.8Стерильное действие
Кетамин 100 мг/мл (стоковый раствор)MERIALАнестетик
Ксилазин 100 мг/мл в PBS (стоковый раствор)SigmaX1251-1GОбезболивающее и миорелаксант
Бупренорфин 0,3 мг/мл стоковый растворAXIENCEМорфиновый анальгетик
Офтальмологический гель (0,2% циклоспорина)Schering-Plough Animal HealthEye Protect
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)GIBCO Life Technology14040-174для выделения эмбрионов
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)GIBCO Life Technology24020-091для вымывания крови и препарировать эмбрионы
OPTI-MEM I GlutaMAX IGIBCO Life Technology51985-026Среда для культур
Фетальная сыворотка теленкаEUROBIOCVFSVF00-0Uдобавка для культур
Пеницилин и стрептомицинGIBCO Life Technology15640-055Антибиотики для культур
2-МеркаптоэтанолGIBCO Life Technology31350010добавка для культур
LEICA MZ6 Диссекционный микроскопLEICAMZ6 10445111Окуляр W-Pl10x/23
Источник холодной лампыSCHOTT VWRKL1500 компактныйДва волокна гусиной шеи адаптированный
Силиконовый эластомерWorld Precision InstrumentsSYLG184Препарирующая подушечка
Ложка, круглая и перфорированнаяFine Science Tools10370-18Инструменты для препарирования
Fine Ножницы для радужной оболочкиглаза Fine Science Tools14090-09Инструменты для препарирования
Vannas пружинные ножницыFine Science Tools15018-10Инструменты для пресечения
Щипцы: Dumont #5/45 Inox 11 cmF.S.T.11253-25Инструменты для препарирования
, 2 пары тонких прямых часовых щипцов Dumont #5, 11 см, тонкие наконечники.Инструменты для диссекции11295-20Инструменты для препарирования
Полиамидная нить с иглой 6-0 C-3 3/8cETHICONF2403для швов
ИглодержательMORIA/F.S.T.12060-02для швов
ГрелкаVWR100229-100Для поддержания температуры мыши во время анестезии
Мембрана Изопор RTTPO2500DUTSCHER44210Для FTOC
Terasaki 60 лунок пластиныFISHER1x270 10318801Для техники подвешивания капель
Марлевые тампоны стерильные 7,5 х 7,5 смHydrex11522Для нанесения дезинфицирующего раствора
Флуоресцентные или меченые биотином антителаBD Biosciences, Biolegend или e-Biocsiences Число клонов см. таблицу ниже: Окрашивание клеток
MACS Колонки/Стрептавидин МикрогранулыMiltenyi Biotec130-042-401/130-048-101Мыши, истощение клеток
Charles Rivers Laboratories (CD45.1) и Janvier Labs  (КД45.2)C57BL/6 CD45.1 ИЛИ CD45.2Источник клеток и долей тимуса
МышиCDTA Orlé Энс,Франция CD 3 epsilon Ko CD45.2Эксперимент по прививке
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  3. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  4. Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
  5. Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
  6. Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
  7. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  8. Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
  9. Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
  10. Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
  11. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
  12. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  13. Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
  14. Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
  15. Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD45E13 E18

Похожие статьи