Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек

Поколение иммунологической памяти в отсутствии заболевания физиологическая основа эффективного вакцинации ^1. Недавно системной биологии подходы показали, что успешные вакцины, такие как вакцины против желтой лихорадки, индуцируют сильную индукцию врожденных иммунных реакций и активации нескольких подмножеств дендритных клеток (ДК), который, в свою очередь, приводит к активации мультилинейной антиген специфическими Т-клетками ^2,3. Так ДК являются только иммунная клетка населения с возможностью активировать антиген-специфичные наивные Т-клетки ^4, изучение их функции во время вакцинации важно понять иммунные ответы на вакцины и разрабатывать будущие стратегии в отношении сложных патогенов.

Система позволяет трассировку различных подмножеств ДК во время иммунных реакций на вакцины хочется, чтобы установить точные кинетики миграции DC в лимфоидных тканях, и, следовательно, для обеспеченияпонимание физиологических механизмов, ответственных за инициацию вакцины конкретных адаптивного иммунитета. Обратной генетики подходы предлагают возможность генерировать изменены, живые ослабленные вакцины-которые могут быть использованы экспериментально с этой целью. С момента своего внедрения на исследования гриппа, плазмиды на основе обратной генетики была широко используется для создания рекомбинантных штаммов гриппа, включая LAIVs. Стандартные протоколы, чтобы спасти рекомбинантные вирусы гриппа требуют мульти-трансфекции высоко transfectable клеточных линий ambisense плазмид (производящих как положительный и отрицательный смысл РНК), содержащих восемь вируса гриппа сегменты, а также усиления в разрешительной системе, таких как Madin-Darby почки собаки ( MDCK клетки) и / или куриные яйца куриного эмбриона ^5. Тем не менее, применение обратной генетики для получения молекулярных инструментов для изучения иммунных механизмов вакцинации остается неисследованной.

Поколениеновых моделей, позволяющих мыши определенный истощение иммунной подмножеств клеток, в том числе ДК, открыла новые возможности для понимания основных иммунных механизмов, лежащих защиту вакциной вызвало. Сравнение функций постоянного тока подмножества у мышей и человека показали, что, в значительной степени, мышь и человека ДК функционально гомологичны ^6,7, эти данные, убедительно свидетельствуют, что разработка моделей мыши позволяет конкретный истощение домена в стационарном состоянии и при воспалительных условиях, может служить, чтобы понять физиологию ответов постоянного тока в организме человека. В последние годы ряд моделей мыши были получены проведения трансгены, выражающие обезьян дифтерийный токсин (ДТ) рецептор (DTR) под контролем промоторной области гена процентной ^8,9. Так тканей мыши, естественно, не выразить DTR, эти модели позволяют условный истощение клеток подмножеств несущих целевой ген интереса при мыши прививки с DT. Таким образом, наша Abiliти истощать конкретные контроллеры домена и другие лейкоциты в естественных условиях в течение физиологических процессов, была значительно улучшена по развитию DTR-ро основе. Однако, хотя эти трансгенные мышиные модели широко используются для понимания онтогенеза иммунной системы, их применение в разработке вакцин была едва испытания. Здесь, сочетая гриппа обратной генетики и конкурентные химеры костного мозга DTR-основанные, мы предлагаем метод изучения кинетики иммунитета вакцин, а также отдельной функции гена во иммунных реакций на вакцины в естественных условиях. Применение этой технологии для доклинических оценки новых вакцин против инфекционных заболеваний сложных могло бы способствовать рационализации дизайн вакцин и проверить кандидатов вакцины в естественных условиях.

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденными протоколами и в соответствии с инструкциями закона защиты животных Германии. Все сотрудники, осуществляющие эксперименты на животных прошли учебные программы в соответствии с категории B или C Федерации европейских лабораторных животных науки ассоциаций.

1. Генерация рекомбинантного живых ослабленных вакцин гриппа с помощью обратной генетики

Примечание: Подробный протокол для генерации рекомбинантных вирусов гриппа по обратной генетики был описан в предыдущих исследованиях ⁵ и выходит за рамки настоящего отчета. Вкратце, спасение вакцин холодоадаптированных гриппа (CAV) делается в области биобезопасности класс II шкафу под уровнем биологической безопасности 2 (BSL2) сдерживания, и включает в себя шаги, описанные ниже. Протокол трансфекции и инфекции следует, что из Мартинес-Sobrido др. ^5.

1. Создание реассортивных холодоадаптированных гриппаВакцина с использованием в качестве фона холодной деформации адаптированы A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), а также гемагглютинина (HA) и модифицированный нейраминидазы (NA) из A / PR / 8/34 (H1N1) штамма ( 1А). Модификации в гене NA состоит из ПЦР-замены консервативной последовательности в белковой стебля (остатки от 65 до 72) по короткой последовательности кДНК, кодирующей куриный овальбумин (OVA) -derived пептид SIINFEKL (Фигура 1В). SIINFEKL пептид является высокоэффективным иммунодоминантным пептида в контексте Н-2b МНС класса I-ограниченной реакцию мышей C57BL / 6 ^12.
2. Пластина 10 ⁶ 293T клеток на лунку в 6-луночных планшетах с использованием DMEM 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с добавкой 1% пенициллина / стрептомицина (P / E).
3. Подготовка плазмиды трансфекции смесь: Добавить 1 мкг каждого из плазмид, кодирующих кДНК для РВ2, PB1, PA, NP, M, NS от гриппа A / Энн Арбор / 6/60 штамма и 1 мкг плазмиды, кодирующие НС -SIINFEKL иHA от гриппа A / PR / 8/34. Добавить предварительно нагревают OptiMEM (15 мкл до конечного объема 100 мкл / лунку).
4. Инкубируйте трансфекции смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Добавить 100 мкл трансфекции смеси / лунку и инкубировать в течение 16 часов при 37 ° С и 5% СО _2.
6. Изменить клеток средств массовой информации путем DMEM 0,3% БСА 1% P / E на 33 ° С и 5% CO ₂ в течение 5 часов.
7. Добавить 10 ⁶ гриппа разрешающие MDCK клетки в ДМСО, содержащего 1 мкг / мл трипсина из поджелудочной железы быка, обработанной L-1-Tosylamide-2-фенилэтил хлорметил кетона (ТРСК-трипсином). Поддержание 293Т-MDCK совместное культивирование в течение 2 - 3 дней при температуре 33 ° С и 5% СО _2.
8. Собирают супернатанты MDCK-293T клеток совместных культурах и понятно центрифугированием при 260 х г в течение 5 мин.
9. Привить 9 - 10-дневные куриные яйца с эмбрионами в стерильных условиях. Чтобы сделать это, сделать отверстие в верхней части скорлупы, как указано Мартинес-Sobrido др. ^5.
10. Накройте скорлупы остроумиеч расплавленный воск с помощью ватного тампона и инкубировать привитых куриных яиц в течение 3 дней при 33 ° С.
11. Урожай аллантоисной жидкость из инфицированных яиц с эмбрионами: Вымойте яичной скорлупы с 70% этанола. Откройте яйцо с очень мягко взломать в верхней части и удалить мембрану аллантоисной помощью стерильного пинцета. Использование 10 мл пипетки, чтобы собрать как можно больше жидкости, насколько это возможно (как правило, 6 - 10 мл). Центрифуга при 260 х г в течение 10 мин при 4 ° С и передачи очищенную аллантоисной жидкости в новые пробирки.

2. Отслеживание вакцин специфический иммунитет

1. Трассировка пептидных несущих дендритных клеток (ДК)
   1. Для вакцинации мыши, обезболить мышей с 5% изофлуран в кислороде, используя точность испаритель. Использование 200 мкл пипетки для введения 50 мкл PBS, содержащие 10 ³ бляшкообразующих единиц (БОЕ) вакцины экспрессии пептида SIINFEKL воздушно-капельным путем непосредственно в ноздри мыши.
   2. Три дня после вакцинации, euthanizе мышей через изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков.
   3. Подтяжка кожи мыши на средней линии чуть ниже грудной клетки с щипцами и вырезать небольшой разрез через кожу с помощью ножниц. С точки разреза, сделать 3 - 5 см в длину прорезать кожу к обоим головы и хвоста, а затем два 2 см надрезы от средней линии в поперечном направлении от каждого конца. Отогните кожи, чтобы выявить перитонеальные и грудной полостей. Аккуратно вырежьте через мембраны, окружающие брюшины подвергать грудную клетку.
   4. Чтобы получить доступ к средостения сократить diafragma и дно клетки ребра. Найти и удалить 2 лимфоузлов средостения (mLNs), слегка спинной и сбоку рядом с тимуса, медиально, прилегающих к брахиоцефальных артерий, недалеко от брюшной стороне трахеи.
   5. Для сбора mLNs использовать изогнутые щипцы. Поместите щипцы под лимфатических узлов и тянуть их нежно. Поместите лимфатические узлы в 6-луночный планшет, содержащий 1 мл DMEM и удалить любые connectiве или жировой ткани окружающие узел.
      1. Дразнить каждый образец тщательно с двумя иглами 26 G, прикрепленных к 1 мл шприцев. Для дразнить лимфатический узел, удерживайте ее с одной иглой, а разламывают лимфатического узла с другой иглой. Когда это будет сделано правильно, концентрированные клетки разрывные из лимфатического узла легко наблюдаются в средствах массовой информации. Пройти все ткани материала через нейлоновый фильтр 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток.
   6. Центрифуга суспензии отдельных клеток в течение 10 мин при 260 х г в охлаждаемой центрифуге. Ресуспендируют осадок клеток в 2 мл эритроцитов лизирующего (RbCl) буфера для лизиса красных кровяных клеток. Разрешить лизиса проводили в течение 3 мин при комнатной температуре.
   7. Нейтрализовать RbCl буфер с помощью центрифугирования и ресуспендирования клеток в 2 мл ледяной PBS.
   8. Пластина клеток в U-образный 96-луночные планшеты при концентрации 10 ⁷ клеток / мл в конечном объеме 100 мкл.
   9. Для проточной цитометрии анализа, блок клеток Fc-рецепторов с помощью1 мкг анти-CD16 мыши / CD32 антител на 10 ⁶ клеток в течение 15 мин на льду.
   10. Центрифуга пластины и выбросить супернатантами от пластины стряхивая. Выдержите отдельных скважин с поверхности комбинации антител выбора. Обычно для обнаружения дендритных клеток в лимфатических узлах, смесь антител должна включать: 0,25 мкг анти-CD11c, 0,25 мкг CD11b, 0,5 мкг МНС класса II, 0,25 мкг CD103 и 0,15 мкг CD8α в конечном объеме 100 мкл.
   11. При отрицательных стробирования, добавить 0,25 мкг анти-CD3, CD19, NK1.1 или линия коктейль (фиг.2А). Альтернативные стратегии стробирования, а также протоколы для надлежащей компенсации нескольких люминесцентных красителей можно найти на веб-сайте проекта генома иммунологии. В дополнение к поверхностных маркеров выбора, добавления 1 мкг антитела против H-2K ^б связанного с SIINFEKL в коктейль. Это коммерчески доступны антитела позволит визуализировать домена яп, пептид SIINFEKL связан с поверхности МНС класса I.
   12. Инкубируйте клетки с поверхности антител в течение 30 мин на льду. Защита пластины от света. Центрифуга пластины при 260 мкг в течение 5 мин и мыть с 2 мл PBS, в два раза. Передача клеток методом проточной цитометрии трубки для анализа.
2. Оценка вакцины конкретной пролиферацию Т-клеток
   1. Получение Т-клеток донора из коммерчески доступного TCR-трансгенных мышей (мышей ОТ-I) (C57BL / 6-TG (TCR aTcrb) 1100Mjb / J), в котором все генерируемые CD8 Т-клетки являются специфическими для пептида SIINFEKL. Эвтаназии мышей с изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков. Урожай селезенки, выполняя разрез в брюшной полости. Поместите селезенки / с в 2 мл DMEM / селезенки и удалить соединительную и жировую ткань.
   2. Создание одноклеточных суспензий из селезенки по методике, описанной в 2.1.2 и 2.1.3.
   3. Для дальнейшего обогащения суспензии отдельных клеток на Т-клеток, применяются протоколы магнитного бисера разделенияиспользуя положительные или отрицательные процедуры отбора ^12. Чтобы дифференцировать донора от клеток-реципиентов, используйте конгенных мышей так, что, например мышей получателей выразить лейкоцитов маркера CD45.1 а донор Т-клетки выразить CD45.2 ^12.
   4. Для обозначения Т-клеток, инкубируют их в 1 мл PBS, содержащим 5 мкМ карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) в оптимальной плотности клеток 5 × 10 ⁶ клеток / мл. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 37 ° С в защищенном от света воздействия. После инкубации, центрифуги клетки при 260 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант, и ресуспендируют клеток в 3 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы нейтрализовать CFSE.
   5. Центрифуга клетки при 260 мкг в течение 10 мин и ресуспендируют в адекватном объеме PBS так, чтобы 100 мкл раствора содержит 2 × 10 ⁶ клеток. Настаивать получателей конгенных мышей с 2 х 10 ⁶ клеток / мышь через ретро-орбитальное синусового инъекции ^13.
   6. Эвтаназии мышей-реципиентов в дни 3, 4 и 5 пост-вакцинации с использованием изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков. Заготавливают лимфоузлов средостения и подготовить отдельные клеточные суспензии для проточной цитометрии, как указано в 2.1.2-2.1.5.
   7. Определить донорских клеток путем окрашивания одноклеточных суспензий в 100 мкл коктейля антител, содержащей: 0,25 мкг против мышиного CD3, CD4 и CD8 антител; 0,5 мкг антитела против мышиного CD45.1 или CD45.2 антител (в зависимости от фенотипа клеток донора). Оставьте FL-1 канал цитометра открытой (FITC) для определения профиля разбавления CFSE ¹² (рис 2B).

3. химерных мышей, чтобы рассекать ответов генной вакциной конкретных

ПРИМЕЧАНИЕ: поколение конкурентоспособных химер костного мозга с использованием мышиных моделей DTR-основанные позволяет дискриминацию клеточных функций конкретных во иммунного ответа на вакцины. Здесь мы показываем дополнительную стратегию, с помощью которых сочетание DTR-выражающее доноров Cлоктей с клетками из плей-разрешений мышей для изучения генов специфические функции во время иммунитета в конкретных клеточных отсеках. В примере мы создаем мышей с определенной удаление Толл-подобные рецепторы 3 (TLR3) в лангерин ⁺ CD103 ⁺ DC.

1. Приготовление донорских клеток костного мозга
   1. Работа в шкафу II уровня биобезопасности. Избегайте загрязнения с помощью исключительно автоклавного инструментов.
   2. Для создания костного мозга мышей химерные, используйте конгенных CD45.1 ⁺ C57BL / 6 самок мышей в качестве получателей, и использовать TLR3 ^{- / -,} лангерин-DTR / EGFP или мышей дикого выражающее CD45.2 ⁺ как доноров. Использование конгенных донора и реципиента мышей позволяет дифференцировать доноров и реципиентов клеток через проточной цитометрии, и это позволяет приживления быть оценены.
   3. Для получения донорских клеток костного мозга, эвтаназии мышей-доноров с изофлуран анестезии с последующим смещением шейных позвонков. С острыми ножницами выполнить разрезы вокруг лодыжек, так что мУз мускулатура подвергается.
   4. Использование тупые щипцы тянуть кожу мыши и меха мягко от лодыжки к бедрам, так что мышцы ног видны.
   5. С острыми ножницами вырезать ноги мыши на высоте бедер и выше головки бедренной кости.
   6. Поместите ноги на чашку Петри и на льду. Делайте это быстро, и удалить все мышцы, чтобы разоблачить кости.
   7. Отдельные бедра и голени. Поместите кости в растворе 70% этанола в течение 5 мин, чтобы удалить возможные бактерии и поместить их сразу же на другом чашку Петри, содержащую 5 мл бессывороточной DMEM. Вырезать кости заканчивается с помощью острых ножниц и промойте костного мозга в DMEM. Чтобы сделать это, флеш 1 мл DMEM в кости, вставив 26 G иглой 5 мл шприц. Убедитесь, что кости выглядит белым (пусто) после промывки.
   8. Соберите все клетки костного мозга мышей, доноров в 10 мл DMEM. Генерация одноклеточных суспензий из клеток костного мозга при прохождении урожай через сито 70 мкм клетки.
   9. Clуха одноклеточных суспензий клеток костного мозга путем центрифугирования при 260 мкг в течение 10 мин при 4 ° С в центрифуге с охлаждением. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл PBS. Разрушающим красные кровяные клетки, используя решение RbCl, как описано в 2.1.3 и 2.1.4.
   10. Количество клеток костного мозга с использованием либо гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Оценка жизнеспособности клеток путем определения мертвых клеток с помощью окрашивания трипановым синим ^13. Оптимально, одна урожайность животных около 3 х 10 ⁷ лейкоциты / мышь с жизнеспособности, по меньшей мере 80%.
   11. В случае общего химер костного мозга, подготовить TLR-3 ^{- / -} или донорских клеток мас. Оптимальная концентрация клеток в 2 х 10 ⁷ клеток / мл, так как 2 × 10 ⁶ клеток в 100 мкл PBS будет использоваться для трансплантации. Если не используют сразу, сохранить донорских клеток при -80 ° С, используя медленные методы замораживания и FBS с 10% ДМСО. Для смешанной модели химерного, смешать лангерин-DTR-доноров клеток и TLR3 ^{- / -}
2. Облучение мыши и трансплантации
   1. Облучают самок мышей между 6 - 8 недель возраста в Цезий-137 источника облучателя. Дайте мышам две дозы 550 рад 4 ч друг от друга. Разделение облучение сводит к минимуму острой печеночной токсичности и, следовательно, уменьшает мыши летальность вследствие протокола облучения.
   2. После облучения, держать мышей в лечении антибиотиками в течение двух недель. Дайте антибиотики с питьевой водой на 2,5 - 5 мг / кг Baytril.
   3. 2 - 4 ч после второго облучения, пересадка клеток мышей с донором костного мозга внутривенно. Выполнение инъекции донорских клеток с помощью ретро-орбитального синуса инъекции ¹³ и под наркозом изофлуран использованием максимального объема 100 мкл PBS, содержащим 2 × 10 ⁶ клеток.
   4. Через четыре недели после трансплантации, оценивать приживление в образце 100мкл периферической крови с помощью проточной цитометрии с использованием машины умеют читать по крайней мере, два цвета. Чтобы отличить между донором и радио-устойчивых клеток-реципиентов, использовать имеющиеся в продаже флуоресцентно меченного CD45.1 и CD45.2 антитела анти-мыши, используя разведения между 1/100 и 1/200. Оптимальное приживление донорских клеток должна быть не менее 80% от общего количества кроветворных клеток в периферической крови.
3. Истощение Вакцинация и целевых
   1. Вакцинацию мышей с рекомбинантной вакцины живых ослабленных гриппа с помощью интраназального. Для вакцинации мыши, обезболить мышей с 5% изофлуран в кислороде, используя точность испаритель. Использование 200 мкл пипетки для введения 50 мкл PBS, содержащие 10 ³ бляшкообразующих единиц (БОЕ) вакцины.
   2. Для создания окончательной модели мыши, лечения мышей с 50 нг DT разбавленного в 50 мкл PBS интраназально. Администрирование DT по капле непосредственно к ноздри наркозом мышей, как описано в 3.3.1. Лечить мильсе с ежедневными дозами не начиная лечение в день -2 до вакцинации до 2 день после вакцинации (рис 3B).

Генерация рекомбинантных живых ослабленных вакцин может быть достигнуто путем трансфекции плазмидами, кодирующими восемь сегментов вируса гриппа под контролем промоторов двунаправленных 5. Вакцина адаптированных к холоду гриппа обычно содержит шесть сегменты холодоадаптированных деформации, а также ГА и НС штамма гриппа выбора (например, H1N1) (рис 1А). Принцип холодной адаптации на основе вируса с ограниченным репликации при 33 ° C, температура верхнего респираторного тракта (УРТ) у мышей и человека 14. Таким образом, вакцина может повторить в какой-то степени в УРТ, но не может вызвать пневмонию нижних дыхательных путей. Использование технологии сварки ПЦР, консервативную область в стволе вирусной нейраминидазы (NA) был заменен на отслеживаемой OVA-пептид (SIINFEKL) (Фигура 1В).

Чтобы отслеживать ответы вакцины конкретных исследований в области кинетики мы имеем приняты преимущество отслеживаемых пептидов, полученных из композиции вакцины, а также химерных мышах. Между 3-й день и 6 после вакцинации, SIINFEKL несущих CD103 + ДК могут быть обнаружены в легких слива лимфатических узлов 12 (фиг.2А). Многопараметрическая цитометрии потока позволяет количественно вакцинного происхождения презентации антигена в режиме реального времени. Кроме того, настой SIINFEKL-специфических Т-клеток позволяет количественно определить вакцин-специфических CD8 Т-клеточные ответы (фиг.2В).

Для оценки функции геноспецифических при вакцинации мы разработали модель мыши, сочетающий технологии DTR и конкурентные химеры костного мозга (рис 3а). Поступая таким образом, утрата функции гена, была предназначена для конкретных клеточных компартментах в течение иммунных реакций на вакцинацию (фиг.3В, С).

52803 / 52803fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Проектирование отслеживаемых LAIVs. () Сегменты гриппа клонированные в ambisense плазмид (PDz основой, как описано Мартинес-Sobrido др. 5) трансфицировали в клетки 293Т, используя Lipofectamine 2000 24 ч после трансфекции супернатанты, полученные из клеток 293Т были использованы для покрытия гриппа разрешающие Madin-Darby почки собаки (MDCK) клетках в присутствии 1% ТРСК трипсином. Все протокол проводили при 33 ° С. Вирусные супернатанты из MDCK клетки затем высевали в 9-дневных оплодотворенных куриных яиц в течение трех дней при температуре 33 ° С. Вирусный спасение было подтверждено с помощью ПЦР-амплификации на основе вирусного генома и последовательности. (B) Чтобы вставить OVA-пептид получена SIINFEKL в нейраминидазы гриппа (NA), консервативная область (остатки от 65 до 72) гена Н. А / Пуэрто Rico / 8/34 (H1N1) был заменен на короткое кДНК, кодирующей пептид SIINFEKL через слиянияПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Вакцина отслеживания методов. () Миграционная ДК воротами в лимфатические узлы средостения (mLNs) как CD11c мед МНС класса II привет клеток. В примере, антиген-несущих миграционную CD103 + DC, были определены как Н-2 B -SIINFEKL + клеток CD103 + с помощью проточной цитометрии. (B) ОТ-I-специфические Т-клетки вводили мышам в тот же день вакцинации. Четыре дня спустя клетки были собраны из лимфатических узлов мышей, вакцинированных и оценивали их профиль распространения. Разбавление CFSE на FL-1 канала была использована в качестве индикатора клеточного деления. CAV: холодоадаптированных вакцина; CAV SIINFEKL :. Выразив ОВА-производный SIINFEKL пептид холодоадаптированных вакцина Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. функция Джин исследования. () Схематическое химер костного мозга (BMC) и стратегий вакцинации. (-2 До +2 см с введением DT два дня до или после вакцинации). (Б) Добавление DT в химерных мышей, экспрессирующих лангерин-DTR позволяет конкретный истощение миграционная лангерин + ДК совместной экспрессии CD103 в легких. (С) Сравнительный Анализ вакцины Т-клеток в химерных мышей. Обнаружение НП 366-374 Определённые CD8 Т-клеток было сделано с помощью окрашивания коммерческой dextramer.803fig3large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.