Существует общий недостаток знаний о том, как работают вакцины. В данной работе мы предлагаем комбинированное использование обратной генетики и мышей с химерными костным мозгом, чтобы получить представление о ранних иммунных реакциях хозяина на вакцины, уделяя особое внимание дендритным клеткам и Т-клеточному иммунитету.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вакцины являются одним из величайших достижений человечества и спасли миллионы жизней за последнее столетие. Парадоксально, но мало что известно о физиологических механизмах, которые опосредуют иммунные реакции на вакцины, возможно, из-за общего успеха вакцинации, которая снизила интерес к молекулярным и физиологическим механизмам вакцинного иммунитета. Тем не менее, некоторые важные патогены человека, включая вирус гриппа, по-прежнему представляют проблему для вакцинации и могут выиграть от иммунных стратегий.
Несмотря на то, что обратная генетика гриппа была успешно применена для создания живых аттенуированных вакцин против гриппа (LAIV), добавление молекулярных инструментов в вакцинные препараты, таких как индикаторные компоненты, для отслеживания кинетики вакцинации in vivo, не рассматривалось. Кроме того, недавнее поколение мышиных моделей, которые допускают специфическое истощение лейкоцитов во время кинетических исследований, открыло окно возможностей для понимания основных иммунных механизмов, лежащих в основе защиты, вызванной вакциной. В этой статье мы описываем, как комбинация обратной генетики и химерных мышиных моделей может помочь получить новое понимание того, как вакцины работают на физиологическом и молекулярном уровнях, используя в качестве примера рекомбинантную, адаптированную к холоду, живую аттенуированную вакцину против гриппа (LAIV). Мы использовали созданные в лаборатории LAIV, содержащие клеточные индикаторы, а также конкурентные химеры костного мозга (BMC) для определения ранней кинетики вакцинного иммунитета и основных физиологических механизмов, ответственных за инициацию вакциноспецифического адаптивного иммунитета. Кроме того, мы показываем, как этот метод может облегчить изучение функции генов у отдельных животных во время иммунного ответа на вакцины. Мы предполагаем, что этот метод может быть применен для улучшения существующих стратегий профилактики против патогенов, в отношении которых необходимы срочные медицинские контрмеры, например, гриппа, ВИЧ, плазмодия и вирусов геморрагической лихорадки, таких как вирус Эбола.
Введение
Поколение иммунологической памяти в отсутствии заболевания физиологическая основа эффективного вакцинации 1. Недавно системной биологии подходы показали, что успешные вакцины, такие как вакцины против желтой лихорадки, индуцируют сильную индукцию врожденных иммунных реакций и активации нескольких подмножеств дендритных клеток (ДК), который, в свою очередь, приводит к активации мультилинейной антиген специфическими Т-клетками 2,3. Так ДК являются только иммунная клетка населения с возможностью активировать антиген-специфичные наивные Т-клетки 4, изучение их функции во время вакцинации важно понять иммунные ответы на вакцины и разрабаты....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденными протоколами и в соответствии с инструкциями закона защиты животных Германии. Все сотрудники, осуществляющие эксперименты на животных прошли учебные программы в соответствии с категории B или C Федерации европейских лабораторных животных науки ассоциаций.
1. Генерация рекомбинантного живых ослабленных вакцин гриппа с помощью обратной генетики
Примечание: Подробный протокол для генерации рекомбинантных вирусов гриппа по обратной генетики был описан в предыдущих исследованиях 5 и выходит за рамки настоящего отчета. Вкратце, спасение в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Генерация рекомбинантных живых ослабленных вакцин может быть достигнуто путем трансфекции плазмидами, кодирующими восемь сегментов вируса гриппа под контролем промоторов двунаправленных 5. Вакцина адаптированных к холоду гриппа обычно содержит шесть сегменты холодоадаптированных деформации, а также ГА и НС штамма гриппа выбора (например, H1N1) (рис 1А). Принцип холодной адаптации на основе вируса с ограниченным репликации при 33 ° C, температура верхнего респираторного тракта (УРТ) у.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании мы рассмотрим, как генетика и химерные мышиные модели могут быть использованы для выяснения физиологических и молекулярных механизмов иммунитета, вызванного вакциной. Грипп обратной генетики устанавливается во многих лабораториях и сыграл главную роль в понимании патогенеза гриппа, репликацию и передачу 17. Ключевым моментом в нашем протоколе является спасение вакцин холодоадаптированных гриппа, выражающих иностранных эпитопы. В то время как стратегия внедрения короткие кДНК в стебле нейра.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Серхио Гомес-Медину за отличную техническую поддержку в экспериментах на мышах. Эта работа была поддержана при финансовой поддержке Ассоциации Лейбница и Центра инфекций имени Лейбница. А.Л. является получателем преддокторской стипендии Высшей школы Лейбница.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dulbecco´ s Модифицированная Eagle Medium (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Липофектамин 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл) | PAA | p11-010 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Эмбриональные яйца | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μ M Нейлоновые фильтры | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Буфер для лизинга эритроцитов (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Мышиный BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)eBioscience | 48-5321-82 | ||
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Антимышиный CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Антимышиный CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)eBioscience | 48-0041-80 | ||
| CFSE Пролиферативный краситель | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Байтрил 2,5% | Байер | 65-0850-85 | |
| Диметил-сульфоксид (ДМСО) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Овальбумин | Молекулярные зонды | O23020 | |
| Дифтерийный токсин (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Трипсин-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Проточный цитометр | BD Biosciences | ||
| FlowJo программное обеспечение для анализа клеток 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Трипановая синяя морилка (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Автоматический счетчик клеток Countess | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Ссылки
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
